乙型肝炎病毒X蛋白上调HepG2细胞中SMYD3的表达

目的 探讨HBV是否通过调控组蛋白甲基化酶SMYD3的表达参与肝癌细胞的恶性生物学行为.方法 通过向肝癌细胞HepG2转染HBx筛选出表达HBx蛋白的细胞株HepG2-HBx.用激光共聚焦定位细胞内HBx蛋白和SMYD3蛋白的表达;实时逆转录PCR、Western blot检测转染HBx前后HepG2细胞中SMYD3 mRNA和蛋白质的表达水平;流式细胞仪检测转染HBx前后HepG2细胞增殖、凋亡的变化情况.对数据进行单因素方差分析. 结果 HBx转染后HepG2细胞中SMYD3 mRNA和蛋白质表达水平明显上调(SMYD3 mRNA:0.18±0.05与0.98±0.15,F=37.240,P<0.05;SMYD3蛋白:0.28±0.03与0.58±0.06,F=21.042,P<0.05).转染HBx后HepG2细胞凋亡率下降(7.90%±0.42%与2.23%±0.14%,P<0.01),细胞增殖能力增强(28.46%±4.33%与36.46%±0.17%,P<0.01).结论 乙型肝炎病毒X蛋白能够上调HepG2细胞中SMYD3 mRNA和蛋白质表达水平;HBx可能通过SMYD3-组蛋白甲基化途径抑制HepG2细胞凋亡、促进细胞增殖.     

乙型肝炎病毒X基因转染人肝癌细胞株双向凝胶电泳图谱分析

目的 研究转染HBV X基因的人肝癌细胞株中蛋白质表达谱的改变,为筛查在HBV相关性肝细胞癌发生中发挥重要作用的关键蛋白质分子奠定基础.方法 利用分子生物学方法建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2+HBx,同时设空载体peDNA3转染细胞HepG2-pcDNA3及HBV全基因转染的人肝癌细胞株HepG2.2.15为对照.PCR法扩增Neo基因检测质粒DNA片段的插入,免疫印迹法检测HBx蛋白的表达.利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离3种肝癌细胞株HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15的总蛋白,用图像分析软件比较、分析、识别细胞间的差异表达蛋白质.统计学分析采用t检验.结果 获得分辨率高、重复性好的3种细胞的双向电泳(2-DE)图谱.软件分析表明,HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15细胞的2-DE凝胶可识别蛋白点分别为(2 095±137)、(2 188±105)和(2 109±20)个.比较HepG2-pcDNA3与HepG2-HBx细胞的2-DE图谱发现37个差异显著的蛋白点,其中21个在HepG2-HBx表达上调,16个下调.6个表达量差异在5倍以上(t=0.027,P＜0.05);HepG2.2.15与HepG2-HBx细胞相比,有38个差异显著的蛋白点,其中35个在HepG2-HBx细胞中上调,3个下调,14个表达量差异在5倍以上(t=0.031,P＜0.05).结论 HBx基因转染引起人肝癌细胞株蛋白质表达谱的变化,可能与感染的肝细胞发生恶性转化的分子生物学机制有关.     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞脂代谢相关基因表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)对脂质代谢相关基因的影响及其在肝细胞脂肪变性发生中的作用. 方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBX转染入HepG2细胞中,建立表达HBX的HepG2/HBx细胞模型;以转染空载体pIRES2-eGFP (HepG2/pIRES2细胞)及未转染的HepG2细胞作为对照.转染后24、48、72 h,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达;检测细胞内甘油三酯含量;RT-PCR方法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和肝X受体(LXR)αmRNA表达水平;Western blot检测HBX,LXRα及脂肪酸合成酶(FAS)蛋白表达的变化.多组间比较采用成组设计的方差分析,多组间的两两比较采用q检验;各基因表达量之间的关系采用Pearson相关分析.结果 在转染后24、48、72 h,HepG2/HBx细胞和HepG2/pIRES2细胞中有GFP的表达并随时间延长而增多、增强,仅在HepG2/HBx细胞内有HBx表达,并且随时间的延长而逐渐增加,差异有统计学意义(F= 32.21,P＜0.05),提示成功建立HepG2/HBx细胞模型;在转染后24、48、72h,HepG2/HBx细胞内LXRαmRNA相对表达量分别为0.386±0.055、0.505±0.071、0.649±0.058,SREBP-1 mRNA相对表达量分别为0.395±0.055、0.548±0.047、0.795±0.058; LXRα蛋白的相对表达量分别为0.178±0.036、0.263±0.047、0.347±0.058,FAS蛋白相对表达量分别为0.436±0.055、0.608±0.053、0.827±0.046,各相同时间点均较对照组明显增加(P＜0.05或P＜ 0.01),并均随时间的延长而逐渐增多(P＜ 0.05或P＜0.01),且与HBX表达量均呈正相关(rLXPα= 0.994,rSREBP-1= 0.984,r' LXRα=0.989,rFAS=0.991,P＜0.05).HepG2/HBX细胞内TG含量与对照组相比,差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 HBx-LXR α -SREBP- 1/FAS通路可能参与了调节脂质代谢相关基因的转录和表达,可能是引起肝细胞脂肪变发生的重要分子机制之一.     

