小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化*★

目的：血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品，但来源有限。胚胎干细胞具有发育全能性，目前其定向诱导机制尚不明确。通过选择适当的诱导剂，探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势。 方法：实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成。①动物及细胞系：清洁级孕12.5 d昆明小白鼠1只，由南昌大学医学院动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018，由American Type Culture Collection提供。②实验方法：取孕12.5 d鼠胚胎，去除头部、内脏及四肢，将组织块剪碎，胰酶消化，分离培养胚胎成纤维细胞，传至3~5代时更换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基，24 h后收集培养液，加入2.0 mmol/L L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，1 000 Ｕ/mL白血病抑制因子，此即为条件培养基。常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ，以1×106密度接种，传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞，加入条件培养基5 mL，经过悬滴-悬浮培养，构建拟胚体分化模型。设立3组，各组均置于明胶包被的T25培养瓶中，每瓶加入50个拟胚体，使其均匀分布于培养瓶底。诱导组7~10 d加入10-9 mol/L全反式维甲酸和3μg/L转化生长因子β1，10~21ｄ加入 20μg/L血小板源性生长因子。血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清，全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸。诱导21ｄ的拟胚体，用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞，再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7ｄ。③实验评估：应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达。通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质。 结果：①胚胎干细胞生长及拟胚体诱导分化：胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚体，经过不同生长因子的分阶段联合诱导，拟胚体贴壁后球体略摊开，周围出现大量的梭形细胞。②RT-PCR检测：拟胚体血管平滑肌肌动蛋白和血管平滑肌肌球蛋白重链基因均呈强阳性表达。③免疫细胞化学检测：荧光显微镜下，罗丹明染色细胞浆呈红色荧光，并可见肌丝结构；DAPI染色细胞核呈蓝色荧光。诱导组血管平滑肌肌动蛋白阳性率明显高于血清对照组、全反式维甲酸组（P < 0.05）。 结论：胚胎干细胞经维甲酸、转化生长因子β1以及血小板源性生长因子分阶段联合诱导后，可分化为血管平滑肌细胞且纯度较高。随着细胞纯度和活性等问题的进一步解决，胚胎干细胞将有可能成为血管组织工程的种子细胞。     

体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化***★

背景：周围微环境能够调节胚胎干细胞在体外的诱导分化情况，可能与多种信号通路及细胞因子作用有关。 目的：观察局部微环境对体外培养的小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞定向诱导分化的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成。 材料：清洁级孕13.5 d的C57BL/6昆明鼠6只，由中科院上海实验动物中心提供。携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8由上海市发育生物学研究中心提供。 方法：取孕鼠胚胎，采用组织块消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理得到滋养层细胞。将携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8解冻复苏，加入含白血病抑制因子的高糖DMEM培养基体外扩增培养，将细胞克隆吹打成单细胞悬液，加到滋养层细胞上，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。胚胎干细胞传代后，再加入含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基，以单纯加入高糖DMEM培养基作为空白对照，调整细胞浓度为3×108 L-1，吹打法悬浮培养48 h，收集悬浮液，反复离心去上清，移入铺有明胶的培养皿中，培养9 d。 主要观察指标：诱导前后细胞形态及生长状态变化，RT-PCR检测诱导后细胞向神经前体细胞的分化情况。 结果：胚胎干细胞在含有白血病抑制因子的高糖DMEM培养基中能够保持未分化状态，克隆生长良好；换用含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基悬浮培养后，4.0~5.0 h聚集成团，形成圆球状的类胚体。加入全反式维甲酸的诱导组内胚层细胞呈多边形且数量较多，对照组内胚层细胞呈长梭形且数量少。诱导后细胞表达神经干细胞特异性标志巢蛋白，神经细胞特异性标志微管相关蛋白2呈弱表达，不表达神经胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白。 结论：体外培养的小鼠胚胎干细胞可保持未分化状态，具有不断增殖的能力，经白血病抑制因子与全反式维甲酸两步诱导后可分化为神经前体细胞。     

