用基因工程HBcAg制备抗-HBc单克隆抗体的研究

近年来,日益认识到HBcAg是肝细胞的重要靶抗原,使用抗-HBc载以药物作导向治疗的研究正在进行,为使导向精确,获取不含任何抗人肝细胞成份的抗-HBc是必需解决的问题,以尸肝HBcAg免疫所获单克隆抗-HBc显然不能满足这一条件,为此,本文探索了用基因工程HBcAg研制抗-HBc单克隆抗体,获得成功,报告如下。     

抗工程菌产HBcAg单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

制备乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和核心抗体(抗-HBc)是深入研究乙型肝炎不可缺少的条件之一。目前国内已建立多株抗-HBc单克隆抗体,但免疫用的HBcAg基本上是从尸肝中提取。由于富含HBcAg的尸肝不易获得,而且从组织中提取纯化抗原的步骤也比较复杂,因此抗原来源困难。近年来,HBcAg已能用遗传工程菌进行大量生产,本文报告用菌产HBcAg制备抗HBc-     

IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠(H-2d)特异性免疫应答的影响

目的：观察IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠（H-2d）特异性体液免疫和细胞免疫应答的影响.方法：用肌肉注射法将HBV核心区DNA疫苗、IL-12质粒和IL-18 质粒接种BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBc（IgG）及IgG亚类（IgG1、IgG2a）;LDH释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性.结果：免疫6周后,HBcAg DNA疫苗联合IL-12质粒、IL-18质粒和IL-12＋IL-18质粒组小鼠的血清抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0.05）,抗HBc IgG亚类以IgG2a占优.DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤率均高于对照组（P组）,其中C＋IL-18组和C＋IL-12＋IL-18组中CTL值明显高于C组,尤以C＋IL-12＋IL-18组中的CTL杀伤率最高.结论：IL-12和IL-18基因与HBcAg DNA疫苗联合免疫,不仅能增强HBcAg特异性体液免疫应答,而且能增强HBcAg特异性CTL的杀伤活性.     

急慢性乙型肝炎患者的抗-HBc亲和力

HBcAg 可出现在乙型肝炎患者血中,是一种血清学标志,可代表病毒持续复制。已有报道证实针对HBcAg 的细胞免疫应答在乙型肝炎发病机理中起重要作用;如用从肝细胞中分离出来的或基因重组的HBcAg分子免疫黑猩猩,将会使动物产生抵抗HBV感染的能力,HBcAg 还可增加小鼠B 细胞对HBsAg 的应答能力。HBV 感染时患者体内有抗-HBc,这种抗体对疾病转归有重要作用。作者选择9例慢性乙型肝炎患者,7例无症状乙型肝炎病毒携带者进行研究(均可检出HBSAg 和抗-HBc),利用基因重组型     

用抗-(抗HBc)抗体在同系小鼠中诱导抗-抗Id抗体

用单克隆抗-(抗HBc)抗体(抗-Id)免疫BALB/c鼠,诱生出具有与抗-HBc相同反应性的抗-抗Id抗体(Ab_3)。这种抗体在ELISA试验中可与HBc-Ag特异性反应,并能抑制单克隆抗-HBc与HBcAg的结合。表明我们建立的抗-H-Bc的抗Id能模拟HBcAg刺激小鼠产生免疫反应。     

单克隆抗-HBc抗体亲和层析纯化大肠杆菌合成的HBcAg转化为HBeAg的研究

本文报道了用单克隆抗-HBc抗体亲和层析柱大量纯化大肠杆菌合成的HBcAg。经单克隆抗-HBc抗体亲和层析柱一步纯化的HBcAg,它的比活性从94·12单位/mg蛋白提高到12851.40单位/mg蛋白,提高了136.54倍。纯化的HBcAg紫外光谱分析证明是单一的蛋白成分。免疫电镜观察结果证明,纯化的大肠杆菌来源的乙肝病毒核心抗原相似于肝脏来源的乙肝病毒核心抗原的典型形态和大小。 亲和层析纯化的E-HBcAg,用SDS和2-巯基乙醇处理后,纯化的E-HBcAg转化为E-HBeAg。转化的E-HBeAg能被抗-HBe抗体特异性地完全中和。而不被抗-HAV、抗-HBs、正常人血清、小牛血清中和。但是,它能部分的被纯-HBc抗体中和。     

