B7-1基因转染骨肉瘤细胞诱导抗骨肉瘤主动免疫的实验研究

目的:探讨B7-1基因转染骨肉瘤细胞能否诱导抗骨肉瘤主动免疫作用。方法:利用脂质体将B7-1真核表达载体pcDNA3-B7-1和空载体pcDNA3分别导入骨肉瘤细胞株LM8中,G418筛选出阳性克隆(分别命名为LM8/B7-1和LM8/pcDNA3),通过RT-PCR、Western blot和流式细胞仪检测B7-1基因与蛋白的表达;通过软琼脂克隆形成实验观察转基因细胞株LM8/B7-1的体外增殖能力;用LM8、LM8/B7-1和LM8/pcDNA3分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞和致敏脾细胞,MTT法检测其体外杀伤活力;将LM8、LM8/B7-1和LM8/pcDNA3细胞分别接种到C3H雄性小鼠前腋下,观察其致瘤能力;观察LM8/B7-1致敏的小鼠对骨肉瘤细胞LM8是否具有免疫保护作用。结果:B7-1基因在转基因细胞LM8/B7-1中能得到高表达;LM8/B7-1体外增殖能力与LM8和LM8/pcDNA3无明显差异(P>0.05);LM8/B7-1诱导的CTL的杀伤活力显著高于LM8和LM8/pcDNA3诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活力,LM8/B7-1诱导的CTL对LM8/B7-1的杀伤活力也明显高于对LM8和LM8/pcDNA3的杀伤活力(P<0.05);LM8/B7-1致瘤能力较LM8和LM8/pcDNA3细胞明显下降(P<0.01);LM8/B7-1致敏的小鼠对骨肉瘤细胞LM8具有免疫保护作用。结论:B7-1基因转染骨肉瘤细胞能诱导抗骨肉瘤主动免疫作用,为利用B7-1基因进行骨肉瘤免疫基因治疗提供了实验依据。     

转染B7-1基因的人胰腺癌细胞生物学活性的研究

目的探讨B7-1基因导入人胰腺癌SW1990细胞后肿瘤细胞生物学特性的变化.方法采用RT-PCR及FACS检测B7-1基因的表达.MTT法检测病毒转化细胞体外增殖能力.以肿瘤细胞淋巴细胞混合培养检测淋巴细胞的增殖反应.结果转染后的SW1990细胞表达B7-1阳性,野生型SW1990、SW1990/pLXSN细胞与SW1990/B7-1细胞的形态、体外生长特性及MHC Ⅰ类分子表达水平均无差异.SW1990/B7-1细胞增强PBL体外增殖能力及细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌.结论表达B7-1分子的胰腺癌细胞免疫原性增加.     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.     

腺病毒介导的IL—2基因及B7—1基因联合转染G422细胞致瘤原性和免疫原性的变化

目的研究联合细胞因子基因转染的D422胶质母细胞瘤细胞体内致瘤原性和免疫原性的变化,为胶质瘤的免疫基因治疗打下基础.方法IL-2基因和B7-1基因转染的G422细胞1×105皮下和脑内接种,观察肿瘤生长速度和荷瘤小鼠的存活期,2周取脾脏,检测NK、LAK和CTL的杀伤活性.结果IL-2和B7-1基因联合转染的G422细胞,皮下接种后肿瘤生长明显减慢,脑内接种动物存活期明显延长,NK、LAK和CTL的杀伤活性增强.结论IL-2基因和B7-1基因联合转染的G422细胞,致瘤原性下降,免疫原性增强,能有效激活机体特异性与非特异性抗肿瘤免疫反应.     

TK基因转染骨肉瘤U-2细胞体外实验研究

目的 研究脂质体介导的TK/GCV系统对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法 构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,制备和转化感受态大肠杆菌BL21以及鉴定测序,提取、纯化重组质粒DNA,培养和转染人骨肉瘤细胞株U-2 OS,流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态,用转染后的培养液的上清加入TK （-） U-2 OS中观察旁观者效应.结果 成功地构建出包含有TK基因cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-tk,通过PCR等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计.荧光显微镜下观察U-2 OS （TK＋）呈现绿色荧光.U-2 OS TK/GCV培养上清液可明显诱导细胞凋亡.但将上清液用0.2μm的滤膜滤过后,诱导凋亡作用消失.结论成功构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,体外实验表明人骨肉瘤细胞系U-2 OS对脂质体介导的TK/GCV系统敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径.     

