共聚焦显微镜观测血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞纤维粘连蛋白的影响

目的　通过共聚焦显微镜观测血管紧张素 ( angiotensin ,Ang )对体外培养的牛眼小梁细胞纤维粘连蛋白 ( fibronectin)的影响来探讨 Ang 在青光眼发病机制中的意义。方法　体外培养的牛眼小梁细胞分别以 10 - 7、10 - 8mol· L- 1 Ang 以及受体拮抗剂孵育 2 4h,以间接免疫荧光法行纤维粘连蛋白染色后用共聚焦显微镜观测并定量分析。结果　 10 - 7m ol· L- 1组和 10 - 8m ol· L- 1组纤维粘连蛋白荧光强度明显高于受体拮抗剂组和对照组。结论　 Ang 在体外培养条件下可引起牛眼小梁细胞纤维粘连蛋白合成增加 ,可能导致细胞外基质在小梁网的堆积而引起房水引流阻力的增加 ,此效应可被 AT1 受体拮抗剂部分阻断。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞微管及微丝动力学影响的研究

目的 研究血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的牛眼小梁细胞骨架的动力学影响,探讨AngⅡ对房水的调节作用及在青光眼发病机制中的意义。方法 （1）牛眼小梁细胞的体外培养,应用免疫组化方法（NSE,Ⅷ因子相关抗原染色）细胞鉴定,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;（2）以含不同浓度AngⅡ-的培养液孵育小梁细胞12-24h,（终浓度分别是10^-5、10^-6、10^-7mol.L^-1)。免疫组化法（SABC）对α-smooth-actin、tubulin-α染色,结果以计算机图像分析系统分析,并统计学检验。结果 牛眼小梁细胞培养成功,成活率80%——100%,上皮型为主,AngⅡ产生明显的细胞收缩效应,actin是收缩的主要效应器。结论 体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术,AngⅡ可以引起小梁细胞的浓度依赖性的收缩,提示Ang可能是房水排出途径的调节姻子之一,对眼压及青光眼的发生发展有一定的影响。     

上皮状牛眼小梁细胞选择性体外培养

目的建立上皮状牛眼小梁细胞体外培养的方法。方法用DME培养液加10％胎半血清选择性培养上皮状牛眼小梁细胞．结果（1）原代和传1、传2代牛眼小粱细胞生长不稳定，传3～7代牛眼小梁细胞生长旺盛；（2）原代细胞和传代细胞汇合前其形态可是多种多样，汇合后均为单层上皮状小梁细胞。结论（1）牛眼小梁组织丰富，解剖清楚，体外培养易生长；（2）选择性培养可得到单纯上皮状牛眼小梁细胞，更易与邻近组织细胞相区别。     

体外培养人眼小梁细胞Ang Ⅱ的表达

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在体外培养的人眼小梁细胞(TMC)中的表达情况.方法 原代和传代培养人眼TMC株,收集第3代人眼TMC用于制作细胞爬片.利用免疫组织化学染色法和Western blot法检测体外培养人眼TMC中AngⅡ蛋白的表达.结果 传代培养的人眼TMC呈典型梭形,免疫组织化学检测显示体外培养的人眼TMC细胞膜和细胞质中可见AngⅡ的阳性颗粒,阴形对照片中未见有AngⅡ蛋白表达.Western blot法在相对分子质量为64 000处可见一明显蛋白条带,为AngⅡ蛋白的阳性表达.结论 AngⅡ在体外培养的人眼TMC中呈阳性表达,提示AngⅡ可能参与青光眼眼压和房水循环的调节.     

Tranilast对人眼小梁细胞胶原合成的抑制

目的 观察tranilast对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的影响。方法 体外培养第3～5代牛眼小梁细胞经0μg/ml(对照组)、12.5、25和50μg/ml tranilast处理后,采用~3H-脯氨酸掺入及液体闪烁测量技术观察tranilast对体外培养人眼小梁细胞胶原合成的影响。结果 12.5、25和50μg/ml tranilast处理组~3H-脯氨酸掺入率分别为(187±21)％,(127±18)％,(66±12)％,与对照组的(317±48)％比较有极显著差异;同时,~3H-脯氨酸掺入率随tranilast质量浓度增加而减少,呈剂量依赖性。结论 tranilast明显抑制小梁细胞胶原的合成。利用tranilast防治原发性开角型青光眼的可能性值得进一步研究。     