单克隆抗-HBc抗体亲和层析纯化大肠肝菌合成的HBcAg转化为 HBeAg的研究

本文报道了用单克隆抗-HBc抗体亲和层析柱大量纯化大肠杆菌合成的HBcAg。经单克隆抗-HBc抗体亲和层析柱一步纯化的HBcAg,它的比活性从94.12单位/mg蛋白提高到12851.40单位/mg蛋白,提高了136.54倍。纯化的HBcAg紫外光谱分析证明是单一的蛋白成分。免疫电镜观察结果证明,纯化的大肠杆菌来源的乙肝病毒核心抗原相似于肝脏来源的乙肝病毒核心抗原的典型形态和大小。 亲和层析纯化的E-HBcAg,用SDS和2-巯基乙醇处理后,纯化的E-HBcAg转化为E-HBeAg。转化的E-HBeAg能被杭-HBe抗体特异性地完全中和。而不被抗-HAV、抗-HBs、正常人血清、小牛血清中和。但是,它能部分的被纯-HBc抗体中和。     

IL-12对结构优化的HBV核心抗原DNA疫苗诱导免疫应答的影响

目的 探讨IL-12对一种结构优化的HBV核心抗原(HBcAg)DNA疫苗免疫效果的影响。方法 将小鼠IL-12基因插入结构优化的DKA疫苗pST-HBc，构成pST-HBc/IL12，将pST-HBc／IL12转染COS7细胞，ELISA检测培养上清中的HBcAg和小鼠IL-12。分别将pST-HBc／IL12和pST-HBc肌肉注射接种BALB／c小鼠，检测小鼠的体液和细胞免疫应答。结果 ELISA检测到培养上清液中的HBcAg和小鼠IL-12，pST-HBc／IL12诱导的抗-HBc总IgG阳转率和抗体水平不及pST-HBc，但其诱导的脾细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞反应均强于pST-HBc。结论 IL-12可进一步增强这种HBcAgDNA疫苗诱导的细胞免疫应答。     

丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。     

重组乙肝病毒核心基因DNA与表面抗原-抗体共免疫应答研究

目的:了解小鼠对乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因免疫及与乙肝表面抗原-抗体复合物(HBsAg-抗HBs)联合免疫的应答。方法:用表达乙肝病毒核心抗原N端144个氨基酸的重组质粒DNA(简称pHBc144)100μg及含1μgHBsAg的重组乙肝表面抗原-鼠抗体组建的复合物(简称sIC)免疫Balb/c小鼠。用ELISA法检测血清抗体IgG和IgG1、IgG2a亚类的效价。用半定量PCR法分别检测鼠脾细胞IFN-γ及IL-4的mRNA。结果:pHBc144及sIC联合免疫鼠的抗HBs IgG、IgG1、IgG2a效价均显著高于sIC组(P＜0．05)。同时小鼠还可产生抗HBc及由HBsAg、HBcAg特异诱生的IFN-γ及IL-4。但与sIC共免疫,小鼠对HBcAg诱生的IFN-γ mRNA有所降低。结论:可用HBcAg基因与sIC共免疫,以获得针对乙肝病毒2种结构蛋白的免疫应答。     

抗人肺腺癌单克隆抗体放射免疫显像的动物实验研究

本文介绍用单克隆抗体进行裸鼠移植瘤的放射免疫定位的实验结果。用人肺腺癌细胞株(LTEP-a_2)免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0细胞融合,筛选出产生抗LTEP-a_2抗体的杂交瘤细胞,经3次亚克隆后,注入BALB/c小鼠腹腔,产生腹水。Zetaprep离子交换     

抗早孕因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立分泌抗EPF(Early pregnancy factor,早孕因子)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单抗并鉴定.方法用本实验室已纯化的早孕和肿瘤源性EPF作为抗原刺激Balb/c小鼠,用免疫后的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合,经4次克隆化,获得可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,注入Balb/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-A亲和层析纯化,SDS电泳和Western-blot等方法分析纯化结果.结果融合后获得一株稳定分泌抗EPF抗体的细胞株(C3D11),克隆化后,获得稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,将增殖后的细胞注射Balb/c小鼠腹腔获得腹水型单抗,以亲和层析法纯化,SDS-PAGE分析显示纯化后去掉了大部分杂蛋白,免疫印迹分析抗体纯度较高,与抗原匹配性良好.结论本研究制备的EPF单克隆抗体为特异性抗EPF抗体.     

