人纤维介素基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人纤维介素（hfgl 2）基因的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达。方法：提取人外周血单个核细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，以其为模板，PCR扩增hfgl 2 cDNA片段，将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3．1，将重组质粒转染CHO细胞并制作细胞爬片，对爬片进行免疫组化染色，显微镜下观察并摄片。结果：扩增出1．3kb的目的片段，并将其克隆至pcDNA3．1，经酶切鉴定和测序鉴定无误；重组质粒转染CHO细胞，细胞爬片免疫组化染色可见细胞质中存在明显的阳性棕染。结论：成功构建hfgl 2基因的真核表达载体，为进一步探讨其功能学和干预研究奠定了基础。     

戊型肝炎病毒抗原基因片段及其组合表达质粒的构建

目的：选择及组合戊肝病毒（ＨＥＶ）抗原基因片段,进行表达与免疫学特性研究。方法：根据已公布的ＨＥＶ序列,选择三段优势抗原表位,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增基因片段,产物以单独或经甘氨酸连接肽串联组合的方式克隆到载体ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ中,经ＤＮＡ序列分析后,将构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行表达,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析初步考察其免疫学特性。结果：构建的六个重组质粒在大肠杆菌中获得了不同程度的表达,表达的目的蛋白具有与戊型肝炎患者阳性血清特异性结合的能力。结论：ＨＥＶ抗原片段及其组合在大肠杆菌中得到了高效表达,并为优良诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供了基础。     

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

目的：构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6 为模板,PCR扩增出 PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达, 采用Western blotting 法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000 bp）和PAK6 1-55(165 bp)、PAK6 56-210(465 bp)、PAK6 211-410（600 bp）及PAK6 385-681（891 bp） 4个片段。Western blotting检测, PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。     

转录因子ZNF191腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建转录因子ZNF191腺病毒表达载体,为进一步研究ZNF191的生物学功能与肿瘤的基因治疗奠定基础.方法:从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,并将ZNF191亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV中,酶切及DNA测序鉴定后,将含ZNF191基因的重组穿梭质粒pAdTrack-Z...     

hTRX PR39融合基因cDNA克隆的构建及鉴定

目的研究人硫氧还蛋白（hTRX）和抗菌肽PR39基因在脑缺血疾病治疗中的作用,构建hTRX PR39cDNA融合基因。方法设计合成PR39、hTRX正向和反向引物,采用PCR方法,扩增获得两端具有BamHI和Ecor721、Eco721和EcoI酶切位点的PR39 cDNA和hTRX cDNA片段,并分别克隆到pGEM T easy中,转化细菌,筛选阳性克隆,酶切鉴定并测序。BamH I和EcoR721双酶切pGEM T hTRX和pGEM T PR39,将获取的PR39/BamHI,EcoR721片段克隆到pGEM T hTRX/BamHI,EcoR721载体中,构建pGEM T hTRX PR39载体。结果经DNA测序证实,修饰过的hTRX cDNA、PR39 cDNA片段的核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pGEM T hTRX PR39酶切图谱证实hTRX PR39融合肽cDNA已克隆到pGEM T表达载体中。结论成功克隆出具有EcoR721和EcoRI、BamH I和EcoR721酶切位点的hTRX cDNA和PR39 cDNA片段,并构建pGEM T hTRX PR39载体。     

抗冻蛋白基因表达载体的构建和表达

目的 构建可用于大肠杆菌表达系统的含抗冻蛋白基因AFP的表达载体。方法 采用定向克隆方法将抗冻蛋白基因AFP全长插入表达载体pIN-Ⅲ－OmpA3,切除内含子,酶切鉴定重组质粒,IPTG诱导表达,热滞活性法测定AFP蛋白活性。结果 经酶切鉴定抗冻蛋白基因AFP插入表达载体pIN-Ⅲ－OmpA3中,切除内含子后,得到表达产物抗冻蛋白。结论 抗冻蛋白基因AFP的表达载构建成功,为将来工厂化生产抗冻蛋白奠定基础。     

