一种简单经济的小鼠骨髓源性肥大细胞的培养与鉴定

目的:通过一种简单经济的方法在体外获得大量高纯度的肥大细胞。方法:将小鼠骨髓细胞直接冲出加入到含有IL-3和SCF的培养基中培养,每周换一次液,四到六周后收集培养细胞,通过光镜和电镜下观察肥大细胞的表面和内膜结构特征,流式细胞术检测表面CD117和FITC-FCεRⅠα的表达情况,利用甲苯胺蓝检测其功能。结果:四周后收集培养的细胞,其大小均一,内部结构符合肥大细胞的特征,电镜下可见肥大细胞内部含有丰富的高电子密度的颗粒,其中有些可见脱颗粒的空泡。流式检测显示CD117和FITC-FCεRⅠα单阳性的表达率都在90%以上,双阳性的表达率也在80%以上。甲苯胺蓝染色发现收集的肥大细胞核被染成深蓝色,胞质染成淡紫色。通过这种方式我们获得了大量的肥大细胞,其成熟时间较短,所需培养基和相关细胞因子量较少,而且寿命较长,纯度较高。结论:在IL-3和SCF的刺激下可以诱导骨髓干细胞向肥大细胞定向分化,通过这种方式可以快速经济的获得大量高纯度的肥大细胞,用于体外更好的研究其在移植免疫领域的作用。     

资木瓜总苷抑制体外培养的原代小鼠骨髓源性肥大细胞脱颗粒

目的研究资木瓜总苷对小鼠骨髓来源的肥大细胞(BMMC)脱颗粒影响。方法从C57BL/6小鼠股骨获得骨髓细胞,用含100 m L/L胎牛血清、20 ng/m L IL-3和40 ng/m L干细胞因子(SCF)的RPMI1640培养基,培养4周;流式细胞术检测CD117、FcεRIα双阳性细胞的比例,甲苯胺蓝染色法观察细胞的成熟度。资木瓜总苷与诱导成功的BMMC共培养,CCK-8法检测资木瓜总苷对BMMC的毒性作用,荧光分光光度法定量检测β-己糖胺酶释放量,并计算其释放率,ELISA检测类胰蛋白酶释放量。结果原代培养诱导4周后,CD117和FcεRIα双阳性细胞比例大于95%,且核被染蓝色,胞质为紫红色,呈现肥大细胞特性。(0.01、0.03、0.10)mg/m L的资木瓜总苷作用12 h,对BMMC无毒性作用。与空白对照组相比,资木瓜总苷与交联牛血清白蛋白的二硝基苯半抗原(DNP-BSA)、A23187刺激的BMMC作用后,细胞的β-己糖胺酶释放率和类胰蛋白酶的释放量均显著降低。结论资木瓜总苷对不同抗原刺激原代培养的小鼠BMMC脱颗粒具有显著抑制作用,且存在量效关系。     

一种简单的肥大细胞分离方法

大鼠腹腔肥大细胞,是供过敏反应的体外试验、研究药物抗原性(过敏原性)和筛选抗过敏药物等的良好模型。其分离纯化多采用Ficoll。本文介绍用阿拉伯树胶的分离方法分离后纯度97±0.93％;回收率59±7.8％;自然脱颗粒细胞少于10％;对抗原仍保持良好反应能力。此外,介绍了一个在筛选药物中初步应用的例子。     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。 目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。 方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。 结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期(8 d左右)、晚期(15 d左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21 d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色：8 d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15 h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2 MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。     

小鼠骨髓源树突状细胞的扩增及鉴定

目的建立小鼠骨髓源树突状细胞的体外扩增方法并研究树突状细胞的相关特征。方法根据不同时期树突状细胞的粘附性质不同,设计简便的树突状细胞的体外扩增和纯化方法,并利用瑞氏染色和流式细胞仪(FACS)鉴定其生物学特征。结果体外培养24 h后,可见增殖性细胞集落,3 d后集落增多明显,体外培养7 d,收集悬浮细胞即为DC。光镜显示细胞表面不规则,呈树突状突起,瑞氏染色嗜碱性。流式细胞鉴定为髓系DC,高表达MHCⅡ类分子及共刺激分子(CD40、CD80、CD83、CD86)。结论此简便方法制备的树突状细胞具有髓系树突状细胞的生物学特性,及较高的纯度,可广泛的应用于临床及实验研究。     

小鼠骨髓源性肥大细胞上高亲和特异性的IFN-γ受体;IFN-γ对前体肥大细胞的抑制作用

IFN-γ是由激活的T细胞产生。许多报道证明它对造血细胞的有丝分裂具有调节功能,能明显抑制多能造血前体细胞的增殖。肥大细胞参与机体的免疫反应,特别是在过     

FVB小鼠骨髓源树突状细胞的培养

目的 建立FVB小鼠骨髓源树突状细胞体外培养和扩增方法,观察其形态和特征.方法 在无菌条件下提取FVB鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,用IL-4和GM-CSF联合协同诱导下培养,加用磷酸脂多糖刺激.应用光镜下观察树突状细胞的形态,流色细胞仪检测鉴定其生物学特征.结果 联合培养小鼠骨髓细胞3d后,可见细胞形态发生改变,细胞形...     

肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞的培养及鉴定

 目的 建立肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)的体外培养体系,为自体细胞移植促进肝血管再生、治疗肝纤维化提供合适的供体细胞。方法 Wistar大鼠皮下注射CCl4,制作肝纤维化模型;通过密度梯度离心法从肝纤维化大鼠骨髓中分离单个核细胞,并用差速贴壁培养法进行体外诱导培养成EPCs;流式细胞仪检测其表型和纯度,乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素双荧光染色鉴定其吞噬功能,血管网形成实验鉴定其成血管功能。结果 细胞培养14d后呈现铺路石样结构;63.9%±2.15% ( P < 0.05)的EPCs为CDl33/VEGFR2双阳性细胞;,EPCs具有成熟内皮细胞的吞噬功能,并能形成稳定的血管网样结构。结论 利用本实验室培养体系,肝纤维化大鼠骨髓细胞能被成功诱导培养为具有特征性表型和功能的EPCs。     

大鼠腹膜源肥大细胞外泌体的分离、培养与鉴定

目的：分离、培养及鉴定大鼠腹膜源肥大细胞外泌体。方法：提取8～10周龄SPF级雌性SD大鼠腹腔灌洗液,使用Percoll密度梯度分离法分离灌洗液中的肥大细胞,通过甲苯胺蓝染色鉴定肥大细胞,在细胞培养板中加入白细胞介素3和干细胞生长因子诱导肥大细胞成熟,收集细胞上清液,采用超速离心法分离上清液中的外泌体,通过透射电镜,纳米流式细胞仪从外泌体形态、粒径和表面标志蛋白三个方面鉴定外泌体。结果：分离得到的肥大细胞被甲苯胺蓝染成蓝紫色,分离的肥大细胞外泌体呈典型盘状,粒径分布范围为30～150 nm,平均粒径为75.33 nm,外泌体表面标志蛋白CD9和CD81呈阳性表达。结论：Percoll密度梯度分离法联合超速离心法分离大鼠腹腔灌洗液中肥大细胞外泌体的方法是可行的。     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞体外培养分化及鉴定

目的：探索大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞（EPCs）的培养、诱导分化及鉴定方法。方法：冲洗大鼠骨髓腔,梯度密度离心法获得单个核细胞,内皮细胞培养液EGM-2MV培养,通过细胞形态,免疫组化和免疫荧光检测CD34、VEGFR-2、vWF,CD133,摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-Lectin-UEA-1,超微结构及染色体核型分析进行鉴定。结果：新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,大小不一;48h后部分细胞开始贴壁,呈梭形、纺锤形或不规则形;4～8d呈细胞集落或线状排列;9～11d接近融合,呈典型鹅卵石样外观。贴壁细胞CD34、CD31、VEGFR-2、vWF、CD133均表达阳性并呈动态变化,能够摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-Lectin-UEA-1,透射电镜见特征性Weible-Palade小体,能稳定保持二倍体核型。结论：本实验初步建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分化及鉴定方法体系。     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养方法的比较研究

目的 探讨最佳体外诱导培养小鼠成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)的方法.方法 分离、纯化6周龄C57BL/6小鼠骨髓单核细胞,以含10 %胎牛血清、20 ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和10 ng/ml重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)的RPM I-1640培养基培养7 d,然后将细胞分成对照未刺激组、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激组和TNF-α+脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激组.继续培养48 h后,观察各组细胞形态,检测IL-12、IL-6浓度及细胞表面标志CD11c、CD80、CD86 和MHC Ⅱ.结果 培养9 d后,两刺激组培养的细胞经相差显微镜观察有DC生长.TNF-α刺激组细胞培养上清液中IL-6、IL-12含量显著高于对照组(P＜0.01),但显著低于TNF-α+LPS刺激组(P＜0.05).3组均高表达CD11c,各组间无显著差异;而CD80、CD86和MHCⅡ表达阳性率TNF-α刺激组显著高于对照组(P＜0.01),TNF-α+LPS刺激组显著高于单纯TNF-α刺激组(P＜0.05).结论 联合使用TNF-α与LPS刺激可使DC成熟度提高,分泌IL-6、IL-12增加.     

