实验诱发树鼩肝癌过程中细胞凋亡及其相关基因、p53突变位点的研究

目前对肝细胞癌(HCC)的研究一般为手术切除的肝癌组织,并用癌旁肝组织作为对照肝组织。这些研究只能观察癌形成时或形成后的基因表达状况,不能动态观察在肝细胞癌变过程中一些基因的表达状况。而以往利用动物模型研究不同诱癌阶段的基因改变,也通常是在不同诱癌阶段分批处死动物获取所需的组织,故也只能从群体上而不能从个体上动态观察基因表达情况。     

改进性DEN诱发大鼠肝癌模型的建立与病理形态学研究

目的 建立改进性二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱发大鼠原发性肝癌模型,探讨肝癌形成过程的病理变化特点.方法 用1‰DEN溶液间断喂养Wistar大鼠诱发肝癌,对大鼠肝脏不同诱癌阶段的病理变化和超微结构进行动态观察.结果 16周以后诱癌组大鼠成癌率为96%(24/25),大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生硬化期和肝细胞癌变期等3个时期,不同时期肝细胞的核、核仁、细胞质内糖原以及细胞质内细胞器的病理形态学改变有一定规律,观察到肝细胞吞噬细胞现象.结论 该模型是动态研究肝癌发生的理想动物模型.诱癌间歇期不会改变DEN诱癌的进程.肝细胞癌变过程中存在自噬(autophagy)机制.     

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中超微结构的动态

目的探讨肝细胞癌变过程中超微结构变化特点。方法对二乙基亚硝胺诱癌中大鼠肝脏不同病变阶段的超微结构进行动态观察。结果在诱癌的早、中、晚期发展过程中，损伤肝细胞的核、核仁、胞浆内糖原以及胞浆内细胞器，如线粒体、粗面内质网和滑面内质网等的变化有一定规律。结论随诱癌时间延长，肝细胞逐渐出现变性、异型乃至癌细胞的阶段性超微结构特征     

间歇给药对DEN诱发大鼠肝癌模型的影响研究

目的 建立改良型DEN诱发大鼠肝癌模型,探讨肝细胞癌变过程中的超微结构变化特点.方法 用1‰DEN溶液喂养Wistar大鼠诱发肝癌,在诱癌过程中给予大鼠3周休息间歇期,对不同诱癌阶段大鼠肝脏的超微结构进行动态观察.结果 16周后诱癌组大鼠成癌率为96%(24/25),不同时期肝细胞核、核仁及胞质内细胞器的病理形态学改变有一定规律,观察到肝细胞吞噬细胞现象.结论 设立间歇期提高了大鼠诱癌末期的成活率,但没有延长DEN诱癌的进程.该模型是动态研究肝癌发生的理想动物模型.肝细胞在癌变过程中出现变性、异型、吞噬细胞、恶变成癌细胞等超微结构特征.     

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中超微结构的动态观察

目的 探讨肝细胞癌变过程中超微结构变化特点。方法 对二乙基亚硝胺诱癌中大鼠肝脏不同病变阶段的超微结构进行动态观察。结果 在诱癌的早、中、晚期发展过程中，损伤肝细胞的核、核仁、胞浆内糖原以及胞浆内细胞器，如线粒体、粗面内质网和滑面内质网等的变化有一定规律。结论 随诱癌时间延长，肝细胞逐渐出现变性、异型乃至癌细胞的阶段性超微结构特征。     