HBx基因下调p21对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建转基因细胞模型HepG2/HBx,观察HBx基因对HepG2细胞增殖、周期和凋亡的影响, 探讨细胞周期蛋白P21在其中的作用和意义.方法:应用脂质体转染和G418筛选构建稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx,RT-PCR和Western blot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达.分别以四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术检测HepG2/HBx细胞及对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞(转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞)的增殖、周期和凋亡.另半定量RT-PCR检测各组细胞中细胞周期蛋白P21与抑癌基因p53mRNA的表达.结果:HepG2/HBx细胞中有HBx mRNA和蛋白的表达.HepG2/HBx细胞生长速度加快.HepG2/HBx中G0/G1期细胞比例较对照组显著减少(43.34%±3.11%vs57.69±4.28%,P<0.01),S期细胞比例明显增加(28.69%±1.17%vs22.41%±1.99%,P<0.05),同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低(1.19%±0.06%vs 5.43%±0.42%, P<0.001).细胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx细胞中的表达较对照组细胞显著降低(0.16±0.05vs0.78±0.15,P<0.001),而p53表达则无显著变化.结论:HBx基因可下调细胞周期蛋白P21mRNA的表达,可能参与HBx基因加速HepG2细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的作用.     

慢病毒介导HBV X基因稳定表达HepG2细胞系的建立

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(HBV X)重组慢病毒表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)的HepG2细胞系.方法:应用PCR法从质粒pIERES2-EGFP-HBV中扩增X基因片段,克隆至慢病毒载体pZac2.1,应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,RT-PCR、免疫组织化学、Western blot鉴定HBx的表达.结果:酶切鉴定和基因序列测定证实长度为489bp的HBx基因成功克隆至慢病毒表达载体pZac2.1-HBx;重组慢病毒经包装、纯化后获得滴度为1×108TU/mL,通过感染HepG2细胞株和嘌呤霉素筛选,8-10d形成生长形态良好的单克隆细胞株HepG2-HBx;RT-PCR鉴定显示细胞株HepG2-HBx在3d,14d,30d和2mo后均可见稳定表达的HBx mRNA;利用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法鉴定,细胞株HepG2-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBV X重组慢病毒载体,获得稳定表达HBx的HepG2细胞系,为进一步研究HBx的生物学功能及致病机制提供细胞模型.     

乙型肝炎病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)及其两个截短体(HBx1 ～ 101、HBx43～ 154)与损伤DNA结合蛋白(DDB)1在HBV复制中的作用.方法 用质粒瞬时转染HepG2细胞,72 h后分别提取细胞总蛋白质和总RNA,通过Western blot分析验证DDB1蛋白表达,逆转录实时定量PCR在基因的mRNA水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白表达的影响.提取转染72 h后细胞胞质DNA,收集细胞的培养上清液,通过实时定量PCR及酶联免疫吸附试验检测各组细胞胞质HBV DNA复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平,从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响.对数据进行单因素方差分析及t检验.结果 在有HBV复制的HepG2细胞中,缺失HBx转染组细胞中DDB1蛋白在mRNA水平明显下降(相对表达水平为野生型转染组的52.74％±8.95％,t=9.143,P＜0.05),胞质DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平也明显下降(相对表达水平分别为野生型转染组的55.49％±1.19％、48.05％±2.90％、46.22％±2.20％,P值均＜0.05).共转染HBx N-端截短体HBx43～54后细胞中DDB1蛋白mRNA水平恢复到野生型水平,且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBV DNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平.但共转染HBx C-端截短体HBx1 ～ 101的细胞中DDB1蛋白在mRNA水平较野生组明显下降(相对表达水平为野生型转染组的59.95％±9.09％,t=7.629,P＜0.05),且不能使转染缺失HBx蛋白的HepG2细胞中胞质HBVDNA的复制及培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg的表达恢复到野生型水平(相对表达水平分别为野生型转染组的62.53％±0.67％、63.13％±2.14％、55.40％±0.99％,P值均＜0.05).并且各转染组DDB1蛋白mRNA水平变化与胞质HBV DNA复制和培养上清液中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平是一致的.结论 C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是需要的,而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响.C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的.     

