参附注射液对大鼠肠缺血再灌注损伤和修复时肠上皮细胞的保护作用

背景；细胞凋亡在肠缺血再灌注损伤和修复中起主要作用，参附注射液对肠缺血再灌注时肠上皮细胞凋亡的影响有待观察。目的；分析肠上皮细胞凋亡与肠缺血再灌注损伤和修复特征的关系一设计：随机对照动物实验。单位：湖北省咸宁市中心医院普外科及武汉大学人民医院普外科。材料：实验于2005-03／08在咸宁市中心医院中心实验室完成，选择54只健康雄性大鼠．体质量200～250g．购自武汉大学医学院动物实验中心。方法：随机摸球法将大鼠分为对照组6只．肠缺血再灌注组24只及参附处理组24只。①麻醉大鼠．分离其肠系膜上动脉．肠缺血再灌注组、参附处理组用无损伤血管夹阻断肠系膜上动脉血流1h，再灌注1，24，72h．参附处理组于阻断前30min经静脉输注参附注射液8mL／（k&;#183;h），20mL／（k&;#183;d），由人参和黑付子组成（雅安三九药液公司．批号：030302）：对照组不阻断肠系膜上动脉血流．对照组与肠缺血再灌注组于阻断前30min经静脉输注等量生理盐水．整个实验过程对大鼠进行面罩给氧。②肠缺血再灌注组和参附处理组分别于缺血后1h、再灌注1．24，72h取材．对照组于造模后取材．每组各6只。观察各组大鼠肠黏膜组织病理学改变（采用下列评分系统：0分，绒毛和腺体正常；1分部分绒毛顶端上皮轻度受损；2分．上皮下腺体轻度受损；3分．上皮下间隙扩大．毛细血管充血；4分，上皮与固有层中度分离．腺体受损；5分。部分绒毛顶端脱落；6分．绒毛明显脱落；7分．固有层绒毛脱落；8分．固有层开始消化分解；9分，出血、溃疡形成）和有丝分裂活性：③采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口未端标记实验结合激光共聚焦显微镜观察小肠黏膜上皮细胞凋亡情况，测定细胞凋亡指数，即每张切片随机取10个高位视野，每100个细胞中凋亡阳性细胞数。④在苏木精一伊红染色的肠黏膜上皮细胞间观察有丝分裂相．10个相邻肠黏膜上皮细胞间具有有丝分裂相的细胞数作为有丝分裂活性指数。主要观察指标：各组大鼠组肠黏膜组织病理学改变．细胞凋亡指数和有丝分裂活性的测定。结果：纳入大鼠54只全部进入结果分析。①参附处理组大鼠肠缺血1h、再灌注1，24h黏膜组织病理学改变评分分别为[（0．65&;#177;0．35），（3．87&;#177;0．86），（0．65&;#177;0.35）分．低于肠缺血一再灌注组[（7．11&;#177;1．01）．（8．05&;#177;1．34），（1．53&;#177;0．48）分．P〈0．05]。②参附处理组大鼠肠缺血1h、再灌注1，24，72h黏膜上皮细胞凋亡指数分别为（17．24&;#177;7．05），（24．20&;#177;9.87），（11．49&;#177;4．71），（6．02&;#177;2．16）个，低于肠缺血-再灌注组[（51．09&;#177;13．76），（54．89&;#177;15．58），（23．54&;#177;9．64），（12．47&;#177;5．52）个，P〈0．05]，缺血1h、再灌注1h有丝分裂活性分别为（10．37&;#177;2．03），（11．72&;#177;2．07）个．高于肠缺血一再灌注组[（8.24&;#177;1．69）．（9．95&;#177;1．93）个，P〈0．05]。结论：参附注射液能够降低肠黏膜上皮细胞凋亡，并增强肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性．从而促进肠黏膜损伤的修复。     