PTEN基因真核荧光表达载体的构建及其在喉癌细胞株

目的: 构建人PTEN基因的真核荧光表达载体并在Hep-2喉癌细胞中高效表达,阐明PTEN基因在喉癌细胞株中的抑癌效果并为喉癌的基因治疗奠定基础。方法: 从人喉黏膜组织中提取总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到PTEN全基因。克隆入PGEM-T easy载体上,经过PCR和酶切鉴定为阳性的克隆,进行测序分析。将所获得的基因定向克隆入Pegfp-C1载体中构建PTEN真核荧光表达载体,并将其转入Hep-2细胞中进行表达,Western blotting检测其表达。结果: 反转录PCR扩增后的产物,在约1 400 bp处可观察到特异性条带,序列分析表明与GenBank中的PTEN基因序列相同。PCI-PTEN真核载体转染Hep-2细胞后的Western Blotting表明表达产物与抗人PTEN单克隆抗体有特异性免疫反应。结论：成功构建出PTEN真核荧光表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为PTEN蛋白。     

人血管紧张素转换酶2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人血管紧张素转换酶2基因(ACE2),并构建其真核表达载体。方法用Trizol试剂从人肺组织提取总RNA,然后经逆转录得到人ACE2的cDNA。半巢式PCR方法扩增人ACE2基因后,先进行T-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,接种含IPTG和x-Gal平板筛选重组子,并进一步亚克隆至真核表达质粒载体pcDNA3.1( )。经PCR扩增、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果获得了人ACE2的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。结论人血管紧张素转换酶2是SARS冠状病毒的功能受体,与SARS冠状病毒Spike蛋白上的受体结合域相结合,在SARS冠状病毒感染和传播中起重要作用,本工作为研究SARS冠状病毒感染及跨种属传播机制奠定了基础。     

人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达

目的:构建热休克蛋白70(HSP70)与人端粒酶逆转录酶融合表达载体,在大肠杆菌进行表达.方法:利用PCR方法扩增hTERT基因片段(532aa～637aa),双酶切后插入原核表达载体pET32a的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,形成pET32a-hTERT质粒.通过PCR方法扩增人HSP70全长cDNA.双酶切后插入pET32a-hTERT的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点之间,构建hTERT与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pET32a-hTERT-HSP70.含有该质粒的大肠杆菌BL21经异丙醛-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:成功的扩增了HSP70基因与hTERT基因片段;测序结果表明成功的构建了pET32a-hTERT-HSP70原核表达载体.含有该质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达约110 kD的蛋白.结论:HSP70与人端粒酶逆转录酶融合表达质粒构建成功,并成功获得了融合蛋白hTERT-HSP70.     

pEGFP-PDX-1真核表达载体的构建

目的：构建真核表达载体pEGFP-PDX-1，为基因水平研究PDX-1在肝干细胞定向分化中的调控机制提供理论参考。方法：参考分子克隆技术，采用PCR的方法从SK900/BLSCRIPT质粒中扩增PDX-1，同时将一个单个限制性酶切位点连接反应转变为以Hind Ⅲ和BamHⅠ为末端的双限制性内切酶位点连接反应，将PDX-1 cDNA定向插入pEGFP-C1的多克隆位点中，构建重组表达质粒pEGFP-C1-PDX-1，并对重组子进行SmaⅠ单个限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建了含有PDX-1 cDNA的真核表达载体pEGFP-PDX-1。结论：将PDX-1插入pEGFP-C1的C-末端，提高PDX-1在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能，对研究PDX-1调控肝干细胞的定向分化机制具有重要的意义。     

人幽门螺杆菌尿素酶B编码基因的克隆及序列分析

目的 获取含人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B编码基因并构建其原核表达的重组栽体，进行核甘酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增尿素酶B编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经SacI、Xhol双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp尿素酶B编码基因，与GenBank公布的序列相比较，有l.8％的bp发生变异，0．35％的氨基酸残基改变，但同源性高达98％。结论 成功地克隆了Hp尿素酶B编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白,并在Mr=52000附近出现特异性结合带;而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应,为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。     

基于分组重量编码和特征选择技术预测外膜蛋白

目的建立新的机器学习模型,从蛋白质数据集或全基因组蛋白质序列中预测外膜蛋白。方法采用分组重量编码和氨基酸组成计算蛋白质序列特征,采用F-score方法反向选择特征,采用支持向量机算法建立分类模型,在1 087条蛋白质序列构成的数据集上进行测试,评价预测模型的敏感性、特异性和预测精度,在多个细菌的全基因组蛋白质中预测外膜蛋白。结果新的序列组合编码方法与SVM相结合,区分外膜蛋白和α螺旋跨膜蛋白、球状蛋白、非外膜蛋白的准确度分别达到94.7%、96.4%和94.6%,经特征选择之后,分类准确度分别提高到95.7%、96.9%和95.9%,且在基因组数据集中的预测结果与已知事实相符度高。结论该方法预测准确度优于其他基于序列特征的预测方法,可用于在基因组序列中预测和筛选新的外膜蛋白。     