乙型肝炎表面抗原主蛋白对HepG2细胞脂代谢基因表达的影响

目的 研究HBsAg主蛋白对肝细胞中脂代谢基因表达的影响. 方法 将PCR扩增C型HBV主S基因(SHBs)定向克隆至pcDNA3.1(+)载体中,重组质粒pcDNA3.1-SHBs与pcDNA3.1分别转染HepG2细胞,筛选出稳定转染细胞株.用实时定量PCR和Western blot法检测两细胞株中脂代谢相关基因mRNA及蛋白水平表达差异. 结果 成功建立稳定表达SHBs的细胞株HepG2-pn3.1-SHBs及空质粒对照细胞株HepG2-pn3.1-neo.实时定量PCR检测相关基因表达差异结果显示:HepG2-pn3.1-SHBs细胞组中基因烯酰辅酶A水合酶、载脂蛋白A、脂蛋白脂酶mRNA相对表达水平较低,分别与HepG2-pn3.1-neo细胞组比较(0.161±0.043对比0.210±0.022,t=2.479;0.031±0.007对比0.094±0.055,t=2.752;0.770±0.036对比0.982±0.031,t=10.914),P值均＜0.05,差异均有统计学意义;而HepG2-pn3.1-SHBs细胞组基因乙酰辅酶A羧化酶、胆固醇调节元件结合蛋白-1c mRNA相对表达水平较高,分别与HepG2-pn3.1-neo细胞组比较(0.113±0.027对比0.059±0.022,t=-3.757;0.019±0.002对比0.015±0.001,t=-4.330),P值均＜0.05,差异均有统计学意义.两组肉毒碱脂酰辅酶A转移酶-1、过氧化物酶体增生物激活受体α的基因转录水平比较,差异虽无统计学意义,但呈减弱趋势.Westem blot结果显示上述基因蛋白水平的变化趋势与mRNA水平一致.结论 SHBs能改变脂肪酸合成,分解相关基因的表达,但HBsAg是否直接导致肝细胞脂肪变性尚不明确,值得进一步研究.     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制p16蛋白表达及其促进HepG2肝癌细胞生长

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝癌细胞生长的影响及其机制.方法 以HepG2细胞和稳定表达GFP/HBx融合蛋白的HepG2/GFP-HBx为实验细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞吸光度值A490,分析细胞生长增殖;流式细胞术检测细胞周期;甲基化PCR检测细胞p16INK4A基因的甲基化;Western blot检测p16蛋白表达水平. 结果 72 h时HepG2/GFP-HBx细胞组的A490为3.225±0.038,分别与HepG2和HepG2-GFP细胞组的2.012±0.022、2.038±0.029比较,增殖能力明显增强,t值分别为46.86和42.51,P值均＜0.001,差异均有统计学意义.流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx细胞组的G0/G1期细胞占16.45％±0.45％,明显低于HepG2和HepG2/GFP细胞组的44.81％±1.36％、42.76％±1.58％,t值分别为-34.22和-28.88,P值均＜ 0.001,差异均有统计学意义.而5-氮-2 '-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理的HepG2/GFP-HBx细胞G0/G1期细胞比例为33.25％±0.79％,较未处理HepG2/GFP-HBx细胞组的16.45％±0.45％显著增加,两组比较,t=31.85,P＜0.001,差异有统计学意义.甲基化PCR检测显示HepG2/GFP-HBx细胞组发生了p16INK4A基因甲基化,而HepG2和HepG2-GFP细胞组及5-Aza-CdR处理的HepG2/GFP-HBx细胞组未检测到p16INK4A基因启动子甲基化.Western blot检测示HepG2/GFP-HBx细胞组p16蛋白水平低于HepG2和HepG2/GFP细胞组,而5-Aza-CdR处理HepG2/GFP-HBx细胞后,p16蛋白水平高于未处理的HepG2/GFP-HBx细胞. 结论 HBx蛋白可通过缩短HepG2细胞生长的G0/G1期而加快细胞周期进程,从而促进肝癌细胞生长增殖,其机制可能与HBx蛋白诱导p16INK4A基因启动子甲基化及抑制p16蛋白表达有关.     