体外诱导人类胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的 探索一种诱导人类胚胎干细胞（hESCs）向神经干细胞（NSCs）定向分化的简单高效的方法。方法 将hESCs在细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养形成拟胚体，进一步将成熟拟胚体打散、贴壁培养于含有B27和noggin等成分的特定培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化。结果 悬浮于细菌培养皿中的hESCs不贴壁，进行性长大，7～10d形成成熟拟胚体；拟胚体在特定培养基中可诱导成高纯度（约96．4％）的nestin阳性细胞（即NSCs），进一步培养，这些细胞可分化成各种成熟的神经细胞。结论 该方法诱导hESCs向NSCs定向分化较文献报道耗时更短、费用低廉且效率更高，为进行细胞移植治疗神经系统相关疾病提供了很好的种子细胞来源。     

小鼠胚胎干细胞来源平滑肌细胞的鉴定及其功能分析

背景：胚胎干细胞来源的平滑肌细胞是血管组织工程潜在的细胞来源之一,但这些细胞是否具有成熟平滑肌细胞的表型和功能仍不清楚。 目的：对小鼠胚胎干细胞分化的平滑肌细胞进行表型鉴定及功能分析。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-05/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。 材料：清洁级孕12.5 d昆明小鼠1只用于制备饲养层细胞,SD大鼠1只用于制备主动脉平滑肌细胞。小鼠胚胎干细胞系R1、小鼠微血管内皮细胞系由美国ATCC公司提供,转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1由本实验室制备。 方法：①诱导分化及筛选：用转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1制备拟胚体,拟胚体悬浮培养5 d后贴壁培养1 d,第7天加入全反维甲酸诱导分化4 d,第 11天用10 mg/L嘌呤霉素对诱导分化后的细胞筛选2 d。②表型鉴定：对筛选到的平滑肌细胞进行SM α-actin、SM22α、SM-MHC免疫荧光染色,以大鼠原代主动脉平滑肌细胞、未经筛选的第10天分化细胞作为对照,进行Western Blot分析。③收缩功能：10-5 mol/L卡巴可处理筛选到的平滑肌细胞 30 min。④体外成血管功能：将等量的内皮细胞和筛选到的平滑肌细胞混合,在Matrigel上培养。 主要观察指标：平滑肌细胞标志物的表达,平滑肌细胞的收缩,平滑肌细胞向内皮管腔样结构的募集。 结果：分化的平滑肌细胞主要分布于贴壁生长的拟胚体的外周部位,胚胎干细胞来源的平滑肌细胞3种标志物SM α-actin、SM22α、SM-MHC免疫荧光染色均呈阳性表达,Western Blot结果显示其SM α-actin、SM22α表达水平与大鼠原代主动脉平滑肌细胞相似,高于未经筛选的第10天分化细胞。筛选到的平滑肌细胞在10-5 mol/L卡巴可刺激下出现明显收缩,且能够募集到内皮管腔样结构周围。 结论：小鼠胚胎干细胞来源的平滑肌细胞具有与成熟平滑肌细胞相似的表型和功能。     

小鼠胚胎肝干细胞体外向肝样细胞的诱导分化

背景：目前肝干细胞尚无特异性标志物,故其分离、培养尤其是纯化技术尚不成熟。 目的：观察体外培养的小鼠胚胎肝干细胞生物学特性,及其向肝样细胞的诱导分化能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-01/06在厦门大学附属中山医院消化中心实验室完成。 材料：SPF级BALB/c胎鼠20只,13.5 d龄,由厦门大学生命科学学院实验动物中心提供。 方法：无菌操作取出胎鼠肝脏,用细胞刮梳理后用IV型胶原酶消化。取分离纯化后的第2代细胞进行免疫荧光染色。细胞培养到第3代时,分别用3 mmol/L丁酸钠盐与0.1% DMSO进行诱导,5 d后收集细胞进行Western blotting实验。 主要观察指标：胚胎肝干细胞的形态及表面分子的表达,诱导后胚胎肝干细胞mRNA与蛋白水平的变化。 结果：分离培养的细胞第2代即可得以纯化,呈克隆样生长,高表达白蛋白、甲胎蛋白、C-met及角蛋白19,且多数细胞共表达白蛋白与角蛋白19、C-met与角蛋白19,双阳性率约80%。细胞诱导后肝细胞标志物白蛋白表达明显增加,而作为不成熟肝细胞的经典标志物甲胎蛋白表达减少,同时干细胞标志物 c-kit mRNA水平也明显下降,角蛋白19水平无明显变化。 结论：胚胎肝干细胞具有双向分化潜能,经丁酸钠盐与DMSO诱导后可以向肝样细胞分化。     

