IL-1O基因修饰的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨hIL-10基因修饰的未成熟树突状细胞(imDC)诱导大鼠肝移植免疫耐受的能力.方法:行以DA大鼠为供体、Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植100例,随机分为5组(每组4只):未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组及hIL-10基因转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC和hIL-10修饰的imDC各2 × 106个,于肝移植术后3、7、10d各处死4只,观察外周血肝功能及IL-12变化,并对移植后大鼠做生存分析.结果:IL-10组术后移植肝为非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应.肝功能示IL-10组在7d、10d时,肝功能有所恢复,但与imDC组及空载体组相比差异无统计学意义.ELISA检测示,术后7d,IL-10组的血清IL-12浓度均低于mDC组及imDC组.IL-10组中位生存期(40d)长于其他组.结论:hIL-10基因修饰的imDC诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受能力显著增强,显著延长同种异体肝移植大鼠的生存期.     

受体血诱导大鼠肝移植免疫耐受的机制探讨

目的将受体血预先经门静脉输入供体，探讨肝移植后免疫排斥反应的变化。方法将LEW大鼠和ACI大鼠作为受体和供体。移植前7d将受体血经门静脉输入供体，移植后检测移植肝内供体源性树突状细胞，检测移植肝组织内IFN-γmRNA的表达，检测移植肝内浸润细胞的凋亡。结果移植前7d受体血经门静脉输入供体组的生存时间显著延长，为（33．7±2．6）d，无处置组为（10．1±0．7）d。移植肝组织内IFN-γmRNA有明显表达，移植肝内检测到大量供体源性树突状细胞。移植肝的浸润淋巴细胞凋亡显著多于无处置组。结论移植肝内浸润淋巴细胞凋亡抑制了肝移植排斥反应。     

预输注RelB shRNA慢病毒修饰树突细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受

背景:肝移植后的排斥反应是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。诱导受者产生特异性免疫耐受是解决排斥反应的理想措施。目的:探讨RNAi RelB树突状细胞预输注诱导大鼠肝移植特异性免疫耐受的可能性。方法:将近交系雄性清洁级DA(RT1a)大鼠和近交系雄性SPF级Lewis(RT11)大鼠分别作为供、受体,行原位肝移植手术。术前随机配对分为4组:①对照组,受体鼠移植前不做预输注。②治疗组:受体鼠移植前7d静脉输注供体大鼠RNAi RelB树突状细胞(5×106)。③未成熟树突状细胞组:受体鼠移植前7d静脉输注供体大鼠未成熟树突状细胞(5×106)。④成熟树突状细胞组:受体鼠移植前7d静脉输注供体大鼠成熟树突状细胞(5×106)。结果与结论:与对照组、未成熟树突状细胞组以及成熟树突状细胞组相比,治疗组移植肝的平均生存时间显著延长。移植后第7天,治疗组天冬氨酸转氨酶,总胆红素水平低于对照组、成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞组(P<0.01),移植后第14天治疗组、未成熟树突状细胞组天冬氨酸转氨酶,总胆红素均有轻微下降,两组比较差异仍有显著性意义(P<0.01)。移植后第7天,与治疗组比较,对照组、成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞组γ-干扰素、白细胞介素2水平升高(P<0.01),而白细胞介素4、白细胞介素10下降(P<0.01);移植后第14天治疗组、未成熟树突状细胞组γ-干扰素、白细胞介素2水平均有下降,白细胞介素4、白细胞介素10水平均有升高,两组比较差异仍有显著性意义(P<0.01)。对照组、成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞组移植后第7天排斥活动指数为8.0-9.0。未成熟树突状细胞组第14天肝细胞、内皮细胞坏死及汇管区炎性细胞浸润进一步增多。治疗组移植后第7天排斥活动指数为6.0-8.0,第14天时排斥活动指数为4.0-5.0。结果提示RNAi RelB树突状细胞预输注可以减轻移植肝排斥程度,延长移植肝生存时间,这是通过间接途径实现的,其机制可能与T细胞的调节和无能有关。     

树突状细胞与免疫耐受

树突状细胞(DC)是目前发现体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(APC),其主要来源于CD34+造血干细胞.依据其成熟状态的不同而发挥不同的免疫调节作用,如成熟树突状细胞(mDC)可激活T细胞促进免疫应答,未成熟树突状细胞(imDC)及调节性树突状细胞(DCreg)可负向调节免疫应答,诱导免疫耐受.DC在感染、免疫性疾病、移植免疫及恶性肿瘤的发病机制与治疗中的作用成为免疫学界研究的焦点.近年来DC诱导免疫耐受的研究受到越来越多的关注,笔者就DC在免疫耐受中的作用作一综述.     

