重组嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ全基因合成及其真核表达载体的构建

目的 通过合成嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ的基因并建立其真核表达载体,为进一步研究增强NK细胞抗瘤活性创造条件.方法 在DNA2.0和Gene20liga软件辅助下对目的基因密码子及RNA二级结构进行优化并在序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRI限制酶切位点,根据基因序列分析的结果化学合成长度为50～70bp的单链oligo,利用PCR将合成的oligo拼接成完整的序列,将合成好的序列装入PMD-18T载体并转染至感受态细胞DH5α,测序验证重组克隆中基因序列.完整的序列经Hind m和EcoRI酶切后连接至目的载体PCDNA3.1(+)中,并转染COS-7细胞.结果 合成DNA片段长度为1 803bp,经测序验证与目的基因嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ大小、序列一致.结论 构建其真核表达载体PCDNA3.1(+)后转染COS-7细胞,实现了anti-erbB2 scFv-CD28-ξ基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达.     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.     

海人藻酸受体亚基GluR6真核表达载体的构建及其表达

目的构建海人藻酸受体亚基GluR6的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法根据GenBank数据库中GluR6的cDNA序列（Z11548）,分3段分别设计并合成3对引物。从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,分别克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后,将该3段cDNA片段依次与pcDNA3.1（＋）载体定向连接。将鉴定正确的重组体以脂质体法转染至COS-7细胞中,免疫印迹法检测GluR6蛋白质表达水平。结果克隆了GluR6的cDNA,并构建了其真核表达载体GluR6-pcDNA3.1,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹分析显示,GluR6在COS-7细胞中表达水平较高。结论成功构建GluR6-pcDNA3.1真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。     

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

目的: 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法: 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N-末端带上含24 bp的flag标签,克隆到pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-cbl在细胞中的表达. 结果: 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flag-cbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒pcDNA3.1( )-flag-cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.结论: 成功构建了N-末端带flag标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.     

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体.方法:通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1( )连接,构建PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体.结果:经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功.结论:成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础.     

含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达

目的：构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法：利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3（ζ）和信号肽序列signal。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。结果：经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）。经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%。结论：应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3（ζ）,融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础。     

空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因序列分析及其真核表达重组质粒的构建

目的针对空肠弯曲菌基因组序列为一超变量序列,测序比较空肠弯曲菌Pen:2和Pen:19 peblA基因的同源性,以证实peblA基因的保守性.在此基础上,构建空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因真核表达重组质粒.方法以含有Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的同一对引物行PCR反应,获得空肠弯曲菌Pen:2、Pen:8、Pen:19和Pen:21peblA基因DNA片段,测序比较Pen:2和Pen:19 peblA基因的同源性.并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因PCR产物为目的片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),以构建重组质粒.重组质粒经双酶切鉴定、PCR鉴定和测序确认后转染至COS-7细胞,RT-PCR方法检测其瞬时表达.对阳性克隆培养基上清中PEB1蛋白的表达用ELISA分析.结果测序证实空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因序列与Pen:2 peblA基因序列一致.采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段.ELISA分析表明PEB1蛋白在COS-7细胞上清中获得表达.结论空肠弯曲菌peblA基因具有良好保守性,以此成功构建的重组质粒能在COS-7细胞中表达,为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础.     

葡萄糖激酶基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的构建葡萄糖激酶（GK）基因真核表达载体并于COS-7细胞内表达，为体外构建具有葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力的基因工程细胞奠定基础。方法质粒pCMV4-GKZ1以EcoRI、BamHI双酶切，获得GK cDNA，与同样酶切的pcDNA3．1载体连接，建成重组载体pcDNA3．1-GKZ1，经酶切与测序鉴定。Lipofectamine2000介导pcDNA3．1-GKZ1转COS-7细胞。分别以RT—PCR及Western-blot对COS-7／GKZ1细胞中GKZ1基因的转录及表达进行检测。结果构建的pcDNA3．1-GKZ1重组载体经酶切有1450bp的GKZ1 cDNA，序列经测序证实。COS-7／GKZ1细胞RT—PCR扩增出498bp的目的片段，Western—blot可见54kDa的特异性条带，而COS-7／pcDNA3．1细胞上述各项检测结果均为阴性。结论成功构建GK基因真核表达载体pcDNA3．1-GKZ1，并于COS-7细胞中成功转录与表达。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing K8.1 Gene from Human Herpesvirus 8 and Its Expression in Eukaryotic Cell

目的 构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体.方法 聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA.结果 经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致.结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达.     

人类疱疹病毒8型K8.1基因真核表达载体的构建与表达

目的构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA。结果经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致。结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达。     

空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的：构建空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒，并证实其能在COS-7细胞中表达。方法：以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应，获得空肠弯曲菌Pen：2、Pen：8、Pen：19和Pen：21cadF基因DNA片段。并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen：19PCR产物为目的基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，以构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF。重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞。运用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达。结果：双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功。采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。结论：空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF构建成功，并能在COS-7细胞中表达。为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础。     

构建PDCD5基因真核表达载体及电转染BGC823细胞的研究

目的构建PDCD5基因真核表达载体,并电转染BGC823细胞,获得稳定转染细胞。方法设计合成PDCD5基因片段,将其插入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1~+表达载体,菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞,G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。结果重组质粒经菌落PCR测序分析表明,PDCD5基因序列准确插入预期位置,且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞,并整合入细胞基因组DNA。结论成功构建了PDCD5基因真核表达载体,并整合进BGC823细胞基因组,为研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治疗提供实验基础。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中表达

目的构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC,并在COS-7细胞中表达Pro370Leu突变型MYOC蛋白。方法以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板,用PCR介导的定点突变技术,得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC）,并定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）B上,得到pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC重组表达质粒,再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后用脂质体包埋转染法转染COS-7细胞,用特异性引物对转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,检测mMYOC基因表达,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,进行Western blot法检测蛋白分泌情况。结果经酶切和DNA序列测定,证实重组质粒构建成功,mMYOC基因能在COS-7细胞中表达,并且mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC,mMYOC蛋白不能分泌到细胞外。     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达.结果 扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带.结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达.     

溃疡性结肠炎大鼠iNOS真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠结肠组织中i NOS基因的真核表达载体,并表达于COS-7细胞,以便进一步研究i NOS在UC发病机制中的作用。方法:从溃疡性结肠炎大鼠结肠组织提取总RNA,经逆转录获得cDNA,以PCR方法克隆i NOS的基因片段,并对其序列进行测定。将测序正确的i NOS编码序列插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO中,构建真核表达载体;采用脂质体法转染COS-7细胞,用倒置荧光显微镜和Western blot的方法观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescence protein,GFP)的表达。结果:PCR方法扩增出3598bp的基因片段,插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO构建真核表达载体后,经以质粒为模板的PCR扩增和测序鉴定表明,克隆出UC大鼠结肠组织i NOS的编码序列同GeneBank收录的序列一致。将重组体转染COS-7细胞后,倒置荧光显微镜观察到绿色荧光,Western blot检测表明细胞中可表达融合蛋白。结论:本研究成功构建了pcD-NA3.1/CT-GFP-TOPO-i NOS重组质粒,并能高效转染COS-7细胞,为下一步i NOS基因功能研究及其在UC发病机制中的研究奠定了基础。     

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.