免抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景：凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白，它不仅具有氧化还原和电子传递功能，还具有促细胞凋亡功能，从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。目的：制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定。设计、时间及地点：单一样本观察，于200609／200808在新乡医学院免疫学研究中一心完成。材料：新西兰大白兔雌性2只，体质量1．9-2．1kg；JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司。食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者。抗原肽KLH由上海华大天源生物科技公司合成。CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司。方法：利用美国过敏和感染疾病研究所（NIAID）主办的抗原袁位分析网站（http：／／beta．immuneepitope．org／home．php）的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽，制备多克隆抗体并纯化。主要观察指标：采用间接ELISA、Westernblot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定。结果：间接EUSA法检测显示，血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1：128000。Westernblot结果显示，存在Mr67000条带。免疫组织化学检测结果显示，在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在，说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色。结论：实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体。     

快速斑点免疫酶渗滤法对血清乙肝e抗原的检测

最近 ,我们应用 DIEFA对 1 68份经 PCR诊断为 HBV-DNA阳性的血清进行检测 ,并与常规 EL ISA作比较 ,效果较好 ,报道如下。1　对象和方法1 .1　对象　乙肝 HBV- DNA阳性及正常人血清来自宁波市鄞州区人民医院。1 .2　硝酸纤维素膜 (NC)由上海医药工业研究院生产 ;PCR方法所用试剂购自华美生物工程公司 ;ELISA乙肝 e抗原试剂盒购自北京高达生物技术研究所。1 .3　酶标抗体　抗 HBe Ag单克隆抗体购自北京高达生物技术研究所 ,采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶 (Sigma产品 ) -抗体的结合物。1 .4　底物应用液　含 0 .0 6%…     

前列腺癌的实验室检测方法学研究进展

前列腺癌是目前常见的恶性疾病之一，且前列腺癌患者逐年增加，近几年发现实验室检测能早期检出原发性和潜在的转移性肿瘤，能检测到1个NCaP细胞／106阴性细胞，并在疾病发展过程中能为临床提供更多的资料。现发现一种新的蛋白──前列腺特异性膜抗原PSM，能在大多数前列腺转移性疾病中检测到。前列腺癌的实验室检测包括ELISA法检测前列腺特异性膜抗原（PSA），一步法双标记免疫荧光实验，Rt－PCR检测PSA，时间分辨免疫荧光法，Rt－PCR检测PSM。     

解脲脲原体四型MB抗原基因的克隆测序及其在大肠埃希菌中的表达

我们采用基因工程方法对解脲脲原体 (Uu)标准株 4型MB抗原基因进行体外扩增、测序及表达 ,为Uu疫苗和快速诊断试剂盒的研制奠定了基础。一、材料和方法1.菌株来源 :Uu4型标准菌株由南华大学病原研究所惠赠。pGEX 4T 1表达质粒 ;大肠埃希菌TG1为本室保存菌种。2 .主要试剂 :TaqDNA聚合酶、dNTP购自上海生物工程有限公司 ;DNA回收试剂盒购自Qiagen公司 ;限制性内切酶、T4DNA连接酶、IPTG等购自Takara公司。DNA膜板制备 :采用酚 /氯仿抽提法提取Uu4型标准菌株的DNA。3.引物设计及合成 :应用Primer5 0引物设计软件设计一对特异…     

兔抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景:凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用.目的:制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2008-08在新乡医学院免疫学研究中心完成.材料:新两兰大白兔雌性2只.体质量1.9～2.1 kg;JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司.食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者.抗原肽-KLH由上海华大天源生物科技公司合成.CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司.方法:利用美国过敏和感染疾病研究所(NIAID)主办的抗原表位分析网站(http://beta.immuneepitope.org/home.php)的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化.主要观察指标:采用间接ELISA、Western blot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定.结果:间接ELISA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1:128000.Western blot结果显示,存在Mr67000条带.免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色.结论:实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体.     