二甲氨基偶氮苯(DAB)诱发大白鼠肝癌过程中肝细胞染色质非组蛋白含量和磷酸化作用变化的观察

对DAB诱癌早期(1～5个月)大白鼠肝细胞核染色质非组蛋白含量和磷酸化作用的变化进行了观察。发现:①诱癌1个月的鼠肝细胞核各部分蛋白质含量和非组蛋白总磷含量没有有意义的变化;②诱癌3个月的鼠肝细胞核各部分蛋白质含量和非组蛋白总磷含量显著增加,鼠肝出现肝硬变的趋势;③诱癌5个月Ⅰ组的鼠肝已形成癌块,非组蛋白含量增加,总磷含量增加,有显著意义。Ⅱ重组鼠出现肝硬化,非组蛋白含量降低,总磷含量比Ⅰ组低。这些结果提示:非组蛋白磷酸化作用与基因表达的调控和癌肿的形成有密切关系。     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中CDK4基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR法检测原发性肝细胞癌中CDK4基因的表达。方法：提取手术切除人肝癌和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织及癌旁组织中cDK4的表达水平。结果：20例肝细胞癌标本中有18例肿瘤组织中CDK4基因表达明显高于癌旁肝组织，其中7例高出4倍以上。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量测定基因的表达；CDK4基因在肝细胞癌的发生、发展中可能起重要作用。     

c—fos蛋白在大鼠肝癌发生中的表达及意义

采用免疫组织化学ＡＢＣ法，对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ０诱发大鼠肝癌发生过程中ｃ－ｆｏｓ蛋白在肝组织中的表达进行了系统观察。结果：正常大鼠肝细胞不表达ｃ－ｆｏｓ蛋白，诱癌第４周即可见少量肝细胞呈ｃ－ｆｏｓ蛋白阳性表达。随诱癌发展进程，肝细胞ｃ－ｆｏｓ蛋白表达逐渐增强，至诱癌中期（８－１２周），肝增生结节内部分肝于ｃ－ｆｏｓ蛋白阳性表达。诱癌晚期（１８周），癌结节内大部分肝癌细胞亦呈ｃ－ｆｏｓ蛋白阳性表达     

人、鼠肝癌形成过程中GGT活性变化及其诊断意义

为了探讨γ -谷氨酰转移酶 (GGT)在人、鼠肝癌形成过程中活性变化对肝癌的诊治意义 ,对 30例肝癌病人肝癌组织及鼠肝癌模型肝组织GGT活性进行了检测和分析比较。结果 :组织中GGT活性表现为人肝癌组织较癌周组织明显升高 (P <0 .0 1) ;鼠化学诱癌过程中从正常到癌前病变到癌变的肝组织依次明显升高 ,三种不同组织间的比较差异均有显著性(P <0 .0 1)。结论 :人、鼠肝癌形成过程中GGT活性呈同步升高趋势 ,GGT为反映肝细胞癌变的标志酶。动态观察GGT活性变化有助于肝癌的早期诊断     

鼠肝细胞癌变发生过程中热休克蛋白gp96及其基因的动态表达

目的:探讨肝细胞癌变过程中热休克蛋白(HSP)gp96及基因的动态表达与变化。方法:以2-乙酰氨基芴(2-FAA,0.05%)喂饲SD大鼠诱发肝癌,观察肝病理组织学(HE染色)和总RNA的改变,以巢式逆转录酶链反应扩增gp96基因片段;以免疫组化分析肝细胞癌变过程中gp96的动态表达。结果:SD鼠在喂饲2-FAA后,在诱癌早期肝细胞发生颗粒样变性,中期出现不典型增生,后期见大量癌巢结节。癌变过程中肝组织gp96-mRNA表达明显增加,且显著高于对照组肝组织(P<0.01);正常肝gp96蛋白表达较少,肝细胞癌变过程中gp96表达呈显著的梯度增加。结论:gp96参与肝细胞的癌变过程,癌变初期的过度表达有助于肝癌的早期诊断。     

大鼠肝癌发生中肝细胞核仁转录功能的变化

用硝酸银染色特异地显示细胞核内含有核糖体RNA(rBNA)基因的核仁组织区(NORs),多阶段观察SD大鼠肝癌发生中核仁转录功能的变化。用Gerlans的三阶段(启动—选择—促进)肝癌诱发模式,在大鼠肝内同步地诱导出癌前期病变如增生灶和结节。形态学测量结果显示诱癌8周后肝细胞核NORs面积的绝对与相对值均增加,此时肝内始出现增生灶及少量结节,在随后各点至实验末(24周)两值仍呈持续增高状态,而增生结节逐趋增多、增大。增生灶和结节内肝细胞核NORs银染变化最为显著。提示在肝癌发生中转化细胞rRNA合成增多或rRNA基因表达增强。涉及基因表达的此种改变可能在肿瘤转化中起重要作用。     