多聚乙烯亚胺介导小鼠IL-12 基因转染人骨肉瘤细胞的细胞

 目的 确定多聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)最佳的转染条件。以PEI为载体，将mIL-12基因导入MG63细胞。方法 以MTT法检测PEI的细胞毒性。以PEI为载体，在不同的条件下．将荧光素酶基因和mIL-12基因导入MG63细胞，分别检测其转染效率。结果 PEI的细胞毒性较低。当N／P比值为8时,PEI的转染效率最高。PEI可以成功的将mIL-12基因导入MG63细胞。结论 PEI是一种低毒性、高效率的DNA载体，可以广泛应用于体内外基因治疗的试验。     

共刺激分子B7家族在骨肉瘤中的研究进展

目的 骨肉瘤是好发于青少年的常见骨肿瘤之一,其发病率占原发性骨肿瘤的36％.近年来,骨肉瘤诊治水平大幅提升,但治疗效果仍不理想.随着肿瘤免疫研究的深入,人们发现在肿瘤微环境中,肿瘤浸润性T细胞是主要的抗肿瘤效应细胞,但其表面B7家族共刺激信号若发生异常,可导致肿瘤浸润性T细胞发生抑制,协助肿瘤细胞逃避机体监视而发生免疫...     

联合IL-2基因和B7-1基因转染G422细胞体外生物学特性

目的　通过研究联合基因转染后胶质母细胞瘤G42 2细胞生物学特性的变化 ,探讨脑胶质瘤细胞因子基因治疗的新途径。方法　通过重组腺病毒作载体 ,将IL 2基因和B7 1基因转染至小鼠G42 2细胞 ,通过CTLL 2细胞增殖的MTT法检测IL 2的分泌水平 ,FACS检测B7 1和ICAM 1的表达 ,MTT法检测转基因后G42 2细胞的增殖活性 ,双层琼脂糖培养法检测其克隆形成能力。结果　IL 2基因转染 4小时后即可检测到IL 2的分泌 ,2 4小时达高峰 ( 4 83U/ml) ,一周时表达明显下降 ,B7 1高表达 ,ICAM 1表达增加 ,增殖能力和克隆形成能力无变化。结论　重组腺病毒作载体 ,IL 2基因及B7 1基因共转染G42 2细胞 ,能得到目的基因的高效表达 ,同时促进了粘附分子ICAM 1的表达 ,体外增殖活性不受影响。     

BRD7基因转染对鼻咽癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨鼻咽癌负相关基因BRD7对鼻咽癌细胞系HNE1生长的影响。方法：构建BRD7基因真核表达载体pcDNA3.1( )/BRD7重组体,采用脂质体介导转染技术,将BRD7真核表达重组粒和空载体质粒分别导入鼻咽癌细胞系HNE1,Southern杂交和RT－PCR分别检测外源性DNA的整合和BRD7基因的表达,并借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、流式细胞计数和裸鼠接种方法对转染细胞的生物学行为进行了检测。结果：转染BRD7基因的HNE1生长倍增时间为53h,较HNE1（23．9h)和空载体转染HNE1（24．1h）明显延长,流式细胞仪表明,BRD7表达升高延缓细胞由G0－G1期进入S期,BRD7转染HNE1在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降（P＜0．01）,裸鼠接种试验显示BRD7基因转染细胞HNE1生长速度受到抑制。结论：BRD7基因重表达有助于HNE1的恶性表型的逆转;BRD7是一个鼻咽癌相关的抑瘤基因良好的候选者。     