参附注射液对再灌注期间肠黏膜上皮细胞凋亡的抑制

背景肠上皮细胞异常凋亡是缺血再灌注期间肠黏膜损伤的主要原因,参附注射液对小肠黏膜损伤有良好的防治作用.目的建立大鼠肠缺血再灌注模型,观察缺血再灌注时给予参附注射液对肠上皮细胞凋亡数目、凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bcl-2的表达及肿瘤坏死因子水平的影响.设计随机对照实验.单位武汉大学人民医院麻醉科.材料实验于2002-12/2003-06在武汉大学人民医院麻醉科实验室完成.选取健康清洁级SD大鼠24只,随机分为空白对照组、肠缺血再灌注组、参附注射液组,8只/组.方法各组大鼠给予氨基甲酸乙酯1 mg/kg腹腔注射麻醉,肠缺血再灌注组和参附注射液组用血管钳夹闭肠系膜上动脉1 h然后再灌注2 h,空白对照组不用血管钳夹闭肠系膜上动脉.参附注射液组于阻断前30 min静注参附注射液0.02 mL/g,空白对照组和肠缺血再灌注组静脉输注等量生理盐水.制备切片进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bcl-2蛋白的表达及细胞凋亡检测.主要观察指标①各组大鼠细胞凋亡指数的比较.②各组大鼠肠上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及Bcl-2基因的表达.③各组肠粘膜匀浆中肿瘤坏死因子含量的比较.结果实验选用24只大鼠,全部进入结果分析.①各组大鼠细胞凋亡指数的比较参附注射液组的凋亡指数明显低于肠缺血再灌注组,但比空白对照组高[(7.75±1.89)%,(28.25±8.50)%,(4.25±2.63)%,P均＜0.01].②各组大鼠肠上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及Bcl-2基因的表达参附注射液组组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达低于肠缺血再灌注组,但高于空白对照组[(0.211 6±0.087 5),(0.354 7±0.077 8),(0.194 1±0.057 4),P＜0.01,P＞0.05];Bcl-2的表达在肠缺血再灌注组比空白对照组显著增高(P＜0.05),参附注射液组的表达比肠缺血再灌注组明显降低(P＜0.01).③各组肠黏膜匀浆中肿瘤坏死因子含量的比较砀缺血再灌注组肿瘤坏死因子的表达显著高于空白对照组和参附注射液组[(189.7±56.3),(38.6±10.4),(47.5±18.7)mg/L,P均＜0.01],参附注射液组和空白对照组基本相似(P＞0.05).结论参附注射液通过抑制肿瘤坏死因子的含量、降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达、上调Bcl-2基因而抑制缺血再灌注期间肠黏膜上皮细胞的凋亡,从而减轻肠黏膜缺血再灌注损伤.     

