应用GFP质粒构建及转染技术探讨Syk（L）核移位机制

【目的】通过研究Syk（L）在乳腺癌细胞亚细胞器中的分布和移位机制，探讨Syk（L）抑制乳腺癌的可能性机制。【方法】采用细胞胞核、胞浆分离技术和Western blot的方法，检测乳腺癌细胞系BT474中两种Syk蛋白异构体在细胞内的分布。构建绿色荧光蛋白（GFP）和Syk（L）核移位相关功能域融合蛋白质粒，转染入Cos7细胞内，荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的分布。【结果】BT474细胞的细胞浆中可检测到Syk（S）和Svk（L）的表达，细胞核中只检测到Syk（L）的表达。在Cos7细胞中，GFP与Syk（L）的缺失域（deletion domain，DEL域）融合蛋白均匀分布于细胞内，GFP与Syk（L）的IDB域融合蛋白聚集于细胞核中；将DEL域上的294K、300K、及305K突变域非碱性氨基酸后构建成GFP—IDB（L）-M，突变的融合蛋白则失去核聚集现象。【结论】在乳腺癌细胞中。Syk（L）可从细胞胞浆移位到细胞核内。Syk（L）的IDB域具有完整的核移位功能，能将融合的胞浆蛋白GFP转移到细胞核内；DEL域的碱性氨基酸具有核定位信号功能。Syk（L）在乳腺癌细胞中的抑癌功能与其核移位有关。     

F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的：构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法：运用RT—PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF，构建pEGFP-N2／F10和pEGFP—C2／F10的融合表达载体，以1Apofect AMINE2000为介导剂，将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7，并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白。结果：显微镜下观察到，GFP／F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核，或细胞浆，或者在核浆中均有分布，而且在细胞浆中主要分布在细胞器中。而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核。结论：F10蛋白在细胞的不同周期分布不同，或在细胞核，或在细胞胞浆中，或者在核浆中均有分布。     

5-脂氧酶/绿荧光蛋白转染评价PC12细胞损伤后5-脂氧酶核膜移位

目的：通过绿荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）／5-脂氧酶（5-lipoxygenase，5-LOX）稳定转染PC12细胞，以可视化方法观察5-LOX在不同损伤后的变化。方法：将带有5-LOX基因的pEGFP—C2质粒及pEGFP—C2质粒（对照），稳定转染至PC12细胞；在缺糖缺氧（oxygen—glucose deprivation，OGD）、H2O2和NMDA处理后，荧光显微镜下观察GFP／5-LOX在细胞内的定位；同时，以免疫细胞化学方法观察野生型5-LOX分布及其变化。结果：转染GFP／5-LOX的细胞内，GFP／5-LOX主要均匀表达于细胞核内；仅转染GFP的细胞GFP表达于胞核和胞浆。OGD和H2O2处理后，分别有50．6％和57．7％细胞的GFP／5-LOX移位到核膜；NMDA处理或仅转染GFP的细胞，未见核膜移位现象。野生型5-LOX分布在细胞核和细胞浆内，3种损伤处理均诱导核膜移位。结论：稳定转染GFP／5-LOX的PC12细胞，GFP／5-LOX主要分布在细胞核；不同损伤处理诱导的5-LOX核膜移位，有不同的特点。     

GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)内的表达与定位。方法:将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ,48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况,以确定GFP及融合蛋白的表达;以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达。结果:在荧光显微镜下,4种质粒转染的细胞,pEGFP-C1组细胞内均有荧光;pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核,但细胞浆也有;pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光,pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光。Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论:GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达,且GFP-E2主要定位于细胞核,GFP-DBD定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆。     

