人PD-L1真核表达载体的构建及结肠癌细胞稳定表达单克隆株的筛选和鉴定

目的:构建人程序性死亡配体1（PD-L1）重组质粒载体,筛选稳定高表达人PD-L1的结肠癌单克隆细胞株。方法:提取HCT116细胞总RNA,RT-PCR克隆PD-L1基因片段,将其重组至含有HA标签和Neo真核细胞筛选抗性的pcDNA3质粒载体上,转染HCT116细胞,倍比稀释8个细胞浓度至96孔板,G418筛选两周,挑取单细胞克隆,通过免疫印迹鉴定外源性PD-L1的表达;通过MTS、Transwell和软琼脂细胞克隆形成实验比较PD-L1低表达和高表达单克隆细胞株生长增殖、迁移和细胞克隆形成能力的差别;最后通过在两组细胞中过表达帽依赖性荧光素酶报告基因阐述造成上述表型的可能机制。结果:成功构建人PD-L1的真核表达载体,并筛选获得稳定高表达PD-L1的HCT116单克隆细胞株。功能研究初步证明PD-L1可促进细胞克隆形成能力、迁移和生长增殖。过表达PD-L1可使帽依赖性荧光素酶报告基因的表达上调约3~4倍,表明其机制部分为PD-L1可上调帽依赖性蛋白质翻译。结论:获得了PD-L1重组质粒载体及可用于后续功能研究的稳定高表达人PD-L1的HCT116单克隆细胞株。     

热休克蛋白gp96表达对B16F10细胞生长的影响

目的　探讨热休克蛋白gp96表达对B16F10细胞株生物学行为的影响。 方法　构建gp96正义和反义真核重组表达质粒 pcDNA hgp96和 pcDNA anti96P ,并转染B16F10细胞 ,G 418筛选稳定转染的阳性细胞克隆 ,然后Western印迹分析细胞gp96的表达情况 ,绘制细胞生长曲线 ,观察 gp96表达对细胞生长特性的影响。 结果　转染了 gp96正义表达质粒的B16F10细胞gp96表达水平升高 ,细胞生长缓慢 ,倍增时间延迟 ;反义gp96表达质粒明显抑制了B16F10细胞 gp96表达 ,使细胞倍增时间提前。结论　热休克蛋白 gp96表达水平升高可抑制肿瘤细胞的生长 ,而 gp96表达水平下降则肿瘤细胞生长速度加快 ,表明gp96在肿瘤发生发展中有非常重要的作用     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

利用荧光素酶标记的肿瘤细胞建立活体成像动物模型

目的建立稳定表达荧光素酶的人乳腺癌细胞株并构建适用于小动物活体成像系统观察的裸鼠皮下移植瘤模型。方法采用脂质体将携带荧光素酶基因的质粒转染到人乳腺癌细胞株MCF-7中,G418筛选出稳定表达荧光素酶的单克隆细胞株。扩增后接种于裸鼠,建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过活体动物成像系统监测肿瘤的生长过程。结果获得了高水平稳定表达荧光素酶的乳腺癌单克隆细胞株,该单克隆细胞株与母细胞系MCF-7具有相似的生长特性。将稳定表达荧光素酶的克隆接种于裸鼠皮下可成瘤,小动物活体成像系统能准确监测肿瘤细胞在体内的生长过程。结论成功建立了稳定表达荧光素酶的乳腺癌单克隆细胞株。采用活体动物成像系统构建的裸鼠皮下移植瘤模型是拓展肿瘤体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型。     

高表达CypA肝癌细胞系的建立及其功能初步研究

目的：构建含人全长CypA cDNA的真核表达质粒,建立高表达CypA蛋白的肝癌细胞系,为进一步研究CypA在肝癌中的功能和作用机制提供细胞模型。方法：将人全长CypA cDNA序列克隆后,连接至真核表达载体pcDNA3.1中,再将构建的真核表达载体转染至FHCC98肝癌细胞中,经G418加压筛选后获得稳定表达CypA的肝癌细胞株;免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况;MTT法测定细胞的增殖速率。结果：真核表达载体pcDNA3.1-CypA经酶切、测序鉴定,结果正确;免疫印迹结果显示,稳定转染后细胞的CypA表达水平显著高于空载体转染和未转染的细胞;与对照相比,稳定高表达CypA的细胞增殖速度加快。结论：成功构建了含有人全长CypA cDNA序列的真核表达载体pcDNA3.1-CypA;建立了稳定高表达CypA的FHCC-98肝癌细胞系;CypA的高表达可以促进FHCC98细胞的增殖。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

人TIMP-2基因真核表达质粒的构建及其表达研究

目的构建人T IM P-2基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达。方法利用RT-PCR方法获得人T IM P-2基因cDNA,以pcDNA 3为载体构建真核表达质粒pcDNA 3/T IM P-2,采用脂质体介导基因转染技术将重组质粒DNA导入CHO细胞中,加入G 418对转染细胞进行筛选获得稳定转染细胞,采用W estern b lot对重组质粒的表达进行检测。结果酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA 3/T IM P-2构建正确,在转化细胞中检测到人T IM P-2的表达。结论成功构建人T IM P-2真核表达质粒并获得稳定表达人T IM P-2的CHO细胞株。     