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础     

含APPβ裂解位点肽及Aβ1-15的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析

目的:构建含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)及删除了c/e1表位的截短型HBcAg基因的原核表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白C-ABCSP-Aβ15-C形成的病毒样颗粒,检测其免疫原性,为多表位AD基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:PCR扩增含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)的基因,连接于HBcAg的1～71的3’端,再将HBcAg的88～144位氨基酸的基因片断连接于Aβ1-15的基因的3’端,构建重组质粒pUC/c-ABCSP-Aβ15-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,IPTG诱导表达。用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色,观察重组基因的表达。透射电镜观察融合蛋白形成的病毒样颗粒。融合蛋白经腹腔注射免疫昆明小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-ABCSP、抗-Aβ抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,重组基因位于表达质粒之中,其大小、序列与理论设计相符。诱导表达后,SDS-PAGE显示,在细菌裂解液的上清和沉淀中均可见到表达蛋白条带,且以沉淀中为多,约占沉淀总蛋白的40%。纯化后的融合蛋白形成电镜下可观察到的病毒样颗粒。昆明小鼠经融合蛋白免疫5次后,其血清中抗-ABCSP抗体的滴度可达1∶5 000,抗-Aβ抗体的滴度可达1∶10 000,检测不到抗-HBc抗体。结论:c-ABCSP-Aβ15-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性。     

阻断型抗人IgE单克隆抗体的制备及其表位分析

目的 利用基因重组抗原免疫小鼠,制备抗人IgE单克隆抗体,研究其特异性和功能.方法 用表达的重组人IgE-Fc免疫BLAB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,以间接ELISA法筛选杂交瘤上清.用ELISA阻断分析鉴定其生物学功能;通过丙氨酸突变扫描分析确定其抗原表位.结果 利用杂交瘤技术获得了1株抗人IgE的单克隆抗体178,它具有IgE抗体特异性反应,其识别的抗原表位位于IgE与其受体结合的关键部位.经鉴定其具有体外阻断IgE与其受体结合的活性.结论 利用基因重组抗原制备了1株抗人IgE的单克隆抗体178,此单克隆抗体具有体外阻断IgE与其受体结合的生物活性.     

用基因工程表达的HBcAg制备抗-HBcAg单克隆抗体及其初步应用

用基因工程表达的NBcAg免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,以ELISA抑制法检测抗体,获得28株分泌抗-HBc McAb的杂交瘤细胞系。对其中7株进行了克隆化,培养上清抗体滴度1:320～1:2560,免疫小鼠腹水和血清滴度1:10万～1:80万。Ig类型测定2株IgG1、2株IgG2a、1株IgG3、2株IgM。杂交瘤细胞系在体外连续传代培养6个月及液氮冻存的细胞系经复苏后仍能稳定地分泌McAb。得到的McAb只与HBcAg反应且能被HBcAg特异阻断,证明其特异性高。用ELISA间接法测定了McAb的相对亲和力,从50％最大结合的浓度分析结果,7株McAb的相对亲和力为2E6>2F5>2B11>2C10>1A7>1B7>1H7,浓度范围为0.6～10μg/ml。2E6和2C10 2株McAb与HRP结合,用ELISA双抗休夹心法筛选出2F5、2B111和H7 3株McAb适合作为包被抗体。2F5与2E6-HRP配对,建立了快速McAb-ELIS抑制法测定患者血清中抗-HBc。用本法测定了222份临床患者血清标本,结果与“华美”试剂盒测定结果基本一致。     

抗口腔鳞癌单克隆抗体ASC_5的制备与特异性分析

用舌鳞癌Tca8113细胞免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P_3U_1进行融合,经筛选和克隆化后,获得分泌抗口腔鳞癌单克隆抗体的杂交瘤ASC_5。经ELISA检测,ASC_8单抗与Tea 8113细胞有反应,与Hela细胞有交叉反应,与肺癌、肝癌、胃癌、K_(562)细     

三种抗卵巢单克隆抗体的制备及其性能的研究和比较

本文报道用卵巢上皮癌可溶性抗原直接免疫BALB/c小鼠,与鼠骨髓瘤细胞融合制得分 泌抗卵巢上皮癌单克隆抗体之杂交瘤细胞株CoC-166-9,CoC-183-A_5,CoC-183-B_2三株,分别连续培养540天,270天经冻存后复苏细胞生长好,分泌抗体稳定。单克隆抗体亚类鉴定     

肌酸激酶同工酶MM、BB(CK-MM、CK-BB)单克隆抗体的研制与鉴定

本文介绍了肌酸激酶同工酶CK-MM、CK-BB单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与特异性分析。用纯化的CK-MM、CK-BB免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp 2/0骨髓瘤细胞融合,经PAP-MAb-PAP检测系统和ELISA筛选的CK-MM、CK-BB特异性抗体阳性孔,用有限稀释法进行克隆化,经四次克隆后共获得3株稳定分泌抗CK—MM、2株稳定分泌抗CK-BB特异     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。