6种中药单体对人孕烷X受体介导细胞色素酶P450 3A4转录的调节作用

目的研究6种中药单体野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷、黄芪甲苷以及黄芩素是否可以通过诱导孕烷X受体(PXR)介导细胞色素酶P4503A4(CYP3A4)转录表达。方法采用脂质体瞬时转染的方法,将人PXR表达质粒、CYP3A4报告质粒以及内参质粒转入LS174T细胞中,建立报告基因体系,与不同浓度及不同给药时间的中药单体共同孵育,检测细胞中荧光素酶的活性。结果黄芩素(20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L)分别诱导PXR介导CYP3A4表达(1.49±0.23)倍(P<0.05)、(2.45±0.56)倍(P<0.01)和(5.27±0.40)倍(P<0.01),野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷和黄芪甲苷在实验的浓度范围内不能明显诱导LS174T细胞中PXR介导CYP3A4表达。在不同给药时间实验中,20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L的黄芩素在12～48h能诱导PXR介导CYP3A4表达,诱导能力随时间的延长而呈增强的趋势,各浓度的最大诱导倍数均在48h出现。结论黄芩素在LS174T细胞系中可以通过诱导PXR介导CYP3A4转录表达,而野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷或黄芪甲苷无此作用。     

几种植物化学物对人孕烷X受体介导的细胞色素P450 3A4转录调节作用

目的：观察几种植物化学物是否能通过活化孕烷X受体（PXR）诱导细胞色素P450 3A4（CyP3A4）的转录表达。方法：在人肝肿瘤细胞株HepG2细胞中，用瞬时共转染报告基因实验进行异鼠李素、大豆异黄酮、木犀草素、姜黄素和芦丁素共5种植物化学物在不同浓度和不同处理时间下对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用研究。结果：5种植物化学物分别作用于HepG2细胞24h后，大豆异黄酮、木犀草素、姜黄素均能诱导PXR介导的CYP3A4基因的转录表达，诱导能力随浓度增强，而异鼠李素和芦丁素无类似作用。大豆异黄酮、木犀草素、姜黄素均能在1～50μmol／L浓度之间诱导CYP3A4的转录表达，这3种植物化学物在50μmol／L浓度时，诱导倍数分别为0．1％DMSO处理细胞的5．46倍、2．87倍和2．07倍。在不同处理时间的研究中，10μmol／L和50μmol／L大豆异黄酮、木犀草素和姜黄素均能在12h～48h内增强CYP3A4的转录表达，诱导能力随时间延长呈增强趋势。50μmol／L大豆异黄酮、木犀草素和姜黄素作用HepG2细胞48h后，诱导倍数分别为0．1％DMSO处理细胞的6．72倍、3．24倍和2．13倍。结论：植物化学物大豆异黄酮、木犀草素和姜黄素能通过活化PXR诱导CYP3A4的转录表达，异鼠李素和芦丁素则没有类似作用。     

山奈酚和槲皮素对大鼠细胞色素P450酶活性的影响

目的:观察山奈酚和槲皮素两种银杏黄酮对细胞色素P450的影响。方法:原代培养大鼠肝细胞,接触0.1~10.0μm o l/L的山奈酚或槲皮素,作用12 h、24 h和48 h,用N ash法检测细胞色素P450同工酶-红霉素N-脱甲基酶(ENRD)和氨基比林N-脱甲基酶(ADM)的活性。分别以红霉素(10.0μm o l/L)和二甲基亚砜(DM SO)作为阳性对照和溶剂对照。结果:0.1、1.0和10.0μm o l/L山奈酚作用24 h,ENRD酶活性分别为(0.088±0.008)、(0.074±0.006)和(0.041±0.003)μm o l/(m g.m in-1);槲皮素相同浓度和作用时间处理的ENRD酶活性分别为(0.082±0.007)、(0.063±0.007)和(0.034±0.005)μm o l/(m g.m i-n 1)。其中1.0和10.0μm o l/L山奈酚和槲皮素处理的肝细胞ENRD酶活性都显著低于溶剂对照组(0.085±0.011)μm o l/(m g.m in-1),且呈剂量-效应关系(P<0.01)。10μm o l/L山奈酚处理细胞12 h和48 h后,ENRD酶活性为(0.053±0.006)和(0.037±0.007)μm o l/(m g.m i-n 1);10μm o l/L槲皮素处理细胞12 h和48 h后,ENRD酶活性为(0.067±0.005)和(0.032±0.004)μm o l/(m g.m i-n 1),都具有明显的时间-效应关系(P<0.01)。山奈酚只有在10μm o l/L浓度下作用24 h对ADM活性出现抑制,槲皮素对ADM活性没有明显影响。结论:在本实验条件下,山奈酚和槲皮素能明显抑制大鼠肝细胞ENRD活性;山奈酚在10μm o l/L浓度下能轻度抑制ADM,而槲皮素对ADM活性没有明显的抑制作用。     