KAI1基因对乳腺癌细胞生物学特征的影响

目的:研究稳定转染外源性KAI1基因对人乳腺癌细胞体外生物学特性的影响。方法:应用脂质体将pCMV-KAI1质粒转染入人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,免疫印迹方法检测蛋白表达,分别利用MTT法,体外粘附及侵袭力实验判断KAI1基因对细胞增殖能力及粘附,侵袭力的影响,并利用ELISA法检测转染前后游离组织间粘附因子-1(sICAM-1)的动态变化。结果:获得了稳定表达KAI1基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞克隆,并有KAI1蛋白的高表达。MTT法显示转染组的细胞增殖力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。体外粘附及侵袭力实验表明转染组的细胞粘附侵袭能力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。转染后sICAM-1含量下降。结论:KAI1基因可抑制人乳腺癌细胞的恶性特征,并可能是通过影响一些粘附因子作用而抑制肿瘤细胞转移。     

共刺激分子4-1BBL和B7-1在人脑胶质瘤细胞中的表达

背景与目的：4-1BBL和B7-1为诱导和维持T细胞活化提供了重要的共刺激信号,目前被认为是提高抗肿瘤免疫的治疗靶点。本研究探讨4-1BBL和B7-1在7株胶质瘤细胞系表面的表达情况。方法：用流式细胞仪检测7株胶质瘤细胞株表面的共刺激分子4-1BBL和B7-1的表达,同时用MTT法分析胶质瘤细胞系对抗癌药物长春新碱（VCR）敏感性,并分析4-1BBL的表达与耐药性的相关性。结果：发现在所检测的胶质瘤细胞表面有不同程度的表达4-1BBL,但均不表达B7-1。其中T98G和MGR1细胞表面的4-1BBL表达〉30％,对VCR不敏感。UW28、SKMG1、MGR2、SF767、SKMG4细胞表面的4-1BBL表达〈10％。对VCR敏感。结论：本研究所检测的胶质瘤细胞均不表达共刺激分子B7-1。但有不同程度的表达4-1BBL,并且4-1BBL高表达的胶质瘤细胞对长春新碱敏感性差。     

STUDY OF ENHANCED IMMUNOGENECITY OF B7-1 GENE TRANSFECTED HUMAN HELA CELL LINE

ＳＴＵＤＹＯＦＥＮＨＡＮＣＥＤＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＣＩＴＹＯＦＢ７１ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＣＴＥＤＨＵＭＡＮＨＥＬＡＣＥＬＬＬＩＮＥＨｅＸｉ何曦ＱｉｎＨｕｉｌｉａｎ秦慧莲ＸｉａｎｇＲｏｎｇ向荣ＺｈａｎｇＹｕｅｊｉａｎ张跃建ＹｅＷｅｎｆｅｉ叶闻斐Ｈｅ...     

逆转录病毒载体介导大鼠乳腺癌细胞共表达MIP1α和B71

目的：建立共表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的大鼠乳腺癌细胞株，并进行体外活性检测。方法：应用含不同选择标记的重组逆转录病毒载体，经1mg／ml G418和2rLg／ml puromycin双药物筛选后获得MIP-1α＋B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株。RT-PCR、免疫组化检测mMIP-1α的表达，RT—PCR、流式细胞术检测mB7-1的表达；将共表达MIP-1α和B7-1的肿瘤细胞与大鼠脾淋巴细胞混合培养后，MTT法检测淋巴细胞的增殖指数、琼脂糖打孔法检测共表达MIP-1α和B7-1肿瘤细胞对单个核细胞的趋化活性。结果：经脂质体转染包装细胞产生的重组逆转录病毒上清病毒滴度达4．6×10^7CFU／L。细胞生长曲线显示，重组逆转录病毒感染对乳腺癌细胞增殖无明显影响。重组逆转录病毒感染的大鼠乳腺癌细胞株SHZ-88／mMIP-1α＋mB7—1有B7-1和MIP-1αmRNA及蛋白的表达。淋巴细胞增殖指数PI值SHZ-88／PLXSN组为（0．76±0．25），SHZ-88／mMIP-1α＋mB7-1组为（1．95±-0．31），后者体外刺激淋巴细胞增殖能力增强（P〈0．01），SHZ-88／pBabe puro组的趋化指数为（0．99±-0．19），mMIP-1α＋mB7—1组的为（3．88±0．33），后者显著增强了趋化活性。结论：通过逆转录病毒载体介导建立MIP-1α和B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株具有招引单个核细胞，并将其激活的体外生物学活性。     

