不同力达霉素与抗VI型胶原酶单抗偶联物的抗肿瘤作用

研究不同偶联方法制备的力达霉素(LDM)与抗IV型胶原酶单抗3G11免疫偶联物的选择性抗肿瘤作用。采用SPDP和SMBS作为偶联剂,将LDM辅基蛋白69位赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩修饰的单抗3G11连接,制备免疫偶联物;ELISA法测定偶联物的免疫活性,克隆形成法及人HT-1080细胞免疫缺陷小鼠移植模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,3G11-SMBS-LDM对体外培养的HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和3G11-SPDP-LDM。动物实验显示,LDM在等摩尔剂量条件下3G11-SMBS-LDM的抑瘤率为86.1%,游离的LDM组为71.2%,3G11-SPDP-LDM组为77.1%,3G11-SMBS-LDM的抑制作用显著增强。3G11-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为163.7%,3G11-SPDP-LDM组为125.3%,LDM组为71.9%,3G11-SMBS-LDM能显著延长荷瘤鼠的生存期,两个偶联物之间有显著性差异。3G11-SMBS-LDM偶联物更具有选择性抗肿瘤作用,疗效显著提高,荷瘤动物生存期延长,毒性明显降低,可能成为新的肿瘤治疗药物。     

不同力达霉素与抗Ⅵ型胶原酶单抗偶联物的抗肿瘤作用

研究不同偶联方法制备的力达霉素（LDM）与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11免疫偶联物的选择性抗肿瘤作用。采用SPDP和SMBS作为偶联剂，将LDM辅基蛋白69位赖氨酸与2-亚氨基四氢噻吩修饰的单抗3G11连接，制备免疫偶联物；ELISA法测定偶联物的免疫活性，克隆形成法及人HT-1080细胞免疫缺陷小鼠移植模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。偶联物保留了单抗3G11对Ⅳ型胶原酶的免疫活性，3G11-SMBS-LDM对体外培养的HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和3G11-SPDP-LDM。动物实验显示，LDM在等摩尔剂量条件下3G11-SMBS-LDM的抑瘤率为86.1%，游离的LDM组为71.2%，3G11-SPDP-LDM组为77.1%，3G11-SMBS-LDM的抑制作用显著增强。3G11-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为163.7%，3G11-SPDP-LDM组为125.3%，LDM组为71.9%，3G11-SMBS-LDM能显著延长荷瘤鼠的生存期，两个偶联物之间有显著性差异。3G11-SMBS-LDM偶联物更具有选择性抗肿瘤作用，疗效显著提高，荷瘤动物生存期延长，毒性明显降低，可能成为新的肿瘤治疗药物。     

抗IV型胶原酶单抗与平阳霉素新型免疫偶联物的抗肿瘤作用

目的考察抗IV型胶原酶单抗3G11与平阳霉素(PYM)偶联物的抗肿瘤作用。方法采用多聚谷氨酸(PLG)为中间载体制备3G11-PLG-PYM偶联物,MTT法测定其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,以小鼠移植性肝癌H22为模型观察体内抗肿瘤作用。结果偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,对体外培养H22和KB细胞的杀伤作用弱于PYM。动物实验中PYM10mg·kg-1对H22肝癌的抑制率为60·6%,而等细胞毒性剂量的3G11-PLG-PYM偶联物抑瘤率达到90·8%,与PYM相比可显著延长小鼠的中位生存时间。结论3G11-PLG-PYM偶联物对小鼠肝癌H22的抑瘤作用比PYM强,可能成为新型的抗肿瘤靶向药物。     

抗IV型胶原酶单抗与平阳霉素新型免疫偶联物的抗肿瘤作用

目的考察抗IV型胶原酶单抗3G11与平阳霉素(PYM)偶联物的抗肿瘤作用。方法采用多聚谷氨酸(PLG)为中间载体制备3G11-PLG-PYM偶联物,MTT法测定其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,以小鼠移植性肝癌H22为模型观察体内抗肿瘤作用。结果偶联物保留了单抗3G11对IV型胶原酶的免疫活性,对体外培养H22和KB细胞的杀伤作用弱于PYM。动物实验中PYM 10 mg·kg^-1对H22肝癌的抑制率为60.6%,而等细胞毒性剂量的3G11-PLG-PYM偶联物抑瘤率达到90.8%,与PYM相比可显著延长小鼠的中位生存时间。结论3G11-PLG-PYM偶联物对小鼠肝癌H22的抑瘤作用比PYM强,可能成为新型的抗肿瘤靶向药物。     