梅毒螺旋体抗体化学发光试剂盒的研制及相关方法的比较

[目的]建证检测TP抗体化学发光免疫分析方法并与相关方法的比较。[方法]应用基因重组的TP抗原p15、p17和p47蛋白混合包被化学发光微孔板作为崮相抗原；用辣根过氧化物酶（HRP）标记以kp15、p17和p47抗原蛋白，应用含Luminol及其增强剂的化学发光底物作示踪剂，通过条件优化建立检测血清中TP抗体的双抗原夹心化学发光免疫分析法。应用该方法制备的TP抗体化学发光免疫分析试剂盒进行特异性、灵敏度、稳定性、精密性考察，并与TRUST、TPHA、TPPA和ELISA方法进行对比。[结果]建立了TP抗体化学发光免疫分析试剂盒（双抗原夹心法）。用本方法检测TP抗体国家参考品，完全符合国家参考品的质量标准；检测1380例TP抗体阴性血清（包括92例孕晚期孕妇血清，88例自身免疫性疾病血清，1200例正常人血清），阴性符合率100％；柃测300例TP抗体阳性血清，刚性符合率100％；其制备的试剂盒于37％放置6d表现稳定；批内变异系数为3．2％～3．8％；与相关方法比较，该方法的灵敏度较TRUST、TPHA和TPPA高，特异性较ELISA好。[结论]该法特异性强，灵敏度高，精密性及稳定性好，适用于献血员的筛查和临床TP感染的检测。     

人血小板膜糖蛋白VI胞外区片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 探讨在原核细胞中表达人血小板膜糖蛋白Ⅵ（GPVI）胞外区片段，制备其多克隆抗体。方法 采用PCR技术扩增人血小板GPVI胞外区片段123aa～268aa的基因序列，构建其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达。表达产物经亲和层析法纯化及鉴定后，免疫家兔制备多克隆抗体。采用已知单克隆抗体进行ELISA双抗夹心法、Westernblot和流式细胞术鉴定其特异性。结果构建的重组质粒经酶切和测序证实序列正确。经诱导表达在相对分子量为4200处有一条明显融合蛋白条带，Westernblot分析证实与预期值一致。所得的抗血清效价为1：128，ELISA双抗夹心法检测表明，所制抗体识别血小板GPVI分子。Westernblot和流式细胞术检测结果显示所制抗体可与血小板裂解液中及血小板膜表面GPVI分子发生特异性免疫反应。结论利用原核细胞表达的人血小板GPVI分子胞外区片段能有效地诱发动物产生多克隆抗体，所得抗体与人血小板上GPVI分子特异性结合，为深入研究GPVI分子提供了工具。     

牛垂体bFGF的纯化及生物、生化性能检测

我们从牛垂体中提纯了碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF),并对其一些性能进行了研究。1　材料与方法11　材料　牛垂体购自内蒙古屠宰厂;人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由本实验室分离、培养;成纤维细胞取自白求恩医科大学地方病研究所;肝素Sepharose,CMSephadexC50购自Phamacia公司;199培养基、1640培养基购自Gibco公司。12　方法121　制备bFGF粗提物　将-100℃冻存的牛垂体组织匀浆,分步用015M、2M、4M的(NH4)2SO4沉淀蛋白,收集各步沉淀蛋白。122　CMSephadexC50离子交换层析　将所得的粗提物除盐、平衡后加入已用PBS缓冲液平衡好的C…     

胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体

目的：建立一种简便、快速的检测血清中人巨细胞病毒（HCMV）抗pp150抗体的胶体金免疫斑点法。方法：采用Frens法制备胶体金颗粒，标记葡萄球菌A蛋白（SPA），将本所利用基因工程技术生产的pp150抗原固定于0．45μm孔径的硝酸纤维素膜上，制成免疫斑点检测装置。血清中抗pp150 IgG与硝酸纤维素膜上的抗原结合，然后滴加胶体金标记的SPA，在膜上可形成肉眼可见的红色斑点。结果：胶体金免疫斑点法与ELISA试剂盒对比检测了200份临床确诊血清标本中抗pp150 IgG抗体，胶体金法的特异性和敏感性分别为92％和90％。结论：胶体金免疫斑点法检测血清中的抗pp150抗体特异性、灵敏度较高，简便快速，不需要昂贵的仪器。     