芸香诱导K562细胞凋亡时细胞色素C表达变化

【目的】研究芸香诱导白血病K562细胞凋亡过程中细胞色素C的表达。【方法】体外培养K562细胞,Hoechst33342/PI双荧光染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态,分离细胞线粒体和胞浆,经SDS-PAGE电泳分离蛋白,Western Bloting检测线粒体、细胞浆细胞色素C表达。【结果】芸香浓度为2×10-5、4×10-5、8×10-5mol/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;Hoechest33342/PI双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞凋亡表现,Western Bloting检测4×10-5mol/L药物处理细胞后线粒体细胞色素C表达水平下调,细胞浆出现明显细胞色素C蛋白条带。【结论】芸香诱导白血病细胞发生凋亡,可能与线粒体途径有关。     

ERα通路代偿性激活在乳腺癌细胞的拉帕替尼获得性耐药中的作用

目的了解雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)通路代偿性激活在乳腺癌细胞BT474的拉帕替尼获得性耐药发生过程中的作用和可能机制。方法利用real-time PCR和蛋白质印迹检测BT474被拉帕替尼作用后人表皮生长因子受体2(HER2)通路和ERα通路活性的改变;利用拉帕替尼浓度递增、持续培养的方法建立乳腺癌细胞BT474的拉帕替尼获得性耐药细胞(rBT474)模型;采用流式细胞术检测拉帕替尼对rBT474细胞凋亡的影响,进一步以蛋白质印迹法分析BT474和rBT474在HER2通路和ER通路上的差别;应用MTT法检测rBT474在拉帕替尼和氟维司群作用下的生长情况;利用克隆形成实验观察双靶点治疗对预防拉帕替尼获得性耐药的可能性。结果 Real-time PCR和蛋白质印迹检测显示拉帕替尼抑制BT474细胞HER2磷酸化,同时诱导叉头蛋白3A(FOXO3a)和孕激素受体(PR)的表达升高;成功获得的耐药细胞株rBT474在含有5μmol/L拉帕替尼的培养液中仍可持续生长;蛋白质印迹结果显示,rBT474细胞与BT474细胞相比,其磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路受抑制,而促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路激活,ER通路的活化更加明显;MTT法检测结果显示,与单用拉帕替尼相比,联合使用拉帕替尼和氟维司群可抑制rBT474细胞活力(P<0.01);克隆形成实验结果表明,与二甲亚砜组、拉帕替尼组和氟维司群组相比,拉帕替尼和氟维司群联合用药组可抑制BT474细胞克隆形成(P<0.01),具有预防获得性耐药发生的可能。结论 ERα通路的代偿性激活可能是导致HER2(+)/ERα(+)的乳腺癌细胞对拉帕替尼产生获得性耐药的机制之一,而PI3K/AKT抑制和MAPK激活可能是ERα代偿激活的主要原因。     

核转出蛋白对前列腺癌雄激素受体稳定性的调节

目的：探讨位于雄激素受体(androgen receptor, AR)配体结合域中具有出核转运信号肽的核转出蛋白(nuclear export signal of androgen receptor, NESAR)对前列腺癌雄激素受体蛋白表达和稳定性调节的机制。方法：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)融合蛋白表达载体pEGFP-AR(1-918aa),pEGFP-NESAR(743-817aa),pEGFP-NAR (1-665aa)和pEGFP-NAR-NESAR,及NESAR的赖氨酸突变体（赖氨酸K突变为精氨酸R）pEGFP-NESAR K776R,pEGFP-NESAR K807R和pEGFP-NESAR K776R/K807R,瞬时转染前列腺癌细胞PC3后,采用荧光显微镜、蛋白质免疫印迹和免疫沉淀,检测NESAR对雄激素受体稳定性的调节。结果：在荧光显微镜下,含NESAR的融合蛋白呈胞浆定位,荧光信号强度比不含NESAR的融合蛋白明显减弱,且含NESAR的融合蛋白表达水平显著低于不含NESAR的融合蛋白表达水平。在蛋白合成抑制剂放线菌酮处理下,GFP-NESAR和GFP-NAR-NESAR的半衰期小于6 h,而对照GFP和GFP-NAR的表达相对更稳定,半衰期大于24 h。融合蛋白GFP-NESAR在蛋白酶体抑制剂MG132的处理下,其蛋白表达显著增加,并呈现剂量依赖性,而MG132对GFP蛋白稳定性没有显著影响;在蛋白合成被抑制的情况下,MG132同样显著抑制了GFP-NESAR融合蛋白的降解,且蛋白表达呈剂量依赖性的增加。GFP免疫沉淀的结果显示,GFP-NESAR融合蛋白的泛素化水平明显高于GFP对照。赖氨酸位点K776和K807突变的NESAR的泛素化水平显著降低,且蛋白稳定性提高,赖氨酸位点K776和K807是介导NESAR发生泛素化的关键氨基酸残基。结论：核转出蛋白NESAR具有降解不稳定性,作为多聚泛素化修饰的识别信号,介导了其融合蛋白在前列腺癌细胞中通过泛素-蛋白酶体途径的降解。本研究为AR蛋白水平和/或活性的调控开辟一种新的研究思路,有助于对AR降解分子机制的了解和在前列腺癌产生去势抗性的过程中对AR靶向的密切调控。     