基因修饰树突状细胞诱导抗血液肿瘤效应的研究进展

白血病/淋巴瘤等血液肿瘤经联合化疗,可以获得完全缓解,但难彻底消灭肿瘤微小残留病(MRD)。基因修饰的树突状细胞瘤苗以其增强肿瘤细胞的免疫原性,启动机体的特异性抗肿瘤免疫应答,成为清除MRD的一种有希望的途径。本文就树突状细胞的生物学特性及其诱导培养,基因转移载体的选择,以及不同来源基因修饰DC诱导抗血液肿瘤的特点等方面的研究进展进行综述。     

树突状细胞与移植免疫耐受研究新进展

树突状细胞(DC)的生物学功能和免疫学特性是目前医学免疫学的研究热点之一。随着对DC免疫/耐受关系的进一步认识,最大限度地发挥其耐受潜能,从而探寻诱导移植免疫耐受新的治疗方法。     

NKT细胞通过IL-10参与诱导小鼠心脏移植免疫耐受

目的探讨NKT细胞在诱导小鼠心脏移植免疫耐受中的作用机制。方法 BALB/c小鼠作为供体,C57BL/6小鼠作为受体,建立小鼠腹部异位心脏移植模型。排斥组:单纯行心脏移植,无其他处理;耐受组:受鼠于术前7天接受BALB/c来源脾细胞(1×107个/只)尾静脉注射,并分别于术前7天、5天、3天,接受抗CD40L抗体腹腔注射(250μg/只/次)。术后通过腹部移植心触诊,观察移植心存活情况;分别取排斥组术后10天及耐受组术后50天的受鼠脾脏,分离NKT细胞,通过混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)检测NKT细胞的免疫抑制功能;通过ELISA法检测NKT细胞的细胞因子分泌情况。结果 NKT细胞可以抑制供体抗原特异性淋巴细胞增殖,并可通过IL-10参与诱导免疫耐受。结论 NKT在诱导小鼠心脏移植免疫耐受过程中起重要作用。     

小鼠白细胞介素10重组腺病毒载体构建及对树突状细胞的基因修饰

背景:对于抗原递呈细胞树突状细胞及其分泌的细胞因子白细胞介素10在气道高反应性和炎症中的作用国内外文献报道较少.目的:构建小鼠白细胞介素10腺病毒重组体Ad-mIL-10,获得小鼠白细胞介素10基因修饰的树突状细胞,以期为下一步基因治疗的动物实验打下基础.方法:通过人工合成获得小鼠白细胞介素10基因,根据白细胞介素10基因序列及腺病毒载体的多克隆位点,合成包括酶切位点的基因序列,连接到pMD18-T载体并测序鉴定.用基因工程的方法将小鼠白细胞介素10基因克隆到BDAdeno-X~(TM)腺病毒载体,于人胚肾293细胞中包装、扩增病毒并测定白细胞介素10蛋白表达,转染到体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞.结果与结论:成功构建了小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并高包装、扩增成功,测定高表达白细胞介素10蛋白,体外成功培养小鼠骨髓来源的小鼠树突状细胞并顺利转染Ad-mIL-10.提示用基因工程方法构建小鼠Ad-mIL-10重组腺病毒载体并转染小鼠骨髓来源的树突状细胞是可行的,可为进行相关基因治疗的可能性提供更充足的理论依据.     

树突状细胞在器官移植中诱导免疫耐受的机制

19世纪40年代英国外科医生Medawar证实移植排斥的实质是免疫反应，而免疫反应的产生首先是由抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APC）捕获抗原，经其加工、处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞，从而诱发一系列特异性免疫应答。免疫耐受（immune tolerance）是机体对某种抗原刺激不产生反应，而对其他抗原刺激仍有免疫应答的能力。     

GM-CSF基因修饰、抗原预激的树突状细胞体内诱导白血病细胞分化的实验研究

目的：探讨树突状细胞在肿瘤免疫治疗过程中的作用及机制。方法：以小鼠ＦＢＬ３红白血病细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠建立荷瘤模型，采用流式细胞仪分析和透射电镜等技术，观察了粒巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）基因修饰的抗原预激的树突状细胞体内治疗作用。结果：采用ＧＭＣＳＦ基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗，可以明显抑制白血病细胞生长；白血病细胞表达ＣＤ１４水平增加，同时ＭＨＣⅡ、Ｂ７１、Ｂ７２、ＶＣＡＭ１表达水平亦显著升高；组织学观察显示瘤组织内具有不同分化阶段的单核细胞，电镜下可见白血病细胞体积减小、细胞器较成熟、胞浆中出现较多的溶酶体、核／浆比值减小及白血病细胞的凋亡。肿瘤内部及外周血中，ＣＤ８＋细胞百分率亦较各对照组明显升高。结论：采用ＧＭＣＳＦ基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗，可以体内诱导白血病细胞向成熟单核细胞方向分化     