抗癌抗生素力达霉素与抗IV型胶原酶单链抗体的基因工程组装融合蛋白

目的　以IV型胶原酶为靶点 ,研制兼具有抗肿瘤侵袭转移和强烈杀伤肿瘤细胞的新型单抗导向药物。方法　力达霉素 (LDM)分子由力达蛋白 (LDP)和力达发色团 (LDC)两部分组成。从基因工程转化菌中提取融合蛋白 (LDP Fv)并与LDC组装重建 ,制备高效抗癌抗生素力达霉素与单链抗体的组装融合蛋白 (LDM Fv)。通过ELISA、酶谱分析、Boyden小室体外侵袭实验及克隆形成测定 ,观察其生物学活性。结果　LDM Fv能特异性与肿瘤细胞的IV型胶原酶结合并抑制其活性 ,LDP Fv有阻断肿瘤细胞侵袭的能力 ,但无细胞毒性 ,加入LDC制成的组装融合蛋白LDM Fv对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用 ,并明显强于丝裂霉素和阿霉素。结论　LDM Fv可能成为一种新型高效、小型化抗肿瘤导向药物     

抗癌抗生素力达霉素与抗IV型胶原酶单链抗体的基因工程组装融合蛋白

目的　以IV型胶原酶为靶点,研制兼具有抗肿瘤侵袭转移和强烈杀伤肿瘤细胞的新型单抗导向药物。方法　力达霉素(LDM)分子由力达蛋白(LDP)和力达发色团(LDC)两部分组成。从基因工程转化菌中提取融合蛋白（LDP-Fv）并与LDC 组装重建,制备高效抗癌抗生素力达霉素与单链抗体的组装融合蛋白（LDM-Fv）。通过ELISA、酶谱分析、Boyden 小室体外侵袭实验及克隆形成测定,观察其生物学活性。结果　LDM-Fv能特异性与肿瘤细胞的IV型胶原酶结合并抑制其活性,LDP-Fv有阻断肿瘤细胞侵袭的能力,但无细胞毒性,加入LDC制成的组装融合蛋白LDM-Fv对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,并明显强于丝裂霉素和阿霉素。结论　LDM-Fv可能成为一种新型高效、小型化抗肿瘤导向药物。     

抗Ⅳ型胶原酶抗体Fab'片段力达霉素偶联物的抗肿瘤侵袭转移作用

本研究拟阐明力达霉素(LDM)与抗Ⅳ型胶原酶单抗小型化免疫偶联物Fab'-LDM的抗肿瘤侵袭转移作用。采用Boyden小室体外侵袭实验,检测Fab'-LDM免疫偶联物对人纤维肉瘤HT-1080细胞侵袭能力的影响;进一步采用明胶酶谱实验研究其对MMP-2和MMP-9分泌的影响,以及RT-PCR法检测其对TIMP-1 mRNA表达水平的影响;应用裸鼠体内移植人纤维肉瘤HT-1080模型,探讨Fab'-LDM对肿瘤的生长抑制作用。Boyden小室体外侵袭结果表明,Fab'-LDM对HT-1080侵袭转移存在剂量依赖性抑制作用:Fab'-LDM(5和10 nmol.L-1)的侵袭抑制作用分别达到(60±12)%和(79±11)%。明胶酶谱实验证实,Fab'-LDM偶联物(5和10 nmol.L-1)对MMP-2和MMP-9型明胶酶分泌的抑制作用达到(42±8)%、(54±6)%和(57±3)%、(87±1)%。同时RT-PCR检测显示,10 nmol.L-1 Fab'-LDM显著提高TIMP-1 mRNA表达水平。体内实验显示,与对照相比,Fab'片段组、LDM组和Fab'-LDM组的肿瘤生长抑制率分别为:(30±1...     

力达霉素-单抗Fab'片段不同连接偶联物的抗肿瘤作用比较

研究力达霉素与抗Ⅳ型胶原酶单抗的不同连接键的小型化免疫偶联物的抗肿瘤作用。制备长短链的二硫键以及硫醚键抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的Fab'片段连接的免疫偶联物,ELISA法测定偶联物的免疫活性,体外细胞克隆形成测定和体内荷瘤裸小鼠模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。体外研究显示,Fab'-LDM偶联物部分保留了抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11对抗原的亲和力,硫醚键偶联物对体外培养的人纤维肉瘤HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和二硫键偶联物。实验结果显示,LDM等剂量条件下硫醚键偶联物Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组的抑瘤率分别为87.7%和78.0%,二硫键偶联物Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为74.8%和72.3%,游离LDM组为70.9%,相比较长连接键的硫醚键偶联物抑瘤作用显著增强。Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为165.8%和145.2%,Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为82.2%和107.5%,LDM组为71.9%。与二硫键偶联物组比较...     

平阳霉素与单克隆抗体Fab'片段偶联物的抗肿瘤作用

目的研制一种以单抗Fab'片段为基础的抗肿瘤导向药物.方法制备单抗3A5 Fab'片段及其与平阳霉素(PYM)偶联物Fab'-PYM后,测定Fab'-PYM与肿瘤细胞的免疫反应性、偶联物中PYM的抑菌活性、对肿瘤细胞的杀伤作用和体内抑瘤作用.结果 Fab'及Fab'-PYM保持了与靶细胞C26的免疫反应性;偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的15%;Fab'-PYM对C26细胞的杀伤作用强于PYM;对非靶细胞KB的杀伤作用与PYM相似;ip和iv给药,Fab'-PYM对小鼠皮下接种的肠癌26生长抑制作用均强于3A5-PYM和PYM.结论 Fab'-PYM具有比PYM及3A5-PYM更强的体内外抗肿瘤作用.     