流行性出血热病毒抗体酶免试剂盒的应用

流行性出血热（epidemic hemorrhagic fever，EHF）的实验室诊断主要是检测病人血清中的特异性抗体。采用EHF病毒重组抗原建立了测定EHF病毒抗体的ELISA方法，并对方法进行了考核。与用病毒提取物作抗原的酶免试剂盒对比检测临床标本，灵敏度与特异性均优于后者，精密度和稳定性均符合试剂盒的要求。该方法操作简单、试剂稳定，已制备成试剂盒在国内应用。     

白血病干细胞的新型标志蛋白IL1RAP杂交瘤细胞的制备及其分泌单克隆抗体的检测

本研究旨在制备针对白血病干细胞表面标志蛋白IL1RAP（IL-1receptoraccessoryprotein）的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。用重组人IL1RAP作为抗原免疫BALB／c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2／0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株。分别应用EusA和Westernblot法对杂交瘤细胞上清中分泌抗体进行抗体类型、滴度和敏感性检测。分离人外周单个核细胞,检测所得抗体对细胞内源性抗原的特异性。结果表明,获得了8株可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为3H6E10、486A6、8G1185、9E9F2、10D8A7、1C7H7、1D7G11和2D3D3;抗体类型鉴定为IgG1／K型;分泌的单克隆抗体能特异性识别单个核细胞表达的IL1RAP。结论：本实验成功制备了可稳定分泌IL1RAP单克隆抗体的杂交瘤细胞及其特异性的IL1RAP单克隆抗体,为将来有效清除体内白血病干细胞提供了新途径。     

幽门螺杆菌virD4基因的克隆表达及其功能初探

目的研究幽门螺杆菌SBK临床分离株virD4的功能。方法通过T-A克隆获得virD4基因片段;构建pET-28a(+)-virD4原核表达载体,转化入Rosetta工程菌,IPTG诱导表达;KCl染色切胶纯化法获得重组蛋白质,SDS-PAGE法分析鉴定重组蛋白质;纯化的重组蛋白质免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA法检测效价,western blot法分析抗原反应特异性;重组蛋白质与GES-1细胞共培养,检测其对细胞炎症因子的表达及细胞增殖的影响。结果 virD4基因全长为1 728 bp,序列与Shi470菌株的virD4基因同源性较高;成功构建原核表达载体,经诱导及纯化获得相对分子质量为63 000的重组蛋白质;成功免疫小鼠制备多克隆抗体,效价为512 000,抗原抗体反应具有特异性;virD4能诱导GES-1细胞分泌炎症因子和增殖。结论成功克隆并表达virD4基因,制备多克隆抗体,其重组蛋白质能诱导细胞因子分泌及细胞增殖。     

脑囊虫单克隆抗体Dot—ELISA检测循环抗原的临床应用

检测宿主体液中的循环抗原(CAg)则可准确判断宿主体内有无活虫存在,从而提供治疗依据.脑囊虫病的特异性CAg 测定已有报道.本文用McAb Dot-ELISA 检测CAg 诊断脑囊虫病.1 材料与方法1.1 猪囊尾蚴囊液抗原的制备按张洪花等报道的方法进行.1.2 抗猪囊尾蚴抗原McAb 的制备按常规方法进行.1F11 McAb 系IgG_1亚类;其与包虫抗原及肝吸     

幽门螺杆菌IgG抗体免疫层析分型方法的建立

目的建立1种检测血清中抗幽门螺杆菌(Hp)抗体的胶体金免疫层析(GICA)方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记SPA,将Hp重组抗原VacA、CagA和UreaA、UreaB抗原包被于硝酸纤维素膜NC上,制成免疫层析检测试纸条.血清中的抗Hp抗体与测试条上金标记物结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的酒红色线条。结果用GICA与免疫印迹试剂盒对比检测了180份血清标本中抗Hp抗体,显示本方法检测敏感度、特异度分别为95.4%和96.3%,两法总符合率为96.1%。结论用这种免疫层析GICA分型方法检测血清中抗Hp抗体,灵敏度高、特异性强、简便快速,有着广泛临床应用前景。     