KAI1基因在肝硬化和肝细胞癌组织中的表达及其意义

目的 研究转移抑制基因KAI1在肝硬化和肝细胞癌组织中的表达及该 基因与肝细胞癌患者临床资料间的关系. 方法 采用Northern blot方法研 究20例肝细胞癌组织、14例肝硬化组织和10例正常肝组织中KAI1基因mRNA的表达水平,经 mRNA的定量分析及统计处理判定KAI1基因与肝细胞癌患者临床特征的关系. 结果 肝硬化和肝细胞癌组织中KAI1 mRNA表达水平(0.113±0.110; 0.139±0.078)显著低于 正常肝组织中的表达(0.316±0.121), (P=0.0003; P=0.0000); 肝硬化和肝细胞癌 组织中KAI1基因mRNA的表达无显著差异(P=0.4152);KAI1 mRNA在不同分化程度的肝细胞 癌组织中的表达无显著差异(P=0.8261),而Ⅲ期肝细胞癌组织中的KAI1基因表达显著低 于Ⅱ期的肝细胞癌组织(P=0.0221). 结论 转移抑制基因KAI1在肝硬 化阶段亦有低表达;肝癌组织中KAI1基因的低表达与肝癌的转移有关.     

肝细胞肝癌组织中FN和PTEN基因表达水平及意义*

目的：研究FN和PTEN基因在肝细胞肝癌中的表达情况,探讨其在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义。方法：应用荧光实时定量PCR方法,检测84例肝细胞肝癌及癌旁组织中FN蛋白、PTEN蛋白、mRNA表达情况。分析FN和PTEN基因表达及肝细胞肝癌的关系。结果：FN蛋白主要定位于肝癌细胞外基质中。FN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为79.76%,高于癌旁肝组织的阳性率9.52%,差异具有统计学意义（P<0.05）。PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞质内。PTEN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为38.09%,明显低于癌旁肝组织的阳性率100%,差异具有统计学意义（P<0.05）。FN在合并癌栓,淋巴结转移,AFP阳性,肿瘤数目多发的肝癌组织中的表达高,而在不同分化程度及不同肿瘤直径的肝癌组织中表达差异无统计学意义;PTEN在低分化肝癌细胞,合并癌栓,AFP阳性,淋巴结转移,肿瘤直径≥2cm的肝癌组织中表达较低,而在不同肿瘤数目的肝癌组织中表达无统计学意义,PTEN蛋白表达与HBsAg无关,与组织学分级及转移有关。结论：肝癌组织中FN mRNA的表达量高于癌旁组织,而肝癌组织中PTEN mRNA的表达量低于癌旁组织,FN和PTEN基因可能与肝细胞肝癌的发生发展有关,其可能在肝癌的发生发展、侵袭转移中起一定的促进或抑制作用。     

NDRG1基因与肝组织分化及癌变的相关性

目的：通过检测NDRG1基因在各种组织和细胞中的表达谱，探讨NDRG1与肝细胞分化及肝癌发生、发展的相关性。方法：通过：Northem blot和RT-PCR方法检验NDRG1在肝癌和配对的非癌肝组织、正常肝、不同发育时期小鼠肝和人胎肝组织、人胚胎各组织以及多种细胞系中的表达谱。结果：NDRG1在肝癌组织中的表达量显著高于配对的非癌肝组织和正常肝组织中的表达量；而正常肝组织与非癌肝组织相比，表达量差异无显著性。在所研究的10种细胞系中，NDRG1的表达量在293T人肾细胞系中最高，永生化人肝细胞系L02次之，在未分化的HLE肝癌细胞系及低分化的肝母细胞瘤HepG2中最低。NDRG1的表达量随婴鼠肝和人胎肝的发育而增高，至已达分化的成年肝又有所降低。结论：NDRG1可能与肝细胞的分化相关，并在分化的一定阶段高表达，但不宜作为分化的标志物。NDRG1在肝癌中的高表达提示肝癌的形成不单是一种简单的去分化，其增殖、分化紊乱的错综复杂关系和所涉及的基因需要进一步深入研究。     