参附注射液对再灌注期间肠黏膜上皮细胞凋亡的抑制

背景：肠上皮细胞异常凋亡是缺血再灌注期间肠黏膜损伤的主要原因，参附注射液对小肠黏膜损伤有良好的防治作用。目的：建立大鼠肠缺血再灌注模型，观察缺血再灌注时给予参附注射液对肠上皮细胞凋亡数目、凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bcl-2的表达及肿瘤坏死因子水平的影响。设计：随机对照实验。单位：武汉大学人民医院麻醉科。材料：实验于2002-12／2003-06在武汉大学人民医院麻醉科实验室完成。选取健康清洁级SD大鼠24只，随机分为空白对照组、肠缺血再灌注组、参附注射液组，8只／组。方法：各组大鼠给予氨基甲酸乙酯1mg／kg腹腔注射麻醉，肠缺血再灌注组和参附注射液组用血管钳夹闭肠系膜上动脉1h然后再灌注2h．空白对照组不用血管钳夹闭肠系膜上动脉。参附注射液组于阻断前30min静注参附注射液0．02mL／g，空白对照组和肠缺血再灌注组静脉输注等量生理盐水。制备切片进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bcl-2蛋白的表达及细胞凋亡检测。主要观察指标：①各组大鼠细胞凋亡指数的比较。②各组大鼠肠上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及Bcl-2基因的表达。③各组肠粘膜匀浆中肿瘤坏死因子含量的比较。结果：实验选用24只大鼠，全部进人结果分析。①各组大鼠细胞凋亡指数的比较：参附注射液组的凋亡指数明显低于肠缺血再灌注组．但比空白对照组高【（7．75&;#177;1．89）％，（28．25＋8．50）％，（4．25＋2．63）％．P均〈0．01]。（（2）各组大鼠肠上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及Bcl-2基因的表达：参附注射液组组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达低于肠缺血再灌注组，但高于空白对照组[（0.2116&;#177;0．0875），（0．3547＋0．0778）．（0．1941&;#177;0.0574），P〈0．01，P〉0．051；Bcl-2的表达在肠缺血再灌注组比空白对照组显著增高（P〈0．05），参附注射液组的表达比肠缺血再灌注组明显降低（P〈0．01）。（2）各组肠黏膜匀浆中肿瘤坏死因子含量的比较：肠缺血再灌注组肿瘤坏死因子的表达显著高于空白对照组和参附注射液组[（189．7＋56．3），（38．6＋10．4），（47．5&;#177;18．7）mg／L，P均〈0．011，参附注射液组和空白对照组基本相似（P〉0．05）。结论：参附注射液通过抑制肿瘤坏死因子的含量、降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达、上调Bcl-2基因而抑制缺血再灌注期间肠黏膜上皮细胞的凋亡，从而减轻肠黏膜缺血再灌注损伤。     

大鼠弥漫性脑损伤后小肠黏膜超微结构与黏膜上皮细胞凋亡的动态变化

目的:观察弥漫性脑损伤后大鼠肠黏膜超微结构和上皮细胞凋亡的动态变化,分析二者在肠黏膜屏障功能障碍中的作用。方法:实验于2003-12/2005-12在华北煤炭医学院附属医院动物实验室进行。将雄性Wistar大鼠以随机数字表法分成对照组和伤后1,2,4,8,12,24,48,72,168h共9个时相组,每组15只。采用Marmarou脑损伤动物模型法对损伤组致大鼠重型弥漫性脑损伤,对照组只切开头皮,不行落体致伤,而后缝合切口。严格依照1,2,4,8,12,24,48,72,168h时间点,依次对各组大鼠回盲部近端2cm处切取直径为1mm小肠组织圈。对照组术后立即处死,处理同实验组。透射电镜下比较对照组和致伤组大鼠肠黏膜超微结构的改变,观察伤后小肠黏膜超微结构的动态变化。原位末端标记(TUNEL)法计数各组凋亡细胞的发生率。结果:实验大鼠全部进入结果分析,无脱失。①对照组大鼠肠黏膜上皮细胞微绒毛高而密,排列整齐,细胞间紧密连接完整,线粒体等细胞器结构正常。致伤组微绒毛短而稀,不规则,可见紧密连接开放,线粒体肿胀,内嵴断裂。②TUNEL法显示凋亡细胞胞核为棕褐色,固缩呈断片状,主要位于绒毛顶部,且随致伤时间的延长有由上向下发展的趋势。伤后1h细胞凋亡计数较对照组差异无显著性意义[(2.47±1.26),(2.16±0.83)个/100个细胞,P>0.05],伤后2h直至168h凋亡细胞数较对照组均显著增加[(6.17±2.23),(13.79±2.99),(16.68±2.91),(21.74±3.75),(16.16±2.63),(14.05±3.06),(16.26±2.90),(7.32±2.50)个/100个细胞,P<0.01]。结论:弥漫性脑损伤后,肠黏膜超微结构的改变包括紧密连接开放等是肠黏膜屏障功能障碍的形态学基础,黏膜上皮细胞凋亡过度在肠黏膜屏障功能障碍发生中可能起重要作用。     

诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤及软骨细胞凋亡中的作用

目的:观察兔膝关节软骨缺血再灌注损伤过程中诱导型一氧化氮合酶的表达规律及软骨细胞的凋亡情况,探讨诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤中的作用。方法:实验于2004-03/09在泰山医学院形态学研究室完成。①选择健康新西兰白兔45只,随机分为假手术组5只,暴露股动静脉但不阻断血运,术后4h取材;缺血组5只,缺血4h不恢复血运即取材;缺血再灌注组35只,阻断股动静脉4h后恢复血运,于缺血再灌注2,4,8,24h,3,7,14d取材,每时点各5只。②采用免疫荧光法测定软骨内诱导型一氧化氮合酶的表达阳性细胞,染色成功后用激光共聚焦显微镜观察并扫描记录。阳性细胞标记为红色荧光。③采用原位末端标记法测定凋亡软骨细胞数目,染色成功后在显微镜下观察并记数。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。结果:纳入动物45只,均进入结果分析。①缺血再灌注组诱导型一氧化氮合酶阳性细胞数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24h,3,7,14d分别为0,(1.20±0.40),(22.20±1.30),(33.00±1.58),(40.00±1.58),(33.80±1.30),(18.20±1.48),(11.20±1.67),(3.00±1.00)个/mm2,P<0.01]。②缺血再灌注组软骨细胞凋亡数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24h,3,7,14d分别为[(0.50±0.40),(1.20±0.45),(7.80±1.30),(12.60±1.14),(16.60±1.12),(17.80±1.30),(15.20±0.87),(13.60±0.89),(4.40±1.67)个/mm2,P<0.01]。③诱导型一氧化氮合酶的表达与软骨细胞凋亡数高度相关(r=0.716,P=0.046)。结论:诱导型一氧化氮合酶参与了软骨缺血再灌注损伤,并可能是触发软骨细胞凋亡的重要因素。     

肠上皮细胞凋亡与肠缺血损伤及再生修复的实验研究

目的 探讨小肠黏膜缺血损伤及再生修复的特征及规律，以及与肠上皮细胞凋亡的关系。方法 应用小肠缺血再灌注模型，检测小肠缺血及再生修复过程中肠黏膜结构、黏膜隐窝上皮细胞分裂活性及黏膜上皮细胞凋亡的改变。结果 肠缺血再灌注lh，肠黏膜损害加重，黏膜上皮细胞凋亡明显增加，黏膜隐窝上皮细胞分裂活性降低；肠黏膜再生ld、3d组肠黏膜上皮细胞凋亡明显减少，黏膜隐窝上皮细胞分裂活性增加，并逐渐恢复至正常水平，肠黏膜结构逐渐恢复至正常。结论 肠上皮细胞凋亡在肠缺血再灌注损伤及肠再生修复过程中起重要作用。     