地塞米松对牛眼小梁水通道蛋白表达的影响

目的观察地塞米松对牛眼小梁细胞的损伤使其水通道蛋白-1(aquaporin-1,AQP-1)表达的影响。方法体外培养牛眼小梁细胞,取第4代细胞鉴定后用于实验。应用浓度为5,25,50,250μg/L地塞米松的培养液培养7天,通过WesternBlot方法检测培养的牛眼小梁细胞在不同浓度地塞米松作用下AQP-1的蛋白表达水平。结果牛眼小梁细胞可见AQP-1蛋白条带表达,未经地塞米松作用的AQP-1蛋白条带表达灰度值为102.87±11.73。在浓度为5,25,50,250μg/L地塞米松的培养液培养7天后AQP-1蛋白条带表达灰度值分别为111.64±13.32,115.31±9.41,121.39±9.81,129.42±13.52。当地塞米松浓度≥25μg/L时,AQP-1表达出现抑制作用(P<0.05)。结论地塞米松使培养的牛眼小梁细胞AQP-1的表达减少,这可能是皮质类固醇性青光眼房水流出阻力增加的原因之一。     

体外培养的牛眼小梁细胞及微管微丝的形态学观察

目的 :初步观察体外培养的牛眼小梁细胞 (tra becularmeshworkcells,TMcell)及微管微丝的形态 ,为进一步探讨原发性开角型青光眼 (primaryopen angleglaucoma,POAG)的发病机制提供理论依据。方法 :①TM的体外培养 ,收稿日期 :2 0 0 1-11-19;修回日期 :2 0 0 2 -0 3 -2 0作者简介 :沈凤梅 (1964 -) ,女 ,山东人 ,医学硕士。通信作者 :沈凤梅 (E -mail:wanglgu @pub .xaonline .com)。应用免疫组化方法 (神经原特异性烯醇化酶 ,Ⅷ因子相关抗原染色 )进行细胞鉴定。用光学及透射电子显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察。②免疫组化法肌动蛋白(actin)、微管蛋白 α(tubulin α)染色。结果 :①TM细胞培养成功 ,以上皮型为主。②小梁细胞内富含微丝 ,与细胞长轴平行 ,并密集于细胞的周边部 ;微管以核周为主。结论 :牛眼小梁细胞体外培养技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术。小梁细胞富含微管微丝 ,在细胞的多种功能中发挥作用     

大麻素对牛眼小梁细胞增殖、粘附和迁移的影响

目的:通过研究内源性大麻素物质(anandamine,AEA),对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、黏附以及迁移功能的影响,探讨AEA降低眼压的机制。方法:对牛眼小梁细胞进行体外原代培养及传代培养,应用免疫组化的方法(NES,Ⅷ因子相关抗原染色)鉴定细胞,化学及透射电镜观察。对3代牛眼小梁细胞分别以含AEA10,1,0.1,0μmol/L DMEM(含100ml/L小牛血清)培养液进行干预,分别于24,2h,2h后用MTT法计数细胞,再利用计算机统计软件进行数据分析,观察其对牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能的影响。结果:内源性大麻素,在一定浓度范围内,对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能均有较为明显的抑制作用(P<0.05)。结论:由此,可以了解到AEA可能是通过影响小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能来改变房水流出途径的阻力,而降低眼内压。     

消化法牛眼小梁细胞的体外培养

目的 探讨用消化培养法体外培养牛眼小梁细胞，为进一步研究原发性开角型青光眼(POAG)提供实验材料。方法 0．25％胰蛋白酶、0．3％胶原酶等量混合行牛眼小梁细胞的原代培养和传代实验。结果 成功培养出性状良好的牛眼小梁细胞。结论 消化法培养牛眼小梁细胞可获得生长形态及特征稳定的小梁细胞，是值得提倡的培养方法。     

肿瘤坏死因子-α对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响及意义.方法 体外培养牛眼小梁细胞,免疫荧光法行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及Ⅷ因子相关抗原染色鉴定.取第3代小梁细胞分别加入浓度20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1 TNF-α孵育35 h,免疫荧光法行FN染色后用激光共聚焦显微镜观测并行定量分析.结果 20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1浓度组染色积分光密度值分别为19 486.45±1 318.15、31 312.61±1 822.52、39 958.98±2 186.85,高于对照组积分光密度值(13 062.62±1 923.36).各实验组FN荧光强度表达高于对照组,差异具有统计学意义,且随TNF-α浓度增高FN的表达亦逐渐增多.结论 在体外培养条件下TNF-α可引起牛眼小梁细胞FN合成增加,推测FN可能通过与整合素结合来促进胶原收缩,小梁网间空隙扩大,房水外流阻力减小,从而降低眼压.     