肝细胞癌变核转录因子-κB及肿瘤坏死因子-α动态表达与改变

目的:探讨了肝癌形成过程中核转录因子-κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的动态表达及其改变机制。方法:雄性SD大鼠以2-乙酰氨基芴(2-FAA)喂饲制备肝癌模型,经病理组织学(HE染色)分析肝细胞的形态学变化,在癌变不同时期定量观察核蛋白、NF-κB和TNF-α动态变化。并分析了人肝癌癌灶及癌旁组织中NF-κB和TNF-α的表达水平。结果:病理组织学检查发现大鼠在喂饲2-FAA后,正常肝细胞在诱癌早期发生颗粒样变性,中期阶段肝组织中出现不典型增生,后期可见大量癌巢结节,均为高分化肝细胞癌。在正常肝细胞中仅见较低水平的NF-κB和TNF-α表达。诱癌后,随着肝细胞组织形态的变化,肝组织中NF-κB和TNF-α表达依次增强,均显著高于正常肝组织(P<0.01),且两者的表达高度相关(r=0.81,P<0.01);人肝癌的癌灶组织中NF-κB的表达,也较癌旁组织明显增强(P<0.01)。结论:肝细胞癌变早期NF-κB信号转导途径激活和TNF-α呈过表达状态。     

鼠双微粒体-2基因和突变型p53基因表达与肝癌细胞增殖和凋亡关系的研究

目的　探讨鼠双微粒体 2 (murine double minute 2, MDM2) 基因和突变型 p53 基因表达及其与肝癌细胞增殖和凋亡的相关关系。方法　应用免疫组织化学、原位分子杂交和 TUNEL 方法检测原发性肝细胞癌组织中MDM2基因和突变型 p53基因表达与肝细胞癌组织中癌细胞增殖和凋亡情况, 并分析 MDM2 基因和 p53 基因表达与肝细胞癌组织学分级、类型、增殖和凋亡的相关关系。结果　①MDM2蛋白和mRNA 、p53蛋白和mRNA 在肝细胞癌组织中阳性表达率明显高于癌旁肝组织和正常肝组织 (均P<0 .05); MDM2 mRNA阳性表达与肝细胞癌组织学分级和类型无相关关系 (均P>0 05); p53 mRNA阳性表达与肝细胞癌组织学分级具有相关关系 (P<0 .05)。②肝细胞癌组织中癌细胞增殖和凋亡的阳性率分别为 100%和 50%, 两者相比差异有极显著性意义 (P< 0 .01); MDM2mRNA 和 p53 mRNA阳性表达与肝癌细胞增殖均具有相关关系 (均P<0. 05), 但与肝癌细胞凋亡均无相关关系 (均P>0. 05)。结论　MDM2 和 p53的蛋白和mRNA在肝细胞癌组织中呈过表达状态, MDM2 基因和 p53基因过表达在肝细胞癌发生、增殖和分化中起重要作用。     

人肝细胞癌及癌周肝组织酶组织化学研究——Ⅰ.γ-GT酶、G-6-P酶和ATP酶的变化

本文用γ-GT酶、G-6-P酶和ATP酶的组织化学反应研究了10例手术切除的肝细胞癌及其周围肝组织的变化。结果表明癌组织与癌周肝组织具有显著酶的差异性。肝癌γ-GT酶的活性,2例显著增强,5例轻度增强,3例无酶的活性。这种变化与癌细胞的分化程度无明显关系,因而γ-GT酶不能作为肝细胞癌可靠的阳性酶标记。其癌周肝组织γ-GT酶的活性皆有明显增强。G-6-P酶的活性在癌组织中皆显著降低至消失,而周围肝细胞的活性较强,着色甚深,形成鲜明对照,这一酶的组化反应可作为鉴别肝细胞癌与非癌肝组织的参考。ATP酶的活性在肝癌组织中减弱至消失,在周围肝组织中存在轻度活性,但二者对比不鲜明。     