抗胃癌生物活性肽对荷胃癌裸鼠酯酶同工酶代谢的影响

本文观察了协同刺激分子B7-1某因导入小鼠EL-4淋巴瘤细胞后在小鼠体内诱导的抗瘤效应.结果表明,逆转录病毒(PLXSN)载体重组的小鼠B7-1基因表达质粒导入小鼠EL-4淋巴瘤细胞,经有限稀释法克隆后获得高表达的B7-1~ EL-4细胞.B7-1~ 瘤细胞的形态,体外增殖能力及MHC Ⅰ类分子表达水平与野生型肿瘤细胞无显著差别,但致瘤性显著降低,用野生型肿瘤致死剂量接种C57BL/6小鼠完全排斥.同时免疫原性明显增强,以X-线灭活的B7-1~ 肿瘤细胞免疫后小鼠获得了对随后致死剂量野生型细胞攻击的免疫保护作用.以X-线灭活的肿瘤细胞作为瘤苗进行实验性免疫治疗,对早期(接种7天)形成的肿瘤有一定的治疗效果,但时晚期(接种14天)肿瘤.B7-1和B7-1~ 瘤细胞都未显示出明显的治疗效果.上述结果提示肿瘤细胞表达B7-1分子可有效激发机体的抗肿瘤免疫应答.     

人大肠癌细胞蛋白质组中免疫球蛋白重链可变区和B7-1的表达

目的 分析人大肠癌LS174T及SW480细胞株的蛋白质表达谱。方法 通过固相pH梯度双向凝胶电泳分离人大肠癌LS174T及SW480细胞总蛋白质,经基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）获得肽质量指纹图（PMFs）,通过Mascot软件查询蛋白质数据库进行蛋白质的初步鉴定。结果 获得了分辨率较高的人大肠癌LS174T及SW480细胞的双向电泳图谱,初步鉴定了一批蛋白质,包括免疫球蛋白重链可变区（IgVH）和共刺激分子B7-1,并通过电喷雾离子阱串联质谱（ESI-MS／MS）分析和免疫细胞化学染色得到进一步证实。结论 在人大肠癌LS174T和SW480细胞中存在IgVH和B7-1的表达,这一发现有助于进一步阐明肿瘤的免疫逃逸机制。     

mB7－1基因转染小鼠黑色素瘤细胞诱导的抗瘤效应研究

目的：研究共刺激Ｂ７－１（ＣＤ６０）在诱导有效的抗肿瘤免疫反应反应中所起的作用。方法：在体外,三种肿瘤细胞与同上鼠脾淋巴细胞混合培养（ＭＬＴＣＳ）后,测定淋巴细胞增殖指数（ＭＴＴ法）和特异杀伤活性（ＬＤＨ释放改良法）;ＭＴＴＩ地测定肿瘤细胞体外增殖能力后,将Ｂ１６－ｎｅｏ和Ｂ１６－ｍＢ７－１妆种于Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下后观察成瘤期、荷瘤小鼠存活以及肿瘤结节生长速度。结果：与野生型Ｂ１６细胞和模拟转     

树突状细胞与髓性白血病的免疫治疗 *

目的：我们应用逆转录病毒构建了ＩＬ－１２,Ｂ－７和ＧＭ－ＣＳＦ表达载体,以研究基因修的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法：将３种表达载体分别转染ＥＬ－４胞腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果：当接种子ＥＬ４／ＩＬ－１２细胞后,在Ｃ５７ＰＬ／６同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较ＥＬ４／Ｗｔ和ＥＬ－４／Ｎｅｏ组明显减少（Ｐ〈０．０１）。在ＥＬ４／ＩＬ－１２被排斥后,体内试验中诱发了实验动物抗