Wnt诱导分泌型蛋白1:研究乙型肝炎诱发肝癌的新途径

目的 观察由乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)引起的HepG2细胞内Wnt诱导分泌型蛋白1 (WISP-1)的变化,探索HBV诱发肝癌的机制. 方法 收集肝癌、癌旁及正常肝组织标本,用免疫组织化学法检测标本中HBX和WISP-1的表达差异.设立2个实验组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(Gx)组和稳定转染空载体pc-DNA3.1(+)HepG2细胞(G0)组.同时用PCR和Western blot检测两组细胞中WISP-1的表达.计数资料样本率比较用x2检验;计量资料均数的比较用t检验和单因素方差分析;相关分析采用Spearman秩相关系数检验. 结果 肝癌组织中WISP-1的表达阳性率为76.6％,较癌旁组织的23.4％及正常肝组织的0明显增高,x2=35.967,P＜0.01,差异有统计学意义.Gx细胞中WISP-1 mRNA和蛋白的相对表达水平分别为1170.33±41.26、240.33±11.37,与G0细胞中WISP-1的mRNA和蛋白相对表达水平265.34±27.47,40.33±7.09比较;t=31.625,F=600.565,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.结论 WISP-1基因在肝癌中呈高表达,HBV感染肝细胞后,其HBX可通过上调WISP-1的表达水平引起肝癌的发生.     

乙型肝炎病毒X蛋白和环氧合酶-2与乙型肝炎相关肝癌微血管生成和转移的关系及其可能机制

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)、环氧合酶-2(COX-2)在乙型肝炎相关性肝细胞肝癌(HCC)组织微血管生成和转移中的关系及其可能的调节机制. 方法选择84例乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织和22例非乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织,免疫组织化学法检测HBX、COX-2及血管内皮细胞表面抗原(CD34)的表达,光镜下记录微血管计数(MVD).Spearman相关性分析HBX、COX-2与乙型肝炎相关性HCC组织微血管生成及转移中的关系; Western blot和RT-PCR检测稳定转染HBX肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中COX-2的变化;酶联免疫吸附法检测HepG2-X培养上清液中前列腺素E2(PGE2)表达水平及不同浓度(10、30、50 μ mol/L和70 μmol/L)COX-2选择性抑制剂塞来昔布作用后PGE2的表达水平;锥虫蓝拒染法检测细胞生长速度.结果 乙型肝炎相关性HCC组织中HBx、COX-2均高表达,HBx阳性表达组中COX-2阳性率为88.87%(55/62),明显高于HBx阴性组的31.82%(7/22,x2=27.188,P＜0.01)和非乙型肝炎相关性HCC组40.91%(9/22,x2=20.453,P＜0.01);HBx阴性表达的乙型肝炎相关性HCC组和非乙型肝炎相关性HCC组中COX-2阳性表达率差异无统计学意义(x2=0.393,P=0.531); HBx和COX-2在转移组表达高于无转移组(P＜0.01);HBx及COX-2的阳性表达组平均MVD值均明显高于HBx阴性组和非乙型肝炎相关性HCC组(P＜0.05),且转移组MVD高于无转移组(P＜0.01);门静脉侵犯组高于非侵犯组(P＜0.01);Spearman相关性分析结果提示HBx、COX-2在乙型肝炎相关性HCC组织微血管生成及转移中的表达呈正相关(Rs=0.568,P＜0.01);在HepG2-X细胞中,COX-2蛋白及mRNA表达水平与转染空载体的对照肝癌细胞HepG2 (空载体转染HepG2细胞,HepG2-PC)相比,均显著提高,并且细胞培养上清液中PGE2表达水平也显著提高;和转染空载体的对照细胞相比,塞来昔布对转染HBx基因的细胞分泌PGE2具有更强的抑制作用.结论 HBx、COX-2在乙型肝炎相关性HCC中有较高的表达水平,二者呈正相关,与HCC微血管生成和侵袭转移密切相关.COX-2可能是HBx促使肝癌组织微血管生成和转移的一个重要中间分子,其可能的调节机制是通过HBx、COX-2及PGE2作为信号转导通路在HCC的浸润与迁移,在微血管生成与转移的过程中发挥双重作用.     