白细胞介素-2和10 mRNA表达差异在CD4+CD25+T细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受中的意义

目的 探讨白细胞介素-2(IL-2)mRNA及IL-10 mRNA表达水平对大鼠肝移植耐受的影响.方法 将实验大鼠随机分3组:Ⅰ组为急性排斥组; Ⅱ组为CD4+CD25+T细胞处理组,供体Wistar大鼠,受体SD大鼠;Ⅲ组为移植对照组,供体、受体均为SD大鼠.每组12对.肝移植前7 d,Ⅱ组受体大鼠经阴茎背静脉注射含供体脾淋巴细胞的培养液,Ⅰ组、Ⅲ组注射等量生理盐水;术后7 d随机取6只大鼠用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肝组织中细胞因子IL-2 mRNA及IL-10 mRNA的表达,用流式细胞仪检测各组移植肝内分离出的淋巴细胞含量,同时检测肝脏病理学的变化;另6只观察移植大鼠的生存期.结果 IL-2mRNA在Ⅰ组大鼠移植物内出现高表达,Ⅱ组仅有微弱表达,Ⅲ组则未见表达,IL-10 mRNA仅在Ⅱ组中表达,且表达程度较强.Ⅱ组和Ⅲ组大鼠存活期均超过30 d,与Ⅰ组(8～11 d)比较差异有统计学意义(P均＜0.01).Ⅰ组大鼠移植后肝脏有大量淋巴细胞浸润,数量明显高于Ⅱ组和Ⅲ组[(14.31±3.41)×106 /g比(5.04±1.13)×106 /g和(1.55±0.40)×106 /g,P均＜0.01],且显示中度排斥反应.Ⅱ组大鼠有中等量淋巴细胞浸润,病理为无排斥或不确定性排斥,且淋巴细胞中CD4+百分比[(43.31±8.07)%]和CD4+CD25+百分比C(11.39±1.92)%]均显著高于Ⅰ组[(33.65±7.25)%,(3.05±0.62)%]和Ⅲ组[(31.18±6.52)%,(3.37±0.72)%],差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).Ⅲ组未见明显淋巴细胞浸润,病理为无排斥反应.结论 IL-2参与了移植排斥的发生,而IL-10在CD4+CD25+T细胞诱导免疫耐受中具有非常重要的作用.     

小鼠调节性树突状细胞分泌的外泌体诱导免疫耐受的实验研究

本研究探讨小鼠调节性树突状细胞（rDC）分泌的外泌体（regulatory exosomes，rDex）诱导免疫耐受的作用，并与正常未成熟树突状细胞的外泌体（immature exosomes，iDex）诱导免疫耐受的作用进行比较。取C57BL／6（H-2^b）小鼠骨髓细胞诱导未成熟树突状细胞（iDC），TGF—β1联合IL-10诱导调节性树突状细胞（rDC），流式细胞术检测两种DC的表型。采用超速离心结合膜超滤的方法分别提取rDex和iDex。建立小鼠皮肤移植模型．以C57BL／6小鼠为供者，以BALB／c（H-2^d）小鼠为受者，按对受者处理的不同实验分3组，iDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的iDex，rDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的rDex，另设PBS对照组，观察移植皮肤存活情况。通过单向混合淋巴细胞反应（MLR）观察供者及非亲缘异基因供者DBA／2对同种异基因小鼠T细胞增殖情况。结果表明：TGF—β1、IL-10可下调DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达。移植皮片平均存活时间（MST），在对照组为7、8天，iDex组为10．7天，rDex组为18．8天；iDex组的移植皮片MST明显长于对照组（P〈0．05）；rDex组的移植皮片MST明显长于iDex组（P〈0．01）。MLR结果证明iDex组和rDex组B／C小鼠均对C57小鼠的脾细胞产生特异性耐受，尤其是rDex组；对非亲缘异基因DBA供者的脾细胞两组仍表现出强烈的免疫应答。结论：iDex和rDex均有诱导免疫耐受的作用，且rDex作用较iDex作用好。     