平阳霉素与单克隆抗体Fab′片段偶联物的抗肿瘤作用

目的　研制一种以单抗Fab′片段为基础的抗肿瘤导向药物。方法　制备单抗3A5 Fab′片段及其与平阳霉素(PYM)偶联物Fab′-PYM后,测定Fab′-PYM与肿瘤细胞的免疫反应性、偶联物中PYM的抑菌活性、对肿瘤细胞的杀伤作用和体内抑瘤作用。结果　Fab′及Fab′-PYM保持了与靶细胞C26的免疫反应性;偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的15%;Fab′-PYM对C26细胞的杀伤作用强于PYM;对非靶细胞KB的杀伤作用与PYM相似;ip和iv给药,Fab′-PYM对小鼠皮下接种的肠癌26生长抑制作用均强于3A5-PYM和PYM。结论　Fab′-PYM具有比PYM及3A5-PYM更强的体内外抗肿瘤作用。     

蓖麻蛋白A链与单抗3G11偶联物的制备及体外生物活性研究

目的:Ⅳ型胶原酶在肿瘤生长和转移的多个环节发挥着重要作用.将抗Ⅳ型胶原酶单克隆抗体3G11与蓖麻毒素A链(RA)偶联形成免疫毒素(ITs),并评价了该偶联物的体外生物活性.方法:从蓖麻籽中提取纯RA,与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)修饰的单抗3G11偶联,进一步纯化后得到3G11-RA.以ELISA实验测定ITs的免疫反应性,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)实验对其体外细胞毒性进行评价.结果:ITs基本保持了单抗3G11对人肝癌细胞BEL-7402的免疫反应性,其对BEL-7402的细胞毒性比RA显著增强近50倍,而对人正常肝细胞LO2的毒性与RA相似.结论:3G11-RA免疫毒素对BEL-7402肝癌细胞具有较好的免疫反应性和体外细胞毒性.     

紫杉醇与抗HER2单抗Sc7301偶联物对肿瘤细胞株的体外杀伤效应

目的：研究紫杉醇（TAX）与抗HER2单抗Sc7301偶联物对HER2表达阳性肿瘤细胞的特异性杀伤作用，为进一步研究卵巢癌靶向治疗奠定基础。方法：采用活化酯法制备紫杉醇与抗HER2单抗Sc7301的免疫偶联物；ELISA法检测TAX与Sc7301偶联后抗体活性的变化；四氮唑蓝（MTT）法观察TAX—Sc7301偶联物的抗肿瘤作用；流式细胞仪检测凋亡细胞比率。结果：偶联后抗体的活性保持为原有活性的54．8％以上，抗体的活性基本保持；偶联物NTT试验中，对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的抑制作用为相同剂量TAX与Se7301的混合物的2～3倍，而对HER2表达阴性的人肝癌细胞株HepO2的作用则较混合物相差不大；流式细胞仪观察随偶联物浓度的升高，细胞的亚二倍体凋亡峰越明显。结论：TAX与Sc7301的偶联物在体外可选择性杀伤HER2表达阳性的肿瘤细胞。     

治疗性抗体的基础研究

抗体的靶向性提供了一个改进治疗制剂选择性的方法 .由于大部分抗原均可诱生抗体 ,因此抗体应用的潜力是巨大的 .临床上正用于治疗肿瘤 ,病毒感染 ,自身免疫病 ,中毒性休克 ,再狭窄 ,Rh溶血症和抗移植排斥等 .但单克隆抗体的临床应用受一定限制 ,主要障碍是诱导产生人抗鼠抗体(HAMA反应 ) ,肿瘤参入量低 ,亲和力低和半衰期短等 .然而 ,利用分子生物学技术能克服这些障碍 ,改善临床效果     

蓖麻毒蛋白A链与抗表皮生长因子受体单克隆抗体偶联物的抗肿瘤效应

目的：将蓖麻毒蛋白（ricin）A链（RTA）与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）mab偶联形成免疫毒素（immunotoxin,IT）,并评价该偶联物的体外抗肿瘤作用。方法：从蓖麻籽中提纯RTA,采用N-琥珀酰胺-3-（2一吡啶二硫）丙酸酯[N—succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）-pm—pionate,SPDP]为偶联剂制备ITEGFRmab．RTA,以SDS—PAGE检测RTA的提取及IT的偶联,以DAB显色法检测IT对人肝癌HepG2细胞的结合能力,以间接ELISA方法测定IT的免疫反应性,以CCK-8法测定IT的体外抗肿瘤作用。结果：RTA从蓖麻籽中提取后,与EGFRmab成功偶联。IT基本保留了EGFRmab对HepG2细胞的结合能力和免疫反应性,及对HepG2细胞和L02细胞表现了不同的体外细胞毒作用。结论：EGFRmab—RTA具有特异性抑制肝癌细胞增殖的作用,有望成为新型的抗肝癌药物。