维生素C体外诱导多能干细胞向心肌细胞的分化

背景：诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。目的：观察维生素C作为诱导剂对多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响。方法：复苏小鼠诱导多能干细胞,传代培养后,采用直接悬浮培养法使小鼠诱导多能干细胞形成拟胚体,用含10-3,10-4,10-5,10-6 mol/L 4种不同浓度维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率。结果与结论：维生素C诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度为10-4 mol/L,有(57.00±3.20)%的拟胚体出现搏动,显著高于不添加任何诱导剂的对照组(5.13%±0.55)%(P < 0.01)。诱导而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin。提示最佳的维生素C诱导分化条件能够促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化,提高其分化效率。     

胚胎大鼠神经干细胞的体外培养与鉴定

目的利用无血清培养和细胞克隆培养技术从孕鼠(14 d)胚胎中分离出神经干细胞,并进行传代培养和诱导分化。 方法 采用免疫细胞荧光化学染色方法观察不同代数细胞克隆球中nestin、neuN、GFAP阳性细胞比例,鉴定培养的原代和传代的细 胞类型结果随着传代次数增加,克隆球中nestin阳性细胞的比例无明显变化(P>0．05),不同代数的神经干细胞克隆球诱导分化 后均有一定比例的neuN与GFAP阳性细胞。结论 证实从胚胎大鼠大脑皮层分离培养的细胞是神经干细胞,提示体外培养体系中 培养的神经干细胞可以长期传代并保持于细胞的特性。     

神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化及其机制探讨*☆

背景：前期研究发现神经调节蛋白1早期干预能够诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。 目的：进一步观察神经调节蛋白1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的途径。 方法：分别观察胚胎干细胞自发与在神经调节蛋白1诱导情况下向心肌细胞的分化,RT-PCR检测胚胎干细胞自发与诱导分化下心肌特异性早期转录因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表达,细胞免疫组织化学检测胚胎干细胞自发与诱导分化下心肌肌钙蛋白T及磷酸化蛋白激酶B的表达,Western blot半定量分析自发与诱导分化下心肌细胞磷酸化蛋白激酶B的表达。 结果与结论：神经调节蛋白1诱导心肌分化率显著高于自发心肌分化率。神经调节蛋白1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA表达;表皮生长因子样受体拮抗剂及磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂阻断了神经调节蛋白1对Nkx2.5 mRNA的表达上调作用。Western blot分析显示神经调节蛋白1诱导组拟胚体中自发性搏动心肌细胞团磷酸化蛋白激酶B的相对表达高于自发心肌分化组。提示神经调节蛋白1可能通过磷脂酰肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B信号通路诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的：建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法，探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性。方法：采用10％BSA＋7．5％DMSO作冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力，形态及分化能力作鉴定。结果：不同的冻存时间，细胞代数，组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异（P＞0．05）。冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活，能在体外多次传代，并能分化成神经元，星形胶质细胞细胞和少突胶质细胞。结论：大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的，增殖能力和多向分化能力。     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景：随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径。但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题。 目的：拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成。 材料：14~16 d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供。 方法：取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖。原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定。应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况。 结果：原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应。以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达。 结论：实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 关键词：神经干细胞;体外培养;诱导分化     

雪旺氏细胞促进共培养大鼠胚胎神经干细胞的分化

目的 探讨诱导神经干细胞分化的因素。方法 新生大鼠雪旺氏细胞与大鼠胚胎神经干细胞在无血清培养液中共培养，观察神经干细胞的形态变化及分别检测特异性标志蛋白tubulin-β、GalC和GAFP的表达。结果 相差显微镜下大部分神经干细胞伸出多个细长突起，且免疫莹光染色tubulin-β高度表达；少数细胞为有多个短小突起的小细胞，且GalC或GFAP阳性表达。结论 雪旺氏细胞与大鼠胚胎神经干细胞共培养可诱导神经干细胞分化。     

胚胎大鼠神经干细胞电生理特性检测

目的 探讨胚胎大鼠神经干细胞体外培养分化的子代细胞电生理特性。方法 传代细胞单层贴壁培养,细胞内电流钳记录静息膜电位、动作电位、膜阻抗等电生理指标。结果 神经干细胞在现有培养条件下可初步分化为神经元和胶质细胞,并表现出不同的电生理特性。结论 神经干细胞表现出多向分化潜能,但现有培养条件尚不能使子代细胞电生理功能完全成熟。     

新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。     

Time-sensitive effects of hypoxia on differentiation of neural stem cells derived from mouse embryonic stem cells in vitro

Abstract

Objectives:

Oxygen tension is an important component of microenvironment for the differentiation of embryonic stem cells including neural lineage. However, the comprehensive influence of hypoxia on neural differentiation during embryonic neural development has not yet been examined.