改良法建立大鼠原发性肝癌变模型与病理形态学研究

目的 建立改进性二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱发大鼠原发性肝癌模型,探讨肝癌形成过程的病理变化特点.方法 用95μg/mL的DEN溶液间断喂养Wistar大鼠诱发肝癌,对大鼠肝脏不同诱癌阶段的病理变化和超微结构进行动态观察.结果 第18周末诱癌组大鼠成癌率为100%.肝癌前期以实质细胞较为广泛的核异常及透明样变性、水变性、胞浆嗜碱变明显.肝癌发生期以线粒体空泡化、出现脂滴、嵴部分断裂、肿胀、变形,内质网扩张明显.肝癌发生发展期以细胞核碎裂、染色质边集,细胞浆不均,线粒体固缩,内质网肿胀、部分脱颗粒;癌旁细胞线粒体肿胀,基质变淡透亮,基质颗粒消失和空泡变,粗面内质网增生活跃明显.结论 该模型是动态研究肝癌发生的理想动物模型.诱癌间歇期不会改变DEN诱癌的进程.不同时期肝细胞的核、核仁、细胞质内细胞器的病理形态学改变有一定规律.     

肝癌干细胞标志物CD44在化学诱癌过程中的变化及意义

目的检测CD44在化学诱导C57BL/6J小鼠肝癌过程中各时期的动态变化。方法以45只正常C57BL/6J雄性小鼠为对照组,通过化学法诱发50只C57BL/6J雄性小鼠肝癌(诱癌组)。观察小鼠成瘤情况和生长状态,对每2周定期处死小鼠获得的组织标本分别进行病理学切片观察,实时定量PCR(real-time PCR)技术检测小鼠肝癌组织及相应阶段正常组织CD44 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法、FCM法和免疫组化法检测CD44的蛋白表达情况,应用FCM法定量检测细胞表面抗原的表达情况。结果化学诱导20周后,成功诱发小鼠肝癌。病理学检测显示:诱癌组小鼠早期主要表现为肝组织充血水肿,伴有少量变性坏死,为药物性肝炎的表现,同时部分区域可见纤维组织增生;16周后肝细胞组织表面开始出现灰白色结节,数目不等,镜下可见肝细胞非典型增生;20周时肿瘤结节明显增大,最大直径可达25 mm,镜下显示为高分化肝细胞癌。real-time PCR、蛋白质印迹及FCM检测均显示:第4周表达轻度升高,从第8周开始表达明显增高,CD44分子表达水平均高于对照组(P<0.05),并随着时间推移持续升高。免疫组化染色结果表明,CD44分子抗原定位于细胞膜上,诱癌组第4周开始出现弱阳性,第20周出现强阳性。结论 CD44分子在诱癌过程中的差异表达,说明其对肝癌的发生发展有明显的调控作用,但其调控机制有待进一步研究。     

实时荧光定量RT-PCR检测肝细胞癌中删基因的表达

目的探讨PTCH基因在肝细胞癌组织中的表达及其与肝癌病理分级的关系。方法提取手术切除18例不同病理分级的人肝癌、癌旁组织和6例胆管结石手术切除的正常肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量RT-PCR法观察人肝细胞癌组织与癌旁组织中PTCH基因的相对表达水平,以及观察人正常肝组织中PTCH基因的表达水平。结果PTCH在所测18例肝细胞癌组织与癌旁组织中均有表达,在6例正常肝组织中不表达，且在病理分级为Ⅰ和Ⅱ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著高于癌旁组织（P〈0．01），而在病例分级为Ⅲ级的癌组织中PTCH的mRNA表达水平显著低于癌旁组织（P=0．024）。结论随着肝癌恶性程度的增加PTCH的mRNA表达量呈递减趋势，提示PTCH可能参与了肝细胞的早期癌变过程。