s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位

目的:观察s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达及定位。 方法：根据s-lap基因的编码区序列, 应用PCR技术突变其3′末端终止密码子, 并通过基因重组技术将其与GFP基因融合,构建s-lap/GFP重组质粒;采用脂质体转染法, 将s-lap/GFP融合基因转入Hela细胞中, 用荧光显微镜观察其表达。 结果:s-lap/GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示, 在转染GFP基因的Hela细胞中,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内,而细胞核内低表达;在转染s-lap/GFP融合基因的Hela细胞中,荧光均匀分布于整个细胞,尤其以细胞核内高表达。 结论：s-lap/GFP融合蛋白可在人Hela细胞中表达,并主要定位于细胞核。     

GFP-ICP0融合蛋白在巨噬细胞中的表达与定位

目的 构建GFP—ICP0融合蛋白真核表达载体pEGFP／ICP0，并在巨噬细胞中表达，为研究ICP0对巨噬细胞分泌活性的影响提供实验依据。方法 将ICP0片段亚克隆入载体pEGFP—Cl，构建GFP-ICP0融合蛋白真核表达载体。将质粒pEGFP／ICP0转染巨噬细胞，Western blot鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP—ICP0融合蛋白在细胞内的表达与定位。结果 成功构建了GFP—ICP0融合蛋白真核表达载体pEGFP／ICP0，GFP-ICP0融合蛋白在巨噬细胞中表达并定位于细胞核。结论 pEGFP／ICP0在巨噬细胞中即时高表达GFP-ICP0融合蛋白并定位于细胞核。     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

SARS冠状病毒N蛋白的真核细胞定位研究

目的:为进一步探讨SARS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)在病毒复制及细胞通路中的作用,观察了核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.方法:应用核定位序列分析软件分析N蛋白序列,找出其中的核定位信号序列;构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SARS-CoV不同长度核衣壳蛋白区段融合表达的pEGFP-C1重组载体,对293细胞进行瞬时转染,在荧光显微镜下观察核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.结果:不同的核定位信号分析软件分析的结果不同,Prosite找到的核定位信号位于N蛋白第373-389或374-390aa,而PredictNLS server找到的核定位信号位于N蛋白第36-44aa;全长核衣壳蛋白及第161-422aa区段均定位于细胞质,第1-187aa区段定位于细胞质和细胞核.结论:SARS-CoV核衣壳蛋白的核定位信号可能位于N蛋白第36-44aa.     