Methods:

In this study, we investigated the effect of low oxygen levels (5% O₂), or hypoxia, in two stages of neural differentiation in vitro: (1) inducing mouse embryonic stem cells into neural stem cells (NSCs); and then (2) inducing NSCs into neural progenitor cells in neurospheres.

Results:

In the first stage, NSCs generation was reduced under hypoxia. Less mature morphological changes (including neural marker) of NSCs were observed, suggesting the prevention of early differentiation under hypoxic conditions. Thus undifferentiated stem cells were maintained in this stage. However, in the second stage, hypoxia induced neural differentiation in neurospheres. Nevertheless, non-neural progenitor cell formation, such as mesoderm progenitor cell lines or epithelial cell lines, was restricted by low oxygen tension.

Discussions:

Our results demonstrate that hypoxia is essential for regulating neural differentiation and show the different effects on NSC differentiation dependent on the time-course of NSC development. In the early stage of NSCs induction, hypoxia inhibits neural differentiation and maintains the undifferentiated state; in the later stage of NSCs induction, hypoxia induces neural differentiation. Our study may contribute to the development of new insights for expansion and control of neural differentiation.     

神经干细胞移植治疗脑卒中的临床研究

目的探讨神经干细胞移植治疗脑卒中的方法、安全性及可行性。方法 对26例脑卒中患者采用鞘内注射及微创穿刺技术将培养人胚胎神经干细胞移植到脑内,采用欧洲卒中量表评分标准(ESS)、生活功能评分标准(BI)评价其疗效。结果 23例行鞘内注射患者移植后ESS(54.1±21.2)较移植前(51.4±21.1)明显提高(P<0.05);移植后BI(41.1±31.3)较移植前(36.6±32.1)明显提高(P<0.05);3例行微创穿刺术患者恢复良好,且未发现不良反应。结论 神经干细胞移植治疗脑卒中有效可行。     

小鼠胚胎神经干细胞在猫全脑缺血再灌注损伤模型中的存活、迁移及分化

目的 观察小鼠神经干细胞在猫全脑缺血再灌注损伤模型中的存活、迁移及分化。方法 参照四血管阻塞法建立猫全脑缺血再灌注损伤模型,将原代培养的小鼠神经干细胞移植入模型动物脑中。一个月后,以免疫荧光技术检测移植干细胞的存活、迁移及分化情况。结果 缺血再灌注损伤模型制作成功7例,成功率70%;免疫荧光法检测小鼠神经干细胞移植到猫前脑后一个月仍有大量存活,部分细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并向脑组织中迁移。结论 小鼠神经干细胞在猫全脑缺血再灌注损伤模型中能够存活、迁移并分化。     

大鼠雪旺氏细胞支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化

目的 探讨大鼠雪旺氏细胞对人胚胎神经干细胞生长和分化的作用。方法 实验分为三组：组一：干细胞生长于培养雪旺氏细胞1天后的培养液中；组二：干细胞与雪旺氏细胞共培养；组三：干细胞生长于DMEM／F12培养液中，观察干细胞的形态学变化和免疫荧光的.组一的神经球分化生长，绝大多数细胞tubulin-β阳性，少数为GalC或GFAP阳性；组二中，在雪旺氏细胞生长密集和稀少的地方，干细胞分别表明为不分化和明显分化两种状态；组三的神经干细胞无法正常生长。结论 大鼠雪旺氏细胞分泌物支持人胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法 原代培养．培养细胞生长状况观察用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）检测以作细胞鉴定。结果 成功培养出大鼠胚胎神经干细胞，了解其生长规律，并对其进行传代、冻存及复苏，培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论 大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏，并具有多向分化潜能。     

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的方法。方法 模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境，以脑星形胶质细胞为支持细胞，用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测；NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力；(2)随着诱导的进行，OCT-4表达逐渐减弱并消失，而Nestin表达逐渐增强，经三步法最终可诱导形成纯度高达90％以上的Nestin阳性细胞；(3)所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代，仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力，在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质，模拟体内神经分化过程的三步诱导法，可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs，并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。