白介素6(IL-6)受体蛋白中核转运定位序列的研究

目的：研究gp130胞内区的假定核定位序列（nuclear localization sequence,NLS)是否具有核定位功能。方法：首先将编码SV40大T抗原NLS（阳性对照）和gp130胞内区假定NLS的cDNA分别插入真核表达载体pEGF-PN1,构建成表达质粒pSV-NLS-GFP和pGP-NLS-GFP。然后将这两种表达质粒分别转染HeLa细胞并采用genecitin筛选稳定表达细胞株,以加强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP)在细胞内的分布情况作为观察指标确定融合蛋白表达产物在细胞内的定位。结果：稳定转染表达质粒pSV-NLS-GFP的HeLa细胞并采用genecitin筛选稳定表达细胞株,以加强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP)在细胞内的分布情况作为观察指标确定融合蛋白表达产物在细胞内的定位。结果：稳定转染表达质粒pSV-NLS-GFP的HeLa细胞中绿色荧光主要集中分布在细胞核内;而转染了pGP-NLS-GFP的HeLa细胞中绿色荧光在细胞浆和细胞核内呈现出均匀分布状态。结论：gp130胞内区的假定NLS序列不具有核定位功能。     

基因转染法建立bcl-2稳定表达的肝癌细胞株

目的与方法：为了建立稳定表达 bcl-2蛋白的肝细胞癌（简称肝癌）细胞株,用脂质体介导的基因转染法将含有人 bcl-2,CDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒导入bcl-2蛋白阴性的肝癌细胞系HCC－9204细胞中,经G－418筛选后获得转 bcl-2基因的细胞克隆。细胞扩大培养后用免疫细胞化学法检测bcl-2表达情况,有限稀释法连续克隆化直至获得100％稳定表达bcl-2蛋白的单克隆细胞株,并进行流式细胞仪检测,结果：转染了pDOR-SB的HCC－9204细胞大部分为bcl-2蛋白表阳性,而转染了pDOR空载体或未转染的HCC－9204细胞均为bcl-2蛋白阴性,经过连续3次克隆化后,流式细胞仪检测表明所获得的单克隆细胞 100％表达bcl-2蛋白,结论：用基因转染法成功地建立了稳定表达bcl-2蛋白的肝癌细胞株。     

ANXAl1表达稳定下调小鼠肝癌Hca-F细胞株的构建

目的：构建膜联蛋白A11（annexinA11,ANXAll）稳定下调的小鼠肝癌高淋巴转移力细胞株Hca—F。方法：合成2条针对ANxAll的发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）序列shRNAl和shRNA2,连接到pGPU6／GFP／Neo质粒中,并转染到Hca—F细胞,获得了稳定转染的pGPU6／GFP／Neo—ANxAll-Hca—F细胞株。通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并利用RT—PCR和蛋白质印迹法验证ANXAll的表达变化。结果：成功构建了pGPU6／GFP／Neo—ANXAll重组表达质粒,并筛选出单克隆细胞;RT—PCR及蛋白质印迹法检测结果表明,与空白对照组比较,重组质粒pGPU6／GFP／Neo—A1l—Hca—F-1和2在mRNA水平,对ANXAll干扰率分别为（27．3±5．9）％和（58．3±12．4）％,P=0．001;在蛋白质水平,对ANXAll的下调率分别l为（57．4±4-0．9）％和（87．1±6．1）％,P〈0．001;shRNA-2对ANXAll的表达抑制效果更为显著,P〈0．001。结论：成功建立了ANXAll表达稳定下调的小鼠肝癌Hca—F细胞株,为进一步研究ANXAll在淋巴转移中的作用奠定前期基础。     

利用GFP逆转录病毒标记肿瘤与血管内皮细胞

目的 制备携带GFP基因的逆转录病毒,以简便、快速标记活细胞。方法 将编码GFP的cDNA片段插入逆转录病毒载体pLNCX构建重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP,借助脂质体转染单嗜性及双嗜性逆转录病毒包装细胞,G418筛选抗性克隆,然后利用荧光显微镜选出GFP表达最高的克隆。取含有毒颗粒的上清液感染NIH3T3及多种肿瘤或血管内皮细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染包装细胞后,包装细胞可表达GFP并产生GFP逆转录病毒。尽管GFP逆转录病毒对动物及人的肿瘤细胞或血管内皮细胞的感染能力各不相同,但由于逆转录病毒能整合进入宿主细胞基因组DNA内,经短期G418筛选后容易获得持续、稳定、高水平表达GFP的阳性细胞。表达GFP的肿瘤细胞仍可在同系动物体内生长并持续表达GFP。携带GFP基因的逆转录病毒能简便、快速介导稳定的基因转移,遗传标记多种细胞,比表达质粒等更优越。     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