免疫相关GTP结合蛋白2的亚细胞定位分析

目的 对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础.方法: 使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查询获取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息学在线分析工具对GIMAP2蛋白的跨膜结构,核定位信号(nuclear localization signal,NLS),核输出信号(nuclear export signal,NES)及亚细胞定位进行分析预测.采用PCR技术扩增GIMAP2基因片段,并插入至pQCXIP-mCherry-N1表达载体,用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆.测序正确的重组质粒pQCXIP-GIMAP2-mCherry经过提取,纯化步骤后,与逆转录病毒包装质粒VSVG,Gag/Pol在脂质体介导下共同转入HEK293FT细胞中进行病毒包装.转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436.使用免疫荧光染色方法检测内,外源性GIMAP2在MDA-MB-436胞内表达定位情况.使用绿色荧光化学染料分别标记稳定表达GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436活细胞中的线粒体,内质网,脂滴,在超分辨率显微镜N-SIM下观察其与红色荧光的GIMAP2蛋白的定位情况.结果: 生物信息学分析数据显示,由337个氨基酸组成的GIMAP2蛋白在羧基端可能有2个跨膜螺旋结构,其中跨膜螺旋含预期氨基酸数为 40~41个,紧随跨膜螺旋结构之后的蛋白结构朝细胞质侧;羧基端第279~281位氨基酸有NES但无NLS;可能定位在内质网.测序结果表明,成功构建表达载体pQCXIP-GIMAP2-mCherry.荧光染色结果证实,GIMAP2-mCherry融合蛋白成功在MDA-MB-436细胞内表达,并与内源性GIMAP2定位一致,分布于内质网和脂滴.结论: 免疫相关GTP结合蛋白2定位于内质网和脂滴,可能与脂代谢相关.     

免疫相关GTP结合蛋白2的亚细胞定位分析

目的 对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础.方法: 使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查询获取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息学在线分析工具对GIMAP2蛋白的跨膜结构,核定位信号(nuclear localization signal,NLS),核输出信号(nuclear export signal,NES)及亚细胞定位进行分析预测.采用PCR技术扩增GIMAP2基因片段,并插入至pQCXIP-mCherry-N1表达载体,用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆.测序正确的重组质粒pQCXIP-GIMAP2-mCherry经过提取,纯化步骤后,与逆转录病毒包装质粒VSVG,Gag/Pol在脂质体介导下共同转入HEK293FT细胞中进行病毒包装.转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436.使用免疫荧光染色方法检测内,外源性GIMAP2在MDA-MB-436胞内表达定位情况.使用绿色荧光化学染料分别标记稳定表达GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436活细胞中的线粒体,内质网,脂滴,在超分辨率显微镜N-SIM下观察其与红色荧光的GIMAP2蛋白的定位情况.结果: 生物信息学分析数据显示,由337个氨基酸组成的GIMAP2蛋白在羧基端可能有2个跨膜螺旋结构,其中跨膜螺旋含预期氨基酸数为 40~41个,紧随跨膜螺旋结构之后的蛋白结构朝细胞质侧;羧基端第279~281位氨基酸有NES但无NLS;可能定位在内质网.测序结果表明,成功构建表达载体pQCXIP-GIMAP2-mCherry.荧光染色结果证实,GIMAP2-mCherry融合蛋白成功在MDA-MB-436细胞内表达,并与内源性GIMAP2定位一致,分布于内质网和脂滴.结论: 免疫相关GTP结合蛋白2定位于内质网和脂滴,可能与脂代谢相关.     

反义核酸药物癌泰得对乳腺癌细胞株的体外杀伤作用

目的探讨反义核酸药物癌泰得对乳腺癌细胞株的体外杀伤作用。方法1）MTT法测定不同浓度癌泰得对乳腺癌细胞株BT474的抑制率。2）Annexin/PI双染法,流式细胞仪检测细胞凋亡比率。结果MTT法观察到癌泰得对BT474细胞的杀伤作用,流式细胞仪检测到BT474细胞凋亡率达16.82%,以晚期凋亡为主。结论癌泰得对BT474细胞有抑制作用,抑制率与浓度呈线性相关。     

顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和凋亡

目的：探讨顺铂对HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2蛋白表达及核转位的影响,并观察细胞自噬和凋亡的变化。方法：使用不同浓度的顺铂(0、2.5、5、10μmol/L)干预HeLa人宫颈癌细胞,MTT法检测细胞活性,Transwell实验观察细胞迁移能力,mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒转染HeLa细胞观察自噬水平的变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平,免疫蛋白印迹检测Nrf2在细胞质和细胞核内的表达情况,免疫荧光法观察Nrf2的核转位情况。结果：与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可抑制HeLa细胞的活性及细胞迁移能力(P<0.05),且随着药物浓度增高抑制作用增强(P<0.05)。与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可促进HeLa细胞中LC3B的表达、细胞凋亡及Nrf2的核转位(P<0.05),降低细胞质中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05),并升高细胞核中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05)。结论：顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和细胞凋亡,并抑制细胞的活性和迁移能力。     

PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

目的：构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2( PRMT2)及其差异剪接体与绿色荧光蛋白( GFP)的真核表达载体,转染后观察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因及其新的差异剪接体在乳腺癌中的作用奠定基础。方法以pGEM-T-PRMT2/α/β/γ载体为模板,设计引物,PCR扩增目的基因,并将PCR产物克隆至pcDNA3.1/NT-GFP-topo载体,转化后将阳性克隆扩增,对 PCR 产物进行跑胶鉴定和测序。提取 pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2/α/β/γ及空载体pcDNA3.1/NT-GFP质粒,用脂质体介导转染MCF-7细胞,在激光共聚焦显微镜下,观察外源性PRMT2/α/β/γ融合蛋白在MCF-7细胞中的亚细胞定位。采用Western blot法检测各重组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达。结果各GFP在细胞中均有表达,但其在细胞中的分布位置不一致。 PRMT2α与PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致,均聚集于核仁外的核浆,胞质中有少许分布;而PRMT2β和空载体的荧光蛋白的分布一致,都均匀分布于细胞的胞质和胞核,包括核仁部分。 Western blot法检测表明各重组融合蛋白在MCF-7细胞中均有表达。结论 PRMT2及其各剪接体的亚细胞定位不同,可能提示其在功能方面存在差异。     

前列腺癌上调表达基因BRP44的蛋白细胞定位及功能预测研究

目的 了解GFP-BRP44融合蛋白的细胞定位,初步预测BRP44的功能.方法 构建BRP44与GFP的融合表达真核载体,脂质体介导法转染高表达该基因的前列腺癌细胞株LNCaP,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位.生物信息学方法对基因BRP44进行序列分析及功能预测.结果 成功构建GFP-BRP44融合蛋白的真核表达载体,pEG-FP-BRP44融和蛋白在LNCaP细胞核及细胞质均有表达.与单纯GFP相比,融合蛋白在细胞质的表达相比细胞核更强.功能预测提示基因BRP44可能是一个受oct-1等转录因子调控,主要在细胞线粒体发挥基因调节作用的可溶性蛋白.结论 BRP44蛋白可能主要在细胞质发挥作用.     

LRP16基因的多克隆抗体制备及表达的探索

目的:制备人LRP16蛋白多克隆抗体并利用该抗体检测LRP16蛋白表达及亚细胞定位。方法:利用已构建的pRSET-C载体和LRP16基因组成的连接产物转化BL-21缺陷型大肠杆菌。诱导该基因原核表达,快速蛋白免疫法获取相应的多克隆抗体,利用免疫组化法观察LRP16基因产物在人多种组织中的表达差异。结果:成功获得高效的LRP16抗体,利用该抗体初步证实LRP16基因编码产物的在不同雌激素受体水平的组织分布特点。结论:制备的LRP16抗体及其全长基因可用于LRP16基因的生理功能及病理学研究,初步发现LRP16基因的表达与雌激素受体呈正相关。