葛根素对大鼠脑复苏后海马CA1区神经细胞凋亡相关基因的影响

背景:Fas及 P53是重要的促进凋亡的调控基因,属于肿瘤坏死因子 /神经生长因子受体家族,其表达产物具有传递凋亡信号的作用,可调控脑缺血再灌注损伤时细胞的凋亡,而葛根素则能够减轻细胞的凋亡程度。目的:观察葛根素对大鼠脑复苏后海马 CA1区神经细胞凋亡相关基因Fas及 P53的影响。设计:随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科。材料:实验于 2001-09/2002-02在华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科实验室完成。选取清洁级 3个月龄 W istar大鼠 45只,随机分为假手术组、模型对照组、葛根素治疗组,15只 /组。方法:葛根素治疗组及模型对照组建立大鼠急性全脑缺血再灌注模型。假手术组只分离第一颈椎两侧翼小孔,但不电凝两侧椎动脉,只分离两侧颈总动脉,但不夹闭之。葛根素治疗组于缺血前 1h 给予葛根素注射液 100m g/kg,模型对照组给予等量生理盐水,假手术组不给药。各组大鼠分别于脑缺血再灌注后 3,6,12,24,48h 即速处死,每次每组 3只。分离海马组织,制备组织切片,利用免疫组化法、原位末端标记法检测各组大鼠脑缺血再灌注后不同时间点 Fas及 P53蛋白表达的水平及凋亡细胞数的变化。主要观察指标:①各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区 Fas及P53蛋白表达的阳性细胞数。②各组脑缺血再灌注后不同时间点海马CA1区凋亡细胞数的比较。结果:实验纳入大鼠 45只,全部进入结果分析。①各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区 Fas蛋白表达的阳性细胞数:假手术组未见明显Fas 基因表达。与模型对照组比较,葛根素治疗组于脑缺血再灌注后各时间点均明显降低,6,12,24,48h 时差异显著 [(15.0±4.3),(13.5±4.9);(40.7±3.4),(27.2±3.1);(37.0±4.8),(22.0±2.1);(24.7±4.1),(18.9±5.3)个 /m m ;P <0.05,P <0.01]。②各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区P53蛋白表达的阳性细胞数:假手术组未见明显 P53基因表达。与模型对照组比较,葛根素治疗组于脑缺血再灌注后 24,48h 均明显降低[(25.3±4.4),(12.8±2.7);(24.3±3.6),(10.9±3.0)个 /m m ;P <0.01]。③各组脑缺血再灌注后不同时间点海马 CA1区凋亡细胞数的比较:与模型对照组比较,葛根素治疗组于脑缺血再灌注后 12,24,48h 均明显降低[(34.0±3.7),(21.0±3.7);(41.0±4.2),(33.0±4.8);(71.0±5.5),(41.0±3.4)个 /m m ;P <0.01]。结论:给予葛根素治疗的大鼠缺血再灌注 6～48h 时 Fas的表达显著降低,缺血再灌注 24～48h 时 P53的表达亦明显减少,且凋亡细胞数也呈下降趋势,进一步证实葛根素的脑保护作用,提示葛根素抑制脑复苏后的细胞凋亡可能与其减少促凋亡基因 Fas及 P53蛋白表达有关。     

全脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的表达

背景:脑缺血再灌注对中枢神经系统的影响,除了急性期的细胞坏死,还有迟发性的神经元凋亡.目的:观察大鼠全脑缺血不同再灌注阶段海马神经元凋亡率、坏死率及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的表达情况,并探讨其对全脑缺血再灌注损伤的调节作用.设计:随机对照实验.单位:首都医科大学附属北京天坛医院的神经外科和麻醉科.材料:实验于2003-01/2004-01在首都医科大学附属北京神经外科研究所完成.选择清洁级成年雄性健康Wistar大鼠33只,随机分5组,缺血再灌注24 h组7只、缺血再灌注48 h组7只、缺血再灌注72 h组7只、缺血再灌注7 d组7只和假手术对照组5只.干预:制备大鼠全脑缺血再灌注模型.分别于再灌注24,48,72 h和7 d取脑海马组织,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,坏死率,Bcl-2和Bax蛋白在大鼠脑海马神经元中的表达情况.主要观察指标:①流式细胞仪检测各组大鼠脑海马组织细胞凋亡率和坏死率.②Bcl-2和Bax蛋白表达百分率.结果:33只大鼠全部进入结果分析.①缺血再灌注7 d组海马神经元的凋亡率最高[(24.59±0.97)%],坏死率峰值出现在缺血再灌注24 h组[(16.67±1.04)%],明显高于假手术对照组[(1.28±0.50)%,(0.90±0.38)%](P＜0.01).②假手术对照组Bcl-2表达极低[(1.07±0.27)%],但Bax有高表达[(46.09±5.37)%].③Bcl-2蛋白峰值出现在缺血再灌注后48 h[(14.41±0.67)%],而Bax蛋白峰值出现在缺血再灌注之后72 h[(77.38±1.52)%].结论:全脑缺血再灌注损伤后海马神经元凋亡率逐渐增高,凋亡调控基因Bcl-2和Bax表达异常增高,提示Bcl-2和Bax蛋白参与了全脑缺血再灌注损伤的凋亡调节.     