细胞色素氧化酶3A4启动子报告基因的构建及其活性检测

目的建立细胞色素氧化酶(cytochrome P-450,CYP)3A4启动子报告基因并在孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达阳性的肿瘤细胞中检测其转录活性。方法利用PCR扩增CYP 3A4的启动子区远端调控序列(-7836/-7208)和近端调控序列(-362/+52)序列;将上述序列克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测CYP 3A4报告基因的活性。结果在肝癌细胞系中,PXR的激动剂利福平能够剂量依赖性地诱导远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和近端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.95;P=0.011)的活性,EC50为(5.65±0.58)μmol/L和(8.91±1.12)μmol/L;PXR的拮抗剂酮康唑能够剂量依赖性地抑制利福平诱导的远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和PXRELuc(R2=0.92;P=0.003 4)活性,IC50为(0.55±0.08)μmol/L和(0.94±0.14)μmol/L。此外,多种化疗药物(PXR的潜在配体)能够在PXR阳性的肿瘤细胞系中诱导远端调控序列荧光素酶报告基因和近端调控序列荧光素酶报告基因的活性。结论成功构建了CYP 3A4启动子报告基因,在此基础上建立了在不同肿瘤细胞中检测PXR转录活性的方法。     

孕烷X-受体对细胞色素P450 3A调控机制的研究进展

细胞色素P450 3A（CYP3A）是参与临床药物代谢的主要CYP同工酶之一。孕烷X受体（PXR）属于核受体超家族（NR）的NR1Ⅰ亚家族。该受体作为药物代谢的关键转录调控因子,参与CYP3A的诱导表达。药物可通过多种途径激活PXR受体调控cyp3a基因的表达,其中包括PXR与其他核受体、转录因子及细胞信号转导通路间的相互作用等多种途径。目前,基于PXR的筛选方法已广泛应用于早期新药研发。     

孕烷X受体介导佐米曲坦对大鼠肝细胞色素P450 CYP 3A的诱导作用

目的:考察佐米曲坦对大鼠肝细胞色素P450 CYP3A1/2的诱导是否由孕烷X受体(PXR)介导.方法:在构建的基于PXR的荧光素酶报告基因上,观察不同浓度佐米曲坦(10、50、100 μmol·L-1)对大鼠肝细胞色素P450 CYP3A1/2的诱导作用.以经典的诱导剂16α-氰基孕烯醇酮(PCN)作为阳性对照,空白溶剂(DMSO)作为阴性对照.结果:与阴性对照组相比,阳性对照组、佐米曲坦在100 μmol·L-1浓度时,对CYP3A1有明显的诱导作用,活性分别增加了1.93、1.96倍(P＜0.05);阳性对照组、佐米曲坦10 μmol·L-1、50 μmol·L-1浓度组对CYP3A2也有明显的诱导作用,其活性分别增加了2.51、2.10、1.63倍(P＜0.01、＜0.05).结论:PXR通路是佐米曲坦诱导大鼠CYP3A1/2的一个重要途径.     