乙型肝炎病毒x影响肝细胞增殖与凋亡的初步研究

目的 观察乙型肝炎病毒x(HBx)导入正常肝细胞后对细胞周期及凋亡的影响,探讨HBx致肝细胞癌的发生机制.方法 应用脂质体转染重组质粒pcDNA3.1( )/v5-hisB-HBx后,G418筛选获得阳性克隆L02/HBx,分别用RT-PCR和Western blot鉴定其HBx mRNA与蛋白的表达.噻唑蓝比色法(MTT)及细胞生长曲线观察细胞增殖情况,流式细胞术分析其细胞周期特征与凋亡率.结果 构建的L02/HBx细胞中可稳定表达HBx mRNA及蛋白.与对照组比较,L02/HBx细胞增殖速度明显加快(P＜0.05);其G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例显著增加,凋亡率明显降低(P＜0.05).结论 成功构建稳定表达HBx的转基因细胞株L02/HBx,初步显示HBx可促进肝细胞增殖,抑制细胞凋亡,从而加速细胞周期进程,可能参与肝细胞的恶性转化.     

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。     

Involvement of the NF-κB pathway in multidrug resistance induced by HBx in a hepatoma cell line

It is widely believed that hepatocellular cancer (HCC), especially HBV associated HCC, is highly resistant to chemotherapy. To investigate the molecular influence of HBx protein on multidrug resistance (MDR) in HCC and the potential role of the NF-κB pathway in this process. We established HBx-expressing cells by liposome-mediated transfection of the HBx into the HepG2 cell line. We found that HBx expression in HCC cells induces drug resistance against multiple drugs, a significantly lower apoptosis ratio in HepG2-HBx and HepG2.2.15 cells, compared with HepG2 and HepG2-3.1 cells (P < 0.05) after treating with 5-FU or adriamycin. And compared with the control group, the HBx-transfected cells showed a higher expression of MDR-associated and anti-apoptotic genes. Furthermore, we found that the NF-κB activity was remarkably high in the HBx-expressing cells as measured by p65 nuclear localization. In addition, the upregulated anti-apoptotic genes, Gadd45b and Survivin, in HBx-expressing HCC cells were downregulated by IMD-0354 treatment, which is the NF-κB pathway inhibitor. Taken together, these results suggest that HBx protein might be one of the causes for the occurrence of MDR in HCC, and the NF-κB pathway might be involved in this change.     

siRNA靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响

背景：肝癌衍生生长因子（HDGF）分离自人肝癌细胞株,其功能特性与多种肿瘤的生长、侵袭、转移和预后相关。目的：观察以小干扰RNA（siRNA）靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响。方法：以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测人肝癌细胞株HepG2HDGFmRNA表达。构建靶向HDGF的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体．转染HepG2细胞．建立稳定表达siRNA-HDGF的HepG2细胞株。蛋白质印迹法检测siRNA—HDGF的干扰效率。MTT实验和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖情况,Boyden小室体外侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果：HepG2细胞中HDGFmRNA表达明显。蛋白质印迹法筛选出的干扰效率为75-3％的HepG2细胞株．生长速度较转染阴性对照载体和未转染载体的细胞显著减慢（P〈0．05）,在软琼脂上形成的集落数减少（9．64±1．62对36．41±1．68和35．50±3．27,P〈0．05）,穿过Boyden小室Matrigel基质胶的细胞数亦显著减少（51．27±6．53对153．80±10．04和154．33±10．23,P〈0．05）。结论：以siRNA靶向抑制HDGF基因能显著抑制人肝癌细胞株的增殖和侵袭力．HDGF可能成为肝癌基因治疗的重要靶标。