IL-2基因修饰增强树突状细胞抗原提呈功能及其机制

目的　研究IL 2基因修饰增强小鼠骨髓来源的树突状细胞 (DC)对肿瘤抗原提呈的功能和对MHCⅠ类限制性抗原多肽体内诱导的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的激活作用及其相关的免疫机制。方法　用重组腺病毒介导IL 2基因修饰小鼠骨髓来源的DC ,ELISA法检测DC培养上清中IL 1 2和CTL上清中IFN γ的分泌水平 ,用流式细胞仪 (FACS)分析IL 2基因修饰对DC表面共刺激分子B7表达的调节和内吞卵清蛋白抗原八肽 (OVA)的作用 ,3H TdR掺入法检测DC对小鼠Lewis肺癌细胞株3LL肿瘤抗原的提呈能力 ;51 Cr释放法检测用 3LL细胞MHCⅠ类抗原多肽Mut1致敏IL 2基因修饰的DC对小鼠体内特异性CTL的诱导作用。结果　经IL 2基因修饰后 ,DC 48h能分泌高水平的IL 1 2(78.4± 6 .6)pg·(1× 1 0 6 细胞 ) - 1 ·ml- 1 ,DC表面的共刺激分子B7表达增加 ,DC内吞OVA多肽的作用也增强。经Mut1致敏后与同系 3LL细胞荷瘤的小鼠T淋巴细胞混合培养 ,3H TdR掺入量显著增高 ,用Mut1致敏IL 2基因修饰的DC免疫小鼠后 ,能在体内诱导出分泌高浓度IFN γ[(1 1 68.0± 58.4)pg/ml]的CTL活性。结论　IL 2基因修饰可活化DC抗原提呈的第二信号 ,增强DC对抗原多肽的捕获和提呈功能 ,经MHCⅠ类抗原多肽致敏后 ,在小鼠体内能更有效地诱导出CTL特异性抗肿瘤免疫应答。     

未成熟树突状细胞诱导半相合骨髓移植免疫耐受的实验研究

目的探讨未成熟树突状细胞(imDC)诱导半相合骨髓移植(HBMT)免疫耐受的疗效。方法用雄性SD大鼠及雌性Wistar大鼠建立HBMT动物模型,取供鼠外周血诱导培养imDC,实验组(n=10):接受HBMT+供鼠imDC输注;对照组(n=10)只接受HBMT;观察比较2组受鼠的急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生率及其严重程度。结果 1)实验组受鼠的aGVHD发生率为60%(6/10)明显低于对照组的100%(10/10)(P<0.05);2)实验组受鼠的临床aGVHD评分为(2.7±1.0)分,明显低于对照组的(6.9±1.5)分(P<0.05);3)实验组受鼠小肠aGVHD的发生率44.4%(4/9)明显低于对照组的100%(10/10)(P<0.05)。结论 imDC可降低大鼠HBMT后aGVHD的发生率并减轻大鼠HBMT后aGVHD的严重程度。     

树突状细胞与移植免疫耐受

自1973年Steinman首次报道树突状细胞以来,树突状细胞的研究一直受到免疫学界的关注。由于树突状细胞在组织中的含量极微,细胞来源的困难限制了对树突状细胞的生物学特性等方面的研究。1992年Steinman实验室首次建立了用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从小鼠的骨髓中..     

细胞膜表达的HLA-G诱导免疫耐受性树突状细胞的产生

为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞（dendritic cell,DC）产生的方法及其机制,利用人HLA-G1真核表达载体转染K562细胞并与DC共培养后,用流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表达情况,同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法检测DC对T细胞功能的影响。结果表明,膜表达的HLA-G1分子与树突状细胞作用后,DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表达下调,而抑制性分子ILT3、ILT4表达上调。HLA-G1作用后DC异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论：HLA-G1分子可以在体外条件下,下调DC表面免疫共刺激分子水平,促进ILT3、ILT4表达,诱导免疫耐受性树突状细胞产生。     

细胞凋亡在肝移植免疫耐受中的作用

细胞凋亡不仅可以清除携带外来抗原的细胞,也可以消除自身免疫活性细胞,其在诱导免疫耐受中起重要作用。肝脏易于诱导免疫耐受,肝脏不仅可以诱导对外来抗原的免疫耐受,在移植耐受方面也表现了特殊的作用。体外试验表明,肝细胞可以刺激脾细胞产生杀伤性T淋巴细胞。移植肝内的供体T细胞可在移植后2     