芒果苷上调HepG2细胞膜蛋白MRP3和核受体PXR、CPF表达

目的 体外HepG2细胞培养观察芒果苷(mangiferin)对多耐药相关蛋白3(multidrug resistance-associate protein 3, MRP3)和核受体孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7A promoter-binding factor,CPF)表达的影响.方法 用芒果苷刺激HepG2细胞72 h后,分别抽提细胞RNA、膜蛋白及核蛋白,采用半定量RT-PCR和蛋白免疫印迹检测膜转运蛋白MRP3和核受体PXR、CPF在转录与蛋白水平的表达变化.熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)处理的HepG2细胞作为阳性对照、DMSO处理细胞为阴性对照.结果 芒果苷可显著刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的mRNA(比阴性对照组高3.0倍,P＜0.05)和蛋白(比阴性对照组高3.3倍,P＜0.05)表达,其作用强于UDCA.芒果苷也可明显上调核受体PXR [mRNA水平增高1.7倍(P＜0.05),蛋白水平增高3.7倍(P＜0.01)]、CPF[mRNA水平增高2.1倍(P＜0.05),蛋白水平增高4.9倍(P＜0.05)]的表达.结论 芒果苷刺激肝癌细胞HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的表达上调可能与核受体PXR、CPF途径相关.     

茵栀黄对结构性雄甾烷受体CAR介导CYP3A4的转录调节作用

目的:探讨茵栀黄对CYP3A4转录表达的影响及机制.方法:Chang Liver细胞中加入0.01、0.1和1μM茵栀黄分别作用24h、36h和48h,采用RT-PCR法和报告基因方法检测CYP3A4 mRNA的表达水平.结果:不同浓度茵栀黄分别处理Chang Liver细胞24h和36h可明显升高CYP3A4 mRNA的表达水平(P<0.05);转入CAR载体的Chang Liver细胞经不同浓度茵栀黄处理36h均可激活CYP3A4的转录表达.结论:茵栀黄可能通过CAR介导增加Chang Liver细胞CYP3A4的转录表达.     

自拟葛花解酒涤脂汤对酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂肪沉积及PXR表达的影响

目的了解自拟葛花解酒涤脂汤对酒精性脂肪肝(AFLD)小鼠肝脏脂肪沉积的影响,并观察其对肝组织孕烷受体(PXR)及其调控靶基因CYP3A11、CYP3A25蛋白及mRNA表达的影响。方法将29只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组(5只),模型组(8只),高剂量干预组(8只)、低剂量干预组(8只)。采用美国国立卫生研究院酒精滥用和酒精中毒研究所(NIAAA)方法制备AFLD小鼠模型,分别灌胃给予高、低剂量葛花解酒涤脂汤水煎剂干预,连续9 d。采用酶联免疫吸附法检测血清中谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)水平,组织病理学油红O染色检测肝脏脂肪沉积情况;实时荧光定量PCR及免疫组织化学方法分别检测PXR、CYP3A11、CYP3A25 mRNA及PXR蛋白的表达。结果与模型组比较,干预组小鼠肝脏脂肪沉积显著减轻,呈剂量依赖性,具有比模型组和正常组显著增加的PXR、CYP3A25表达水平(P0.01);模型组小鼠血清ALT水平显著增加(P0.01),其余各组相似;各组CYP3A11mRNA转录水平差异无显著性(P≥0.05)。结论自拟葛花解酒涤脂汤对实验小鼠AFLD具有明显的治疗作用,可能与促进PXR及其靶基因CYP3A25表达有关。     

孕烷X受体介导佐米曲坦对大鼠肝细胞色素P450 CYP 3A的诱导作用

目的：考察佐米曲坦对大鼠肝细胞色素P450 CYP3A1/2的诱导是否由孕烷X受体（PXR）介导。方法：在构建的基于PXR的荧光素酶报告基因上,观察不同浓度佐米曲坦（10、50、100μmol.L^-1）对大鼠肝细胞色素P450 CYP3A1/2的诱导作用。以经典的诱导剂16α-氰基孕烯醇酮（PCN）作为阳性对照,空白溶剂（DMSO）作为阴性对照。结果：与阴性对照组相比,阳性对照组、佐米曲坦在100μmol.L^-1浓度时,对CYP3A1有明显的诱导作用,活性分别增加了1.93、1.96倍（P〈0.05）;阳性对照组、佐米曲坦10μmol.L^-1、50μmol.L^-1浓度组对CYP3A2也有明显的诱导作用,其活性分别增加了2.51、2.10、1.63倍（P〈0.01、〈0.05）。结论：PXR通路是佐米曲坦诱导大鼠CYP3A1/2的一个重要途径。     