靶向干预N-WASP蛋白功能区对大肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的研究靶向干预N-WASP蛋白的VCA功能区对大肠癌细胞侵袭转移能力的影响。方法构建含有N-WASP蛋白CA结构区域信息但缺乏V结构区域信息的重组表达质粒（CA质粒）,脂质体转染法将重组质粒及空质粒导入人高侵袭性大肠癌细胞株LoVo细胞内,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用Transwell侵袭小室和制备裸鼠结肠癌肝转移模型检测转染后LoVo细胞侵袭转移能力的变化。结果Transwell侵袭小室实验结果显示,重组质粒转染组LoVo细胞的穿膜细胞数量较空质粒转染组及未转染组明显减少（P〈0.05）。动物实验结果显示,重组质粒转染组的裸鼠肝脏表面的转移瘤结节数较空质粒转染组及未转染组明显减少,生存率明显提高,差异均具有统计学意义（P〈0.05）;而空质粒组和未转染组两者无明显差别（P〉0.05）。结论靶向干预N-WASP蛋白的VCA功能区能有效抑制大肠癌细胞的侵袭转移能力。     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.     

Anxa5真核表达质粒构建及其对小鼠肝癌Hca—P细胞增殖影响观察

目的：构建pcDNA3。1-V5／HisB—Anxa5真核表达质粒,获得膜联蛋白A5（AnnexinA5,Anxa5）表达稳定上调的小鼠肝癌Hca—P细胞株,探究Anxa5上调对Hca—P增殖的影响。方法：利用RT—PCR扩增小鼠全长Anxa5编码序列,将其克隆到pcDNA3．1-V5／HisB载体中,并将构建的pcDNA3．1-V5／HisB-Anxa5表达质粒转入Hca—P细胞。采用（;418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,观察细胞形态变化。蛋白质印迹法分析Anxa5表达情况,CCK-8法检测相应Hca—P细胞的增殖能力。结果：酶切及测序结果显示,pMD R 18-T—Anxa5克隆质粒和pcDNA3．1-V5／HisB-Anxa5表达质粒构建成功;获得了Anxa5表达稳定上调的单克隆细胞株;与正常Hca-P比较,Anxa5蛋白在pcDNA3．1一V5／HisB-Anxa5-Hca-P单克隆细胞中上调了59．5％,P一0．016;pcDNA3．1-V5／HisB～Anxa5-Hca—P增殖显著加快,P=0．002。结论：成功构建了Anxa5真核表达质粒并获得Anxa5表达稳定上调的小鼠肝癌Hca—P细胞株,Anxa5上调对Hca—P细胞的增殖具有促进作用,为后续研究提供实验基础。     

宫颈癌Fas阳性表达细胞株的建立

目的　将Fas基因转入宫颈癌细胞 ,建立Fas基因表达株。方法　采用分子克隆技术将Fas基因插入表达载体 pBC的多克隆位点 ,用脂质体介导将Fas基因转入宫颈癌细胞株HeLa中 ,用G4 18筛选克隆细胞 ,扩增并检测Fas基因的表达。结果　成功地构建了表达载体 pBC -FascDNA ,用脂质体介导转入HeLa中 ,可见抗性克隆产生 ,随机挑选 2个克隆扩增培养 ,获得 1株稳定的抗性细胞 ,从而建立了Fas基因表达株 (HeLaFasceells) ,杂交结果表明转导株Fas蛋白表达明显高于非转导株。结论　Fas基因在宫颈癌细胞中处于低表达 ,通过表达载体介导 ,可将Fas基因转入宫颈癌细胞并过表达。     

A monoclonal antibody against the c-erbB-2 protein enhances the cytotoxicity of cis-diamminedichloroplatinum against human breast and ovarian tumor cell lines.

A monoclonal antibody (TAb 250) specific to an extracellular epitope of the c-erbB-2 protein (gp185) inhibited the in vitro proliferation of human breast tumor cell lines that overexpress c-erbB-2 in a dose-dependent manner. Treatment of cells with combinations of cis-diammedichloroplatinum (CDDP) and TAb 250 resulted in a significantly enhanced cytotoxic effect. This synergistic cytotoxicity was apparent over a wide range of antibody concentrations (200 pg/ml-100 micrograms/ml) including concentrations that showed no inhibitory effect alone. TAb 250 did not increase the cytotoxic effect of CDDP in a cell line exhibiting no detectable level of gp185. Athymic mice bearing s.c. xenografts of human tumor cells expressing high levels of gp185 showed a greatly enhanced inhibition of tumor growth when treated with TAb 250 and CDDP compared to treatment with the antibody or CDDP alone. This effect was specific inasmuch as TAb 250 did not enhance the growth-inhibitory effect of CDDP on tumor xenografts which were not expressing gp185.