Muscarinic Receptor Agonists Protect Cultured Bovine Trabecular Meshwork Cells against Apoptosis Induced by Dexamethasone

IntroductionDuringnormalaging,humantrabeculameshwork(TM)cellsreduce.Suchlosshasbeenreportedtoberemarkablyobviousinglaucompatientssinceindividualswithprimaryopenangleglaucoma(POAG)havefewerTMcellsthannon鄄glaucomatousage鄄matchedcontrols[1,2].Currently,theexactmechanismbywhichthecelpopulationisreducedinnormalandglaucoma鄄toushumanTMtissuesisnotknown.Severalpo鄄tentialmechanismshavebeensuggestedinclud鄄ingwear鄄and鄄tear,phagocytosis,cellmigrationandcelldeath[2].Apoptosisisaninvolutionalfor…     

转化生长因子-β2对牛眼小梁细胞外基质合成的影响

目的观察人眼房水中转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2, TGF-β2)对体外培养牛眼小梁细胞外基质合成的影响.方法将体外培养的第3～5代牛眼小梁细胞分为对照组和实验组,实验各组分别经0.32×103 ng/L、1.00×103 ng/L、3.20×103 ng/L TGF-β2作用48 h后,分别应用3H-脯氨酸掺入及液体闪烁测量技术、酶联免疫吸附法和放射免疫技术检测小梁细胞胶原(collagen, CA)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)及透明质酸(hyaluronic acid, HA)的合成.结果与对照组相比,不同浓度的TGF-β2均可促进牛眼小梁细胞CA的合成.0.32×103 ng/L、1.00×103 ng/L TGF-β2组与对照组比较差异有显著意义(q′=3.85、4.38, P<0.05),3.20×103 ng/L TGF-β2组与对照组比较差异有非常显著意义(q′=11.40, P<0.01),3H-脯氨酸掺入量呈浓度依赖性增高;1.00×103 ng/L、3.20×103 ng/L TGF-β2组促进牛眼小梁细胞合成FN, 与对照组比较差异有显著意义(q′=3.63, P<0.05) 和非常显著意义(q′=20.10, P<0.01); 1.00×103 ng/L、3.20×103 ng/L TGF-β2组均抑制牛眼小梁细胞合成HA, 与对照组比较差异有非常显著意义(q′=15.15、16.92, P<0.01).结论 TGF-β2可能在正常人眼小梁网细胞外基质的增龄性变化及原发性开角型青光眼患者小梁网及其邻管组织内细胞外基质异常沉积的过程中发挥了重要作用.     

表皮生长因子对牛眼小梁细胞c—fos基因表达的诱导

目的研究表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）对小梁细胞的作用。方法应用分子杂交技术研究ＥＧＦ对体外培养的牛眼小梁细胞ｃ－ｆｏｓ基因表达的诱导和３Ｈ胸腺核苷酸（３Ｈ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐａｒａｔｉｏｎ，３Ｈ－ＴｄＲ）掺入法观察细胞ＤＮＡ的合成。结果小梁细胞的３Ｈ－ＴｄＲ掺入率随着ＥＧＦ浓度不同而变化，浓度为２０～１５０ｎｇ／ｍｌ时，细胞掺入率随浓度增加升高（Ｐ＜０．０１）。与对照组相比，ＥＧＦ刺激停止生长的小梁细胞０．５小时后，ｃ－ｆｏｓ基因开始表达，１小时后达高峰，至２小时后消失。不同浓度ＥＧＦ刺激小梁细胞１小时后，ｃ－ｆｏｓ基因表达呈浓度依赖性。结论实验结果表明ＥＧＦ刺激小梁细胞增殖或进入生长状态，可能与ｃ－ｆｏｓ基因产物的信号传递作用有关。     

高糖对牛眼小梁细胞形态、增殖及凋亡的影响

目的:建立牛眼小梁细胞体外培养体系,观察高浓度葡萄糖对小梁细胞的影响,研究高糖与开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)以及糖尿病与POAG之间的关系,探讨糖尿病开角型青光眼的发病机制,从而为指导开角型青光眼的临床用药提供重要依据。方法:以新鲜牛眼为材料,分离并培养小梁细胞,用光学镜、电镜观察正常小梁细胞的形态。将传至第3代的小梁细胞制作成细胞悬液、计数并接种于培养板(或培养瓶)中,待细胞贴壁后,将细胞分为两组:对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度为35mmol/L),分别培养7d后收集细胞,用透射电子显微镜、MTT法、流式细胞仪(FCM)检测法,研究高糖对小梁细胞形态、增殖和凋亡的影响。结果:高糖组与对照组相比较,小梁细胞胞浆内细胞器减少,内质网、高尔基复合体、线粒体等细胞器肿胀,溶酶体及脂肪滴增多,核浆比减小,可见凋亡小体;高浓度葡萄糖对小梁细胞的增殖有明显的抑制作用,能够促进小梁细胞的凋亡,均有统计学意义(P<0.05)。结论:高糖可能通过使小梁细胞的增殖能力下降,凋亡率增加,使近管小梁网的网状结构改变,网孔变小,改变房水流出途径的阻力导致眼内压升高,可能是糖尿病患者PO-AG发病率增高的原因之一。     