葛根素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察葛根素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,对原癌基因c-fos和bc l-2蛋白质以及凝血酶受体(TR)mRNA表达的作用。方法以细胞计数法,流式细胞仪测定DNA含量,细胞周期分析法观察凝血酶及葛根素对VSMC增殖和DNA合成的影响。在凝血酶及葛根素作用24 h后,用W estern印迹法检测c-fos和bc l-2蛋白表达,以半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TR mRNA的表达。结果凝血酶对VSMC有明显促增殖作用,促增殖效应在24 h末达峰值(细胞计数凝血酶组8.64×104/m l±0.12×104/m l,对照组4.20×104/m l±0.11×104/m l,P<0.05),且凝血酶浓度在0.1~1.0 U/L之间呈剂量依赖关系;葛根素呈剂量依赖性地抑制凝血酶诱导的细胞增殖、DNA合成以及VSMC c-fos和bc l-2蛋白的表达(葛根素浓度为1.5×10-3mol/L时,抑制率分别为42.6%±5.2%、58.2%±7.9%、44.5%±7.5%和39.6%±6.4%,均P<0.05);高浓度(1.5×10-3mol/L)的葛根素可显著抑制凝血酶诱导的TR mRNA上调(抑制率为17.6%±1.7%,P<0.05)。结论葛根素能抑制凝血酶诱导的VSMC增殖,这可能与其抑制c-fos和bc l-2蛋白有关,并部分与其抑制TR mRNA表达有关。     

1,3,8-三羟基-5-甲氧基<IMG height=23 alt=

目的:在人肝微粒体中研究1,3,8-三羟基-5-甲氧基山口山酮(1,3,8-trihydroxy-5-methoxyx-anthone,TMX)对细胞色素P450酶(CYP450s)的抑制作用。方法:研究加入TMX后,微粒体内主要药物代谢酶活性的变化情况。微粒体孵化体系中各探针药物及其代谢产物的含量用高效液相色谱法测定,酶活性用探针药物的代谢产物浓度与母药浓度的比值表示。结果:加入TMX前后CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4活性改变[均值(95%可信区间)]分别为2.95×10-3(2.03×10-3,3.88×10-3),3.14×10-2(1.87×10-2,4.42×10-2),2.27×10-3(-1.4×10-2,1.81×10-2),7.72×10-2(-0.83×10-2,0.2374),-0.2548(-2.9802,2.4707)。CYP1A2,CYP2C9的活性变化差异有统计学意义。结论:10μmol/L的TMX在体外对CYP1A2和CYP2C9有显著性抑制作用,对CYP2C19,CYP2E1和CYP3A4的抑制作用并不明显。     

糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用

目的 探讨糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用. 方法 采用DNA重组技术构建ptracer-hGR重组质粒,并用报告基因检测方法研究糖皮质激素受体对CYP3A5药物代谢酶转录、表达调控中的信号转导作用. 结果 菌落PCR及测序证实成功构建ptracer-hGR重组质粒.经阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物加药后共转染ptracer-hGR质粒的实验组荧光素酶相对活性显著高于单纯转染CYP3A5报告基因质粒的对照组,差异具有统计学意义(P=0.0362、0.0034和0.0164);而卡铂和米托蒽醌加药后,荧光素酶相对活性无明显增高趋势. 结论 阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物可能通过激活糖皮质激素受体这一信号途径而上调CYP3A5 mRNA的转录.     

Pim-3质粒构建体在大鼠活体肝组织的表达和活性的研究

目的 构建大鼠Pim-3绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒并观察其在活体肝组织的表达和活性。方法采用逆转录-PCR的方法获取目的cDNA,重组质粒经酶切鉴定和测序;大鼠活体基因肝靶向性转染通过尾静脉流体力学注射法完成,肝细胞凋亡的诱导采用腹腔内注射内毒素和D-半乳糖胺（D-GaIN）来实现。动物分为A、B、C和D组（即正常、对照、空质粒和重组质粒组,每组8只）;肝组织GFP表达通过荧光显微镜、Pim-3表达通过逆转录（RT）-PCR方法检测;肝细胞凋亡采用缺口末端标记技术（TUNEL）分析和半胱天冬酶-3活性检测。结果成功构建GFP表达质粒pEGFP-N2／Pim-3;重组质粒和空质粒DNA通过流体力学注射法被成功转染人大鼠活体肝组织内;4组Pim-3的相对表达水平分别为0．06±0．02、0、0、0．49±0．15。D组与其他3组差异均有统计学意义（均P〈0．01）;4组肝细胞的凋亡指数（AI）分别为：（3．1±0．7）％,（72．5±6．1）％、（69．8±5．7）％和（4．9±1．2）％;肝组织半胱天冬酶-3活性分别为（60±15）、（147±55）、（142±50）和（76±27）pmol·min ·mg^-1,D组与B、C两组间差异有统计学意义（均P〈0．01）。结论 构建的重组体质粒pEGFP-N2／Pim-3能在大鼠活体肝组织内有效表达,并发挥其对肝细胞凋亡的抑制效应。     