IL2－GMCSF融合蛋白高效表达条件的初步研究

已构建好的白细胞介素２－粒／巨噬细胞集落刺激因子（ＩＬ２－ＧＭＣＳＦ）融合基因载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α，进行热诱导表达条件的研究。工程菌在３０℃培养活化至ＯＤ６００ｎｍ＝０．５±０．１时，融合蛋白的表达率最为稳定；而后转为４２℃热诱导４±０．５ｈ，蛋白表达效率最高。     

人胰岛素原基因胰外表达重组体的构建及鉴定

目的:构建胰外表达成熟胰岛素的重组体.方法:将人胰岛素原基因进行二处突变,突变后的胰岛素原基因与逆转录病毒载体pLXSN重组并转染肝癌细胞.提取肝癌细胞基因组DNA,PCR方法鉴定人胰岛素原基因与载体重组结果及在肝癌细胞基因组中整合情况.同时测定成熟胰岛素的表达.结果:胰岛素原基因已整合到肝癌细胞基因组.突变的胰岛素原可被广泛存在的furin酶识别,在培养基内检测到较高浓度的成熟胰岛素.结论:成功构建胰外表达成熟胰岛素的突变人胰岛素原基因逆转录病毒重组体.     

稳定表达NGF、BDNF和NT3星形胶质细胞系的建立及其鉴定

目的：探讨星形胶质细胞直接作为转基因靶细胞进行目的基因的表达。 方法：克隆大鼠NGF、BDNF和NT3基因,构建真核表达载体;3种重组载体分别转染星形胶质细胞,G418筛选后获得阳性克隆细胞进行扩大培养;取基因修饰星形胶质细胞培养液上清培养PC12细胞或TrkB-PC12细胞;用Western blotting杂交或免疫组织化学方法检测基因靶细胞目的基因的表达及其水平。结果：经G418筛选后,转染NGF、BDNF和NT3基因修饰星形胶质细胞呈G418抗性;转染NGF和NT3基因条件培养液上清培养的PC12细胞,数量增多,突起明显变长,转染BDNF基因条件培养液上清培养的TrkB-PC12细胞,同样数量增多,突起明显变长。大部分G418抗性的基因靶细胞出现NGF、BDNF和NT3免疫染色阳性。Western blotting杂交显示有相应分子量大小的蛋白条带出现。 结论：星形胶质细胞直接作为基因靶细胞能有效地表达和分泌有生物学活性的NGF、BDNF和NT3。     

大鼠pEGFP-C3／BMP-2真核表达载体的构建

目的通过克隆大鼠的BMP2基因,构建EGFP—C3／BMP2基因的真核细胞表达载体。方法把大鼠的基因组DNA通过PCR获得BMP2,克隆构建载体pEGFP／C3－BMP2,并将其转化到大肠杆菌里面,最后进行重组真核表达载体pEGFP—C3-BMP2的构建和鉴定,并可观察其在真核细胞中的表达。结果以大鼠总DNA为模板扩增出1200bp左右的特异性条带,测序结果与Gene—Bank测序结果相比,翻译成的氨基酸序列相同并完全一致．并可在真核细胞中表达。对重组质粒pEGFP—C3／BMP2进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论为进一步研究利用BMP2基因修饰骨组织工程骨,促进骨折愈合再生提供实验基础。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

癌基因p28GANK突变体的构建及其对p53的调控

目的构建癌基因p28GANK缺失不同ankyrin序列的突变体,进一步研究p28GANK的功能及在肝癌发生发展中的作用。方法利用QuikChangSite-DirectedMutagenesisKit构建p28GANK5个ankyrin缺失突变体并检测各个突变体对p53的影响。结果构建出分别缺失第1个ankyrin(39～71aa)、第2个ankyrin(72～104aa)、第3个ankyrin(105～137aa)、第4个ankyrin(138～170aa)和第5个ankyrin(171～203aa)的突变体,琼脂糖凝胶电泳及蛋白免疫印迹法验证正确。野生型p28GANK可促进p53降解,其他突变体对p53的表达无明显影响。结论成功构建了p28GANK的5个突变体,证实p28GANK对p53的调控需要全部的ankyrin序列,为ankyrin的研究和p28GANK对肝癌的调控作用研究奠定了基础。