多重PCR结合毛细管电泳检测儿童呼吸道病原体方法的建立及应用

目的：建立肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.Ae）、阴沟杆菌（Enterobacter cloacae,Ecl）、白色假丝酵母菌（Candida albicans,Cal）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,Aba）7种儿童呼吸道病原体多重PCR结合毛细管电泳法检测体系。方法：随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266例儿童呼吸道病原体样本,针对MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、Aba保守序列设计特异性引物,设计并优化多重PCR结合毛细管电泳检测体系;将该检测结果与细菌培养以及荧光定量PCR比对,评估该方法的检测性能（灵敏度、特异度）。结果：所设计引物可以特异性扩增出呼吸道病原体;多重PCR结合毛细管电泳检测体系检出敏感性高;与其他呼吸道感染病原体未出现交叉反应,无明显的非特异峰,特异性较好。结论：成功建立一种能够快速筛查7种常见儿童呼吸道病原体的多重PCR结合毛细管电泳的检测方法。     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用

目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。     

PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的：建立敏感，特异的聚合酶链反应（PCR），以检测组织内弓形虫感染。方法：优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性，扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度，并以PCR法检测实验鼠肝，血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果：实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA，且特异性强，不扩增鼠DNA，人DNA，隐孢子虫，卡氏肺孢子虫，鼠疟原虫的DNA，检测实验感染小鼠血，肝脏样本，在感染后2天，3只鼠血样本PCR结果阳性，3只小鼠肝标本2只阳性；感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性；血样本阳性检出率100%（11/11），肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论：PCR方法是一种敏感，特异快速的诊断方法，可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。     

双引物聚合酶链反应同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型

目的 建立双引物聚舍酶链反应（PCR）用于同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。方法 基于单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的DNA聚合酶基因以及梅毒螺旋体47KD膜蛋白基因序列，自行设计2对特异性寡核苷酸引物，建立了同时检测上速2种痛原体的双引物PCR。结果 各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA，即单纯疱疹病毒Ⅱ型扩增产物为202bp以及梅毒螺旋体扩增产物为252bp。其他11种生殖道常见微生物及正常人基因组DNA不被扩增。检测了51例临床标本，梅毒螺旋体暗视野显微镜检查阳性检出率为15．7％，双引物PCR阳性检出率为19．6％；二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。HSV阳性培养率23．6％，双引物PCR阳性率47．1％，双引物PCR阳性检出率显著高于HSV培养且差异有统计学意义（P=0．019）；上速临床标本分别进行了2种痛原体的单引物PCR，与双引物PCR对照结果完全一致。结论 我们建立的双引物PCR一次可同时检测2种病原体，且有快速、敏感、特异以及简便的特点。     

多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

儿童支原体肺炎急性期2种检测方法的比较及意义#br#

目的 比较儿童支原体肺炎急性期2种检测方法及临床意义,为病原体检出和临床合理诊疗提供依据。 方法 收集拟诊为肺炎支原体（mycoplasma pneumonia,MP）感染患儿622例,采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和MP快速培养法检测痰和咽拭子标本中的MP,比较MP阳性率。 结果 血清MP-IgM凝集法再次检测效价高于初次效价4倍以上为金标准,拟诊病例中检出MP确诊病例615例 （98.88%）。痰实时荧光PCR、咽拭子实时荧光PCR、痰MP快速培养、咽拭子MP快速培养的ROC曲线下面积分别为0.909、0.693、0.604和0.600,四项指标中敏感度和特异性最高的是实时荧光PCR检测痰标本中MP（P＜0.01）。 结论 实时荧光PCR法在方法学上优于MP快速培养,痰标本的MP检出率高于咽拭子标本,实时荧光PCR法检测痰标本中的MP对临床早期诊断具有重要意义。     

小儿肺炎支原体感染实验室诊断价值的研究

对小儿呼吸道感染235例采用PCR技术检测咽拭子肺炎支原体DNA、血清抗肺炎支原体IPM（MP－IgM）、血清冷凝集试验（CAT）,进行配对研究。结果说明,咽拭子Mp－DNA－PCR法和血清抗MP－IgM法诊断小儿肺炎支原体感染都具有特异性和敏感性;PCR法出现阳性早于血清抗Mp－IgM法,但易受药物的影响;血清抗Mp-IgM法易受病程的影响;而血清冷凝集试验法阳性率太低,诊断价值不大。     

SNP敏感性纳米级复合分子开关在性别鉴定中的应用

目的研究SNP敏感性纳米级复合分子开关在性别鉴定中的应用。方法（1）单碱基敏感性复合分子“开／关”与普通PCR技术相结合对筛选出的特异已知样本进行检测：用常染色体基因片段作为对照，分别用同一样本的X，Y基因特异性引物延伸产物（x，Y）与常染色体引物延伸产物（A）进行比较，得出正常男性及女性的X／A，Y／A比值。建立标准化的普通PCR检验系统。（2）在同一反应体系中对两个靶基因进行检测，对双靶PCR反应条件进行优化。结果SNP敏感性分子开关准确检测了Y染色体上才有的特异序列。男性的X／A，Y／A比值分别为1：1和3：2，女性的X／A，Y／A比值均为1：1。结论SNP敏感性纳米级复合分子开关能够准确地对临床性别表型正常的人进行性别鉴定。     

基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的：基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。方法：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。结果：煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^-1,纯度为1.50～1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^...