山奈酚对高糖诱导大鼠肾系膜细胞增殖的影响

目的探讨山奈酚对高糖诱导大鼠肾系膜细胞（HBZY-1）增殖、纤维化的影响,并研究其相关的作用机制。方法将HBZY-1细胞分为正常糖浓度组〔葡萄糖（Glu）5.5 mmol/L〕即对照组、高糖（Glu 25 mmol/L)组、10 μmol/L山奈酚+高糖组和 30 μmol/L山奈酚+高糖组。分组处理细胞后,采用MTT实验检测正常糖浓度和高糖下山奈酚对HBZY-1细胞增殖的影响;流式细胞仪检测各组细胞周期变化;Real-time PCR检测各组细胞纤维连接蛋白 (FN)、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的表达,Western blot检测FN、CTGF、细胞周期相关蛋白以及p38 MAPK信号通路蛋白的表达。结果山奈酚(10、30 μmol/L)对正常糖浓度培养的HBZY-1细胞增殖影响不大(P>0.05),高糖能够增强细胞的增殖能力（P<0.05）, 而山奈酚(10、30 μmol/L)可抑制高糖引起的增强细胞增殖作用（P<0.05）。高糖能减少G0/G1期细胞比例,增加S期细胞比例,并降低细胞周期相关蛋白p21Cip1以及p27Kip1蛋白表达,山奈酚(10、30 μmol/L)能够阻止高糖引起的细胞周期改变以及细胞周期相关蛋白表达的下调。山奈酚(10、30 μmol/L)同时能够抑制高糖引起的细胞FN、CTGF mRNA和蛋白表达水平的上调。高糖能够增加磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)蛋白水平,而山奈酚(10、30 μmol/L)处理能够剂量依赖性的抑制高糖诱导的p-p38MAPK蛋白的表达上调。结论山奈酚对高糖诱导的HBZY-1细胞增殖起抑制作用,其作用机理可能是通过调控p38 MAPK信号通路,对高糖培养下的HBZY-1细胞起到保护作用。     

针对Toll样受体4基因的小发夹结构RNA对RAW264.7细胞炎症因子分泌的抑制作用

目的构建针对Toll样受体(TLR)4 mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的抑制作用,以探讨针对TLR4基因的RNAi对RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用.方法构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA,运用网络工具siRNA Wizard(http//www.simawizard.com/)设计针对TLR4 mRNA的寡核苷酸片段.将其克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA.运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7,观察细胞系中荧光蛋白的表达强度;再运用脂多糖刺激转染的RAW264.7细胞,运用ELISA方法检测该细胞系分泌炎症因子水平的变化.结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4-siRNA分别用Bbs Ⅰ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4.9 kb和340 bp的的条带,后者出现5.0 kb和220 bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确.将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至RAW264.7细胞后,EGFP的表达率为50%±8%.用脂多糖刺激后,TLR4-SiRNA转染组细胞培养液TNF-α水平(2 h825 pg/ml±136 pg/ml;8 h2190 pg/ml±359 pg/ml)明显低于对照siRNA转染组(2 h1179 pg/ml±240 pg/ml;8 h4720 pg/ml±227 pg/ml,均P＜0.01).结论针对TLR4 mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用.     

CYP3A4＊1G基因多态性及功能的初步探讨

采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4＊ 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4＊ 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示,pGL3-promoter-A质粒转染后荧光素酶活性显著高于pGL3-promoter-G（P=0.022＜ 0.05）. CYP3A4＊ 1G能够增强荧光素酶基因的表达,可能增强CYP3 A4基因的转录活性.