人HL-60白血病细胞混合抗原肽诱导特异性免疫应答的研究

目的：研究人HL－60白血病细胞混合抗原肽诱导特异性免疫应答的作用及其特异性。方法：用细胞冻融、加热沉淀及酸处理等方法除去HL－60细胞的核酸，脂质及大部分蛋白，制备混合抗原肽，体外将抗原肽与热休克蛋白70（Hsp70)结合，以T细胞体外激活试验检测结合物对人外周血单个核细胞（PBMNC）的刺激作用。并对激活的淋巴细胞进行传代培养，观察细胞的增殖；收集传代增殖的淋巴细胞，检测其对HL－60及K562白血病细胞的杀伤功能。结果：采用上述方法制备的抗原肽为混合肽，该混合肽经Hsp70提呈后，体外能激活PBMNC，并使激活的细胞增殖，增殖的淋巴细胞可特异性地杀伤HL－60细胞，但对K562细胞无杀伤作用。结论：白血病细胞内含有可用生化方法制备的特异性抗原肽；利用Hsp70提呈此抗原肽可知细胞毒性T淋巴细胞增殖，对白血病细胞产生特异的杀伤作用，对于化疗后防止血病复发将具有十分重要的意义。     

聚砜膜生物反应器实验系统构建及对重型肝炎患者血浆的影响

背景：人工肝反应器性能的评价通常需要构建一个密闭实验装置模拟生物人工肝支持系统来对反应器内肝细胞的生物功能以及生物反应效率等进行综合评价，对聚砜膜中空纤维反应器的性能进行初步评价对优化生物人工肝支持治疗系统具有一定意义。目的：构建聚砜膜生物反应器实验系统，了解该系统对重型肝炎患者血浆的影响，观察聚砜膜中空纤维反应器作为生物人工肝反应器的可行性。设计：重复测量实验。单位：第三军医大学西南医院全军感染病研究所。材料：选用7只新生1-7d中国实验小型猪，雌雄不拘，由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号码：F99017实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1试剂盒购自中国晶美生物工程公司；聚砜膜中空纤维反应器订制于中国上海德宏生物材料研究所；Cellco培养循环式人工毛细管培养系统购于美国Spectrum公司；7份重型肝炎患者血浆样本均取自住院慢性重型肝炎患者做血浆置换时分离的血浆。患者均对实验项目知情同意，实验经过医院伦理委员会批准。方法：实验于2004—01／2005-07在第三军医大学西南医院全军感染病研究所实验室完成。①实验过程：实验前12h对实验猪进行断乳，清洁皮毛后分离肝细胞。将聚砜膜中空纤维反应器的内腔通过氧和二氧化碳弥散管与培养液贮池和Cellco培养液循环式人工毛细管培养系统连接成为密闭系统，外腔接口用洁净橡胶塞封闭。用磁力搅动法将分离的肝细胞进行球形体培养，接种到本系统的聚砜膜中空纤维反应器外腔，然后加重型肝炎患者血浆样本200mL于贮液池中，以80mL/min的速度在反应器内腔及贮液池中循环。②实验评估：在循环的0，2，4，6h从反应器内腔各取出2mL循环液，用谷氨酸脱氢酶．紫外法检测上清中氨的水平，全自动生化分析仪上检测标本中总胆红素的含量，在全自动血凝仪上检测标本的凝血酶原时间，肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1的检测参照试剂盒说明书进行。主要观察指标：聚砜膜生物反应器系统对重型肝炎患者血浆的血氨、胆红素、凝血酶原时间、肿瘤坏死因子α及转化生长因子β1的影响。结果：①血氨、总胆红素、凝血酶原时间检测结果：重型肝炎患者血氨水平持续降低，0-2h下降最明显，其后血氨水平下降趋势减缓；总胆红素水平持续降低，6h的总胆红素水平明显低于0h，差异有显著性意义（P〈0．05）：凝血酶原时间持续降低，6h的凝血酶原时间较0h降低，差异具显著性意义（P〈0．05）。②肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1检测结果：重型肝炎患者血浆的肿瘤坏死因子α及转化生长因子β1含量持续降低，其中6h均明显低于0h，差异具显著性意义（P〈0．05）。结论：砜膜生物反应器实验系统能够清除重型肝炎患者血浆中的小分子有毒物质，补充有益成分，降低细胞因子水平，可作为生物人工肝反应器。     