小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导

分离树突状细胞（DC）的原理是依据DC的低密度和半黏附特性，DC缺乏Fc受体，可对获得的DC进一步纯化。这种方法获取的DC数量有限。细胞因子诱生法是目前体外扩增DC常用的方法。其中，扩增效果最好的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和白细胞介素4（IL-4）。     

建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

背景:目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少,因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重要。目的:建立ApoE敲除骨髓MYDGF特异性缺失小鼠模型并进行鉴定。方法:ApoE敲除小鼠和骨髓特异性MYDGF敲除小鼠,均购于上海南方模式生物科技股份有限公司。选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配,得到基因型为MYDGF^flox/+ApoE^flox/+F1子代小鼠30只,MYDGF^flox/+ApoE^flox/+互相进行交配,一共得到基因型为MYDG F^flox/floxApoE^flox/flox双敲除小鼠30只和ApoE^flox/flox小鼠子代小鼠34只。采用PCR法进行MYDGF^flox及...     

脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。 目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。 方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用MTT比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。 结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。     

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞成熟的影响

目的 探讨HBe Ag对LPS诱导小鼠骨髓源性树突状细胞(DC)成熟的影响。方法 体外诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化成未成熟树突状细胞,经CD11c磁珠分选纯化后将DCs随机分为空白对照组、LPS刺激组、HBe Ag+LPS刺激组。流式检测DC表型变化,混合淋巴反应(MLR)检测DC促T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中IL-12的分泌水平,Western blot检测p38磷酸化水平,并设置SB203580组为阳性对照探讨细胞IL-12分泌的可能调节机制。结果 LPS刺激未成熟DC引起细胞表面MHC-Ⅱ、CD86表达升高,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力增强,IL-12分泌量增高。HBe Ag可抑制LPS促进DC表面MHC-Ⅱ、CD86表达升高和促淋巴细胞增殖能力增强的作用。LPS刺激DC可引起p38磷酸化水平升高,并呈时间依赖性;HBe Ag或SB203580预处理细胞再予LPS刺激,磷酸化p38表达和IL-12分泌较单纯LPS刺激组明显下降。结论 HBe Ag对LPS引起的树突状细胞的成熟有一定的抑制作用,且HBe Ag可能通过抑制p38MAPK信号通路下调LPS诱导的树突状细胞IL-12的产生。     

一种分离新生小鼠肝细胞的简单方法

目的建立新生小鼠肝细胞体外分离培养方法。方法采用胶原酶消化组织块法分离新生小鼠肝细胞，倒置显微镜动态观察细胞形态特征，并进行鉴定：PAS（periodieacid-Schiff，PAS）染色观察细胞肝糖元的含量；免疫组化SP法检测细胞甲胎蛋白AFP（alpha fetal protein，AFP）的表达；生化法检测肝细胞培养上清白蛋白的含量。结果肝组织块经用胶原酶直接消化，获得的肝细胞成活率达80％以上。肝细胞培养一周后长满瓶底，呈集落生长，融合成片。培养的肝细胞PAS糖原染色阳性；AFP表达阳性；培养上清白蛋白含量至培养5～7d时迭峰值，随后又逐渐下降。结论胶原酶消化组织块法分离新生小鼠肝细胞，方法简单、高效，培养的原代肝细胞符合新生肝细胞的生物学特性。     

一种绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞源性外泌体的构建及鉴定

目的:构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs),获得GFP标记的MSCs源性的外泌体(exosomes)。方法:全基因合成CD63序列,连接到穿梭载体,酶切验证后转染293T细胞,测定病毒滴度后感染MSCs,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。荧光定量PCR检测CD63在MSCs中的表达。取其无血清培养72 h的上清液,获得提取物,经透射电镜和Western Blot验证。结果:提取物为类圆形囊泡,大小约为40~100 nm,具有CD63和Alix表达。结论:成功构建携带GFP标记的MSCs源性的外泌体,为研究外泌体在细胞中的摄取及信号传递提供了工具。     

负载布鲁杆菌WboA~(-/-)S_2株对小鼠骨髓源性肥大细胞的活化作用研究

研究猪种布鲁杆菌WboA-/-S2株对骨髓源性肥大细胞(BMMC)的激活作用。用粗糙型布鲁杆菌WboA-/-S2株感染BMMC,并以光滑型S2株作为对照,采用RT-PCR法观察BMMC载菌后不同时间点TLR4和TLR8表达的变化;用ELISA法检测感染后BMMC上清中TNF-α、IL-6、IL-1和IL-12的含量。结果显示负载WboA-/-S2株和S2株12h时BMMC TLR4的表达量均明显高于正常对照组,其中负载WboA-/-S2株的BMMC TLR4表达又明显高于S2株负载组,24h时二者表达均明显减弱;在负载12hWboA-/-S2株组BMMC TLR8表达明显高于正常对照组,而S2株组的BMMC TLR8与正常对照组相比条带无明显变化,24h时二者表达均减弱。负载WboA-/-S2株后3h、6h、12h、24hBMMC所分泌的TNF-α和IL-6都明显高于S2株负载组(P0.05),而在负载两菌的BMMC上清中均未检测到IL-1和IL-12。结果表明WboA-/-S2株较S2株更易被BMMC识别,激活BMMC的能力也明显强于S2株,并可快速诱导BMMC分泌大量细胞因子。