特异性hTERT启动子在肿瘤细胞中启动效率研究

目的证明人端粒酶亚单位（hTERT）启动子可以引导目的基因在肿瘤细胞中表达。方法先使用RT-PCR检测各细胞系中hTERT mRNA的表达,再使用PCR方法扩增hTERT启动子基因的不同长度片段,并构建重组质粒,使用BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒并测序。最后使用Dual-Glo Luciferase Assay System激发荧光检测各细胞系中重组质粒中hTERT启动子的启动效率。结果 pGL3-204、pGL3-378、pGL3-1375重组质粒中的hTERT启动子序列与预期一致,质粒构建成功。hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒在H460中启动效率最强可以达到SV40启动子的80%,而在FRO、U251中启动效率可以达到SV40启动子的30%左右。hTERT全长启动子序列的启动效率在ARO细胞系中比pGL3-204、pGL3-378中的启动子片段启动效率强,而在FRO、H460和U251细胞系中pGL3-204中的启动子片段启动效率最强。结论 hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒,可以实现只在肿瘤细胞系中表达,但在正常细胞中不表达的效果。     

hTERT核心启动子调控的hNIS重组腺病毒的构建与鉴定

目的：构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子调控的人钠碘转运体（hNIS）基因重组腺病毒,并初步鉴定。方法：将hTERT核心启动子从hTERT/pcDNA3.1（＋）质粒中切出,亚克隆至含全长hNIS cDNA序列的质粒载体FL＊-hNIS/pcDNA3,应用限制性内切酶将hTERT-hNIS片段切出后连入穿梭质粒载体pAdTrack,应用AdEasy系统构建出重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS。同时,构建CMV启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV-hNIS作为阳性对照。应用RT-PCR方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性。结果：成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS并经PCR验证正确。RT-PCR证实hNIScDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来。结论：成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS;hTERT核心启动子在转染的肺癌A549细胞中具有转录活性。为下一步的碘治疗实验提供了实验依据。     

重组TRAIL基因真核表达载体的构建及其诱导喉癌细胞株Hep2凋亡的效应

目的: 研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。方法: 利用已有编码凋亡诱导功能区的TRAILcDNA片断的表达载体pRNDE2 -1和IL- 2信号肽基因序列, 扩增IL- 2信号肽基因和TRAIL基因的融合基因, 并克隆入真核表达载体pGL3 181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游, 构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人喉癌细胞株Hep2中, 以台盼蓝拒染法和基因组DNA琼脂糖凝胶电泳, 观察转染的Hep2细胞的凋亡。结果: 构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL, 其表达产物能诱导喉癌细胞Hep2凋亡。结论: 成功地构建了重组真核表达载体pGL3 181hTERT/TRAIL, 为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

人端粒酶催化亚单位hTERT基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

为构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)重组腺病毒载体,采用PCR法从pCI-neo-hTERT中钓取hTERT全长cDNA,定向克隆到pADTrack-CMV穿梭质粒。通过分步转化把pADEasy-1和重组穿梭质粒(pADTrack-hTERT)转化入BJ5183菌进行同源重组。hTERT重组腺病毒骨架质粒(pAD-hTERT)转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,收获重组腺病毒(AD-hTERT)提取DNA行PCR鉴定并扩增。经PCR、酶切和测序鉴定证实hTERT的cDNA正确插入穿梭质粒且与pADEasy-1正确同源重组;PCR鉴定及报告基因分析说明hTERT重组腺病毒包装正确且具有较好的感染活力。结果表明本研究已成功构建了hTERT重组腺病毒,为hTERT的神经保护作用研究奠定了基础。     

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子（hTERT）调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体，并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法：利用基因重组方法将TRAIL基因克隆人带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞，采用G418筛选获得阳性克隆；应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术（FCM）结合间接免疫荧光、RT—PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论：成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体，并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达，为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。     

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

 目的：设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II（IGF-II）基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建由重组人甲胎蛋白（hAFP）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法：根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果：实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论: 成功构建双重RNA聚合酶II启动子（hAFP及hTERT双启动子）调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。     

人端粒酶反转录酶启动子调控的microRNA-21海绵抑制剂慢病毒载体的构建及功能分析

目的 构建由人端粒酶反转录酶（hTERT）启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制。 方法 将hTERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成功的慢病毒载体Lenti-hTERT-miR-21-sp感染端粒酶阴性细胞HBE及端粒酶阳性肿瘤细胞A549、H1299,观察RFP的表达情况;同时在肿瘤细胞中检测抑制miR-21表达后对细胞生长、凋亡的影响;并应用含人类全长基因的cDNA表达谱芯片,对抑制miR-21表达后人肺癌细胞株A549中差异表达基因进行分析。 结果 经酶切及测序法鉴定慢病毒载体构建成功;将包装后获得的高滴度病毒颗粒感染目的细胞后,发现重组病毒只能在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性高表达,且下调miR-21基因表达后,肿瘤细胞的生长能力受到抑制,凋亡率明显上升（P<0.05）;与对照相比,抑制miR-21表达的A549细胞中差异表达的基因共有64条,其中20条上调,44条下调。 结论 hTERT启动子能够严格地引导病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性的封闭miR-21的表达,实现抑制肿瘤细胞生长的作用;芯片结果提示,miR-21引发肺癌可能是多因素多基因共同作用的结果。     

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。 目的：构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。 方法：按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322 bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7 kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。 结果与结论：提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。     

靶向性启动子携带报告基因NIS介导提高胶质瘤摄碘能力

目的 在细胞实验中探讨靶向性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子携带人类钠碘转运体(hNIS)基因能否提高胶质瘤的摄碘能力.方法 检测在hTERT启动子引导下表达hNIS基因的腺病毒,使用该腺病毒转染U87和U251细胞系,然后使用Υ记数仪检测转染后细胞的摄碘能力.结果 实验组肿瘤细胞在转染Ad-hTERT-hNIS后...     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。 目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。 方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。 结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性

为了探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体是否具有抑制HeLa细胞端粒酶活性的能力，人工合成2条64个核苷酸（nt）的片段，其中19nt与hTERT基因1789-1807位碱基同源，将其退火、连接到质粒psUPER中，构建psUP—hTE。在psUP—hTE基础上，把该质粒的启动子和64nt插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP—C1中生成pEGFP—hTE。从而获得新霉素抗性筛选质粒。将pEGFP—hTE用脂质体转染HeLa细胞，G418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代，用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、HeLa细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力。结果显示，pEGFP—hTE转染的HeLa细胞与对照组比较，hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38％，但细胞增殖能力没有明显改变。以上结果表明，pEGFP—hTE能通过RNA干扰（RNAi）途径特异性抑制HeLa细胞hTERT基因的表达，从而有效抑制细胞端粒酶话性，这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径。