捕获包被ELISA方法检测血小板抗体的可行性研究

[目的]建立一种可以同步进行血小板抗体筛选和配型的捕获包被ELISA检测方法。[方法]应用纯化的兔抗人血小板多克隆抗体包被酶联反应板，采用磷酸氯奎处理血小板用以去除其表面的HLA抗原，应用TritonX-100进行血小板裂解，反应条件运用方阵滴定法和正交实验原理进行优化，确定最佳反应模式及酶标记物浓度，并进行方法学评价和统计学分析。[结果]成功构建了试验程序，纯化的抗体与血小板膜抗原优势表位均具有良好的反应性。本方法敏感度高、特异性强，而且可以进行区分血小板抗体类型及相容性检测。[结论]捕获包被ELISA方法通用于血小板抗体筛选和快速配型，有助于血小板膜糖蛋白以及血小板免疫学的研究，具有较大的临床应用价值；     

负载肿瘤抗原的DC疫苗体外诱导的特异性抗膀胱癌效应研究

目的探讨负载膀胱癌抗原成分树突状细胞（dendritic cells,DC）疫苗的制备和体外诱导T淋巴细胞特异性杀伤膀胱癌细胞的作用。方法冻融法制备EJ细胞裂解物抗原成分,体外培养的人外周血单个核细胞（hu-PBMC）在rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α诱导下分化出DC,负载EJ细胞裂解物抗原后制备膀胱癌DC疫苗;免疫磁珠分离法从人免疫重建Balb/c裸小鼠脾脏组织中分离CD3＋T淋巴细胞,3H-TdR掺入试验测定DC疫苗刺激自体T淋巴细胞增殖的能力,51Cr释放试验检测DC疫苗诱导的T细胞对EJ细胞的杀伤作用。结果 Hu-PBMC在细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α的刺激下分化为成熟DC,负载EJ抗原的DC疫苗体外可使同源T淋巴细胞活化,增殖指数增加,活化的T淋巴细胞对EJ细胞的杀伤率为（62.58±6.13）%,和对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论负载膀胱癌冻融抗原的DC疫苗体外可诱导人T淋巴细胞活化增殖,对EJ细胞有明显的杀伤作用。     

检测烟曲霉菌GM抗原生物素-亲和素-夹心酶联免疫吸附试验法的建立

本研究用重组烟曲霉半乳糖甘露聚糖 (ＡＦＭＰ1) ,制备免疫血清 ,建立一种以生物素 亲和素 (ＢＡ)系统为基础的夹心酶联免疫吸附试验 (ＥＬＩＳＡ)法 ,快速检测烟曲霉ＧＭ抗原[1] 。一、材料与方法1.动物和菌株来源 :家兔和豚鼠购自第一军医大学动物所 ,表达ＧＳＴ ＡＦＭＰ1融合蛋白ＢＬ2 1菌种及全部真菌标准株均由香港大学微生物系提供。2 .主要试剂 :ＧＳＴ融合蛋白纯化试剂盒、ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ 4Ｂ和ＥＣＬ底物显色剂 (ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ公司 ) ,弗氏佐剂 (Ｓｉｇｍａ产品 ) ,活化Ｓｕｌｆｏ ＮＨ…     

提供抗类风湿关节炎实验工具:人Janus激酶1单克隆抗体的免疫学特性

目的:制备人Janus激酶1单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。方法:实验于2003-03/2005-04在湖南远泰生物技术有限公司免疫学实验室完成。用化学合成的部分人Janus激酶1多肽链与锁眼蓝蛋白偶联后的全抗原对BALB/c小鼠进行免疫,采用杂交瘤技术制备抗人Janus激酶1的单克隆抗体;同时采用酶联免疫吸附法和免疫印迹法进行筛选;免疫印迹法和免疫细胞化学分析鉴定单克隆抗体的特异性。结果:获得了一株可稳定分泌人Janus激酶1单克隆抗体的细胞株4E5D4,单抗的Ig亚类为IgG。通过免疫印迹法检测,发现其能够特异性识别人Janus激酶1蛋白。结论:成功制备了抗人Janus激酶1的单克隆抗体,为进一步研究其对类风湿关节炎的临床疗效提供了实验工具。