红景天对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用

目的:利用SD大鼠制备肠缺血再灌注模型,观察红景天对肠缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制。方法:实验于2005-08/2006-05在第四军医大学西京医院胃肠外科实验室完成。雄性SD大鼠30只,体质量200～250g,随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注组、红景天处理组,每组10只。红景天液制法参照中药质量标准:取红景天生药102g,加水煎煮2次,第1次1.5h,第2次1h,滤过,滤液合并后加水调至120mL,每只大鼠2mL/d,相当于生药5g/(kg·d)。缺血再灌注模型制备:动物于术前12h禁食,不禁水。以2%盐酸氯胺酮(100mg/kg)腹腔注射麻醉。生理盐水2mL/d,连续灌胃5d后,取正中切口入腹后分离肠系膜上动脉,以无创伤血管夹阻断肠系膜上动脉根部造成小肠完全缺血60min,然后松夹进行再灌注60min。假手术组:生理盐水2mL/d,连续灌胃5d后,只分离肠系膜上动脉,但不作阻断。红景天处理组:红景天按5g/kg生药,溶于2mL水中灌胃给药,连续5d后,分离肠系膜上动脉,夹闭肠系膜上动脉60min后再灌注60min。检测各组大鼠小肠黏膜中肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6水平,以及其中的超氧化物歧化酶和丙二醛的含量。结果:30只大鼠均进入结果分析。①缺血再灌注组肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6水平均高于假手术组和红景天处理组[肿瘤坏死因子α:(2.57±0.29),(0.32±0.06),(1.06±0.11)μg/L;白细胞介素-6:(965.73±42.01),(122.46±1.74),(385.03±13.50)ng/L,P<0.01]。②缺血再灌注组丙二醛水平高于假手术组和红景天处理组[(0.68±0.11),(0.33±0.10),(0.54±0.12)nmol/g,P<0.01];超氧化物歧化酶水平低于假手术组和红景天处理组[(34.12±5.31),(92.63±3.82),(55.66±5.92)NU/g,P<0.01]。结论:红景天可通过抑制细胞因子表达及清除氧自由基的方式,对肠缺血再灌注损伤起到保护作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织的氧化损伤

目的:通过观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的变化,进一步探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后氧化损伤的病理生理改变。方法:实验于2004-09/2005-01在泸州医学院神经生物学教研室进行。将雄性成年Wistar大鼠60只随机分为2组:假手术组30只和缺血再灌注组30只。每组分3个观察时间点,分别为手术后6,12,24h,每个时间点10只。采用线栓法制成大脑中动脉闭塞模型,假手术组手术过程同缺血再灌注组,但未插栓线,不造成脑缺血。测定手术后不同时点脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平。结果:在实验过程中有6只大鼠死亡,缺血再灌注组有8只大鼠手术后模型评价为0级,被排除实验,随机补充14只大鼠,最终进入结果分析仍为60只大鼠。①缺血再灌注组术后6,12,24h超氧化物歧化酶活性均低于假手术组眼(289.72±10.67),(534.77±22.67)μkat/L;(330.57±18.17),(539.11±11.50)μkat/L;(377.58±14.67),(550.78±11.50)μkat/L,P<0.05演。②缺血再灌注组术后6,12,24h丙二醛水平显著高于假手术组眼(15.06±0.59),(6.78±0.25)μmol/L;(13.53±1.11),(6.78±0.26)μmol/L;(11.31±0.97),(6.80±0.26)μmol/L,P<0.05演。结论:脑缺血再灌注后,缺血大鼠脑组织内丙二醛水平升高,超氧化物歧化酶活性降低,说明自由基参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。     