小梁网干细胞的归巢及其在小梁创伤愈合中的作用

目的 研究胶原蛋白在小梁网干细胞（trabecular meshwork stem cells，TMSC）归巢中的作用以及小梁网（trabecular meshwork，TM）细胞和TMSC在创伤愈合中的相互作用。  设计 实验研究。研究对象 人原代TM细胞和TMSC。方法 分离、培养和传代人TM细胞和TMSC，通过定量RT-PCR和地塞米松诱导方法明确细胞类型；通过细胞贴附实验评价TM细胞及胶原蛋白对TMSC的亲和力；利用划痕损伤实验和时差显微镜观察TMSC分布及其与TM的相互作用。主要指标  TMSC和TM细胞的鉴定、TMSC穿膜数量和划痕损伤实验中TM细胞的迁移状态。 结果TMSC高表达OCT4而TM细胞高表达CHI3L1和MYOC，地塞米松刺激后TM细胞MYOC的表达显著增加。TMSC在含有TM细胞、胶原蛋白、TM细胞＋胶原蛋白的培养皿中的穿膜数分别为（13.1±5.3）个/高倍视野、（22.6±10.1）个/高倍视野、（4.8±2.2）个/高倍视野，均明显高于在单纯细胞培养皿中的穿膜数（3.7±0.5）个/高倍视野（P=0.0009，<0.0001，<0.001）。用AMD3100抑制TMSC中CXCR4的表达后，TMSC在各种状态的迁移数量差异消失。在TM细胞划痕损伤模型中加入TMSC可促进TM细胞的分化和迁移。结论  TMSC可诱导小梁网细胞分裂向受损区域迁移，从而促进组织损伤修复。胶原蛋白在TMSC归巢过程中发挥重要作用。     

茶碱对培养的牛眼小梁细胞骨架及细胞间黏附的影响

目的 观察茶碱对培养的牛眼小梁细胞的增殖、细胞骨架、细胞间黏附的影响，探讨其降眼压机制。方法 组织块法培养牛眼小梁细胞。不同浓度的茶碱(1、10、50mmol／L)分别作用4h、8h，免疫细胞化学法观察小梁细胞微丝及微管的改变，MTT法观察小梁细胞的增殖。ELISA法检测不同浓度的茶碱作用4h后连接素(β-catenin)的相对表达量。结果 茶碱作用8h抑制细胞增殖。茶碱明显改变细胞形态、微管及微丝染色浓集，变化程度与药物浓度及作用时间有关。茶碱降低连接素的表达量。结论 茶碱抑制小梁细胞增殖，改变细胞骨架，降低细胞间黏附，提示茶碱可能通过影响细胞骨架及细胞间黏附减少房水流出阻力从而降低眼压。     

Permissive effect of fibronectin on collagen gel contraction mediated by bovine trabecular meshwork cells

PURPOSE. The effect of fibronectin on the contractility of trabecular meshwork (TM) cells was investigated. METHODS. The contractility of bovine TM cells was evaluated by culture of the cells in a collagen gel and measurement of the change in the diameter of the gel under various conditions. The formation of stress fibers and the localization of integrin alpha5 and beta1 chains (which together form a fibronectin receptor) in bovine TM cells were investigated by laser confocal microscopy of cells stained with phalloidin and antibodies to the integrin subunits. RESULTS. The addition of fibronectin to collagen gels containing bovine TM cells induced marked gel contraction in a time- and concentration-dependent manner. Cytochalasin D (an inhibitor of microfilament formation) and the peptide GRGDSP (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), a fibronectin receptor antagonist, each inhibited this effect of fibronectin, whereas nocodazole (an inhibitor of microtubule polymerization) and the control peptide GRGESP (Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro) did not. Furthermore, fibronectin induced the spreading of cells, the formation of actin stress fibers, and the expression of integrin alpha5 in the collagen gel-embedded TM cells. CONCLUSIONS. Fibronectin promotes collagen gel contraction mediated by bovine TM cells. Moreover, the formation of actin stress fibers and upregulation of integrin alpha5 appear to contribute to this permissive effect of fibronectin. The interaction of fibronectin with TM cells may thus be a determinant of the contractility of TM tissue.