大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究

目的：探讨树突状细胞(dendritic cells，DC)是否参与脑缺血损伤过程及在缺血脑组织中DC的来源。方法：用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型。用免疫组化方法检测脑缺血1h到第6天时，缺血脑DC(OX62+)的存在，以及胶质细胞／巨噬细胞(OX42+)转化成DC(OX62+)，同时检测活化后的DC样细胞表达主要组织相容性复合分子Ⅱ(MHCⅡ)情况。结果：脑缺血半球和假手术半球比较，在1hDC数量增加(T=7.143，P&;lt;0．001)，在脑缺血组中，缺血脑半球与非缺血脑半球比，DC的数量也增多(t=4.968，P&;lt;0．01)。脑缺血第6天缺血组与假手术组进行比较，DC表达MHCⅡ(OX62+OX6+)显著差异，每100mm^2脑组织切片中OX62+OX6+细胞数量比为(53&;#177;3)比（33&;#177;2）个(T=2.975，P&;lt;0．05)。脑缺血半球在1h到第6天OX42+转变成OX62+OX42+细胞逐渐增加，脑缺血第6天脑缺血半球与非缺血半球比t=9．875，P&;lt;0．001。脑缺血损伤面积与以每100mm^2脑组织片为单位的OX62+数量呈正相关(R^2=0．8914，P&;lt;0．001)。结论：脑缺血后，脑缺血组织中DC的数量增加，DC数量增加与脑伤面积呈正相关，提示DC参与了脑缺血过程，大鼠脑缺血后从胶质细胞向DC样细胞转化是脑内DC的来源之一。     

低剂量西罗莫司协同CD4~+CD25~+ T-reg诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

目的我们通过体外诱导、扩增并分选出CD4+CD25+T-reg回输入受体大鼠,并协同低剂量西罗莫司去诱导大鼠肝移植免疫耐受,研究探讨CD4+CD25+T-reg细胞亚群在移植免疫耐受过程中扮演的角色。方法将实验动物分为急性排斥组(DA→LEW)、免疫耐受组(LEW→DA)、低剂量西罗莫司(0.1 mg·kg-1·d-1)和CD4+CD25+T-reg协同作用组(实验组)。每组8只实验动物。各组肝移植大鼠的存活率比较,应用HE染色法观察移植肝术后7 d组织病理学变化,检测CD4+CD25+Foxp3+T-reg细胞亚群在各组大鼠移植肝脏、外周血总单核细胞数中所占的百分比。RT-PCR检测术后7 d移植肝脏Foxp3 m RNA的表达水平。用ELISA检测血浆中细胞因子IL-10、TGF-β的水平。结果实验组对比排斥组,能够长期存活,获得免疫耐受(P<0.05)。实验组移植肝脏中CD4+CD25+Foxp3+T-reg细胞亚群所占的比例明显高于排斥组(P<0.001),且在移植肝脏中,实验组Foxp3 m RNA表达含量明显增加(P<0.001)。实验组血浆中细胞因子IL-10、TGF-β的表达水平高于排斥组(P<0.001)。结论我们通过流式细胞分选技术将体外扩增诱导成熟的受体大鼠CD4+CD25+T-reg细胞分离收集,然后回输受体协同低剂量的西罗莫司能够成功地诱导了长期肝移植免疫耐受。从而为临床应用CD4+CD25+T-reg细胞抑制免疫排斥反应,诱导移植免疫耐受提供了一条新思路和理论实验依据。     

IL-10对培养的树突状细胞影响的研究

目的:探讨IL-10对培养的树突状细胞的影响。方法：采用Ficoll—Hypaque淋巴细胞分离液从正常人外周血分离PBMC，以细胞贴壁法分离得单核细胞。在RPMI 1640培养液中加入rhGM—CSF和rhIL-4诱生树突状细胞(DC)，分别在培养第8，第13d时加入0，12．5，25，50，100ng／ml浓度梯度的IL-10。作用2d后，用倒置相差显微镜或荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞术分析DC表型。结果：IL-10对成熟DC的表型表达无影响；IL-10抑制未成熟DC的共刺激分子CD86和DC成熟特异标志CDla，CD83的表达，对CD80的表达没有影响；对未成熟DC的Ⅱ类抗原HLA—DR的表达率无影响，但使其表达的平均荧光强度降低；IL-10能使未成熟的DC向耐受原性抗原提呈细胞(APC)转化。结论：为过敏性疾病和自身免疫性疾病的预防和治疗提供了实验依据。