亚低温缺血预处理对大鼠肠缺血再灌注诱导细胞凋亡的保护

背景细胞凋亡在肠缺血再灌注损伤中起关键性作用,细胞凋亡的发生与凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促进基因Bax蛋白表达程度密切相关.目的探讨亚低温缺血预处理对大鼠肠组织缺血再灌注后凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.设计随机对照实验.单位湖北省咸宁学院医学院外科学教研室与生物化学教研室.材料实验于2002-04/12在咸宁学院医学院中心实验室完成.选用Wistar健康雄性大鼠32只,术前禁食24 h,自由饮水.随机分为假手术对照组、缺血再灌注组、缺血预处理组、亚低温预处理组,8只/组.方法除假手术对照组外,其余3组建立缺血再灌注模型.①假手术对照组仅暴露肠系膜上动脉而不夹闭,共2 h,结束实验后取材;缺血再灌注组夹闭肠系膜上动脉60min后松夹60 min再取材;缺血预处理组夹闭肠系膜上动脉5 min和松夹5 min作为预处理,余同缺血再灌注组;亚低温预处理组实施缺血预处理前在小肠周围充填碎冰造成小肠亚低温(33～35℃),余同缺血预处理组.②各组大鼠取中段小肠4 cm,分为两段,分别置于甲醛和戊二醛中固定,制作电镜标本.免疫组化后显微镜下用图像分析系统检测各组吸光度值,每组选10个视野进行测量,计算平均值,肠黏膜损伤按Chiu标准进行分级.0级正常黏膜绒毛;Ⅰ级上皮下间隙增大,通常在绒毛的尖端,常伴有毛细血管淤血;Ⅱ级上皮下间隙扩张伴随上皮层同固有层中度分离;Ⅲ级绒毛两侧上皮层大量的同固有层分离,部分绒毛顶端破损;Ⅳ级绒毛破损伴随固有层毛细血管暴露,可能观察到固有层的细胞成分增多;Ⅴ级固有层破坏和不完整、出血和溃疡.主要观察指标①各组肠缺血再灌注后Bcl-2与Bax蛋白吸光度值的变化.②各组肠黏膜损伤分级.③各组肠黏膜组织学变化.结果32只大鼠全部进入结果分析,中途无脱落.①各组肠缺血再灌注后Bcl-2与Bax蛋白吸光度值的变化与假手术对照组比较,缺血再灌注组均明显升高(4.03±1.02,9.56±1.32,P＜0.01;5.67±1.34,19.07±1.63,P＜0.01);与缺血再灌注组比较,缺血预处理组Bcl-2表达升高(9.56±1.32,15.03±1.44,P＜0.01),Bax表达降低(19.07±1.63,14.11±1.21,P＜0.01);与缺血预处理组比较,亚低温预处理组Bcl-2表达仍有所升高(15.03±1.44,18.17±2.03,P＜0.05),Bax表达仍降低(14.11±1.21,11.58±1.04,P＜0.05).②各组肠黏膜损伤分级情况假手术对照组肠黏膜基本正常,损伤均为0级;缺血再灌注组肠黏膜损伤Ⅱ级2只,Ⅲ级3只,Ⅳ级3只,明显高于假手术对照组(P＜0.01);缺血预处理组肠黏膜损伤Ⅰ级2只,Ⅱ级4只,Ⅲ级2只,明显低于缺血再灌注组(P＜0.01);亚低温预处理组肠黏膜损伤0级1只,Ⅰ级3只,Ⅱ级4只,低于缺血预处理组(P＜0.05).③各组肠黏膜组织学形态电镜观察结果假手术对照组肠黏膜上皮微绒毛排列整齐,各细胞器形态正常;缺血再灌注组肠黏膜上皮微绒毛稀疏、变短、脱落,线粒体明显肿胀,空泡变性,内质网排列紊乱、肿胀;缺血预处理组肠黏膜上皮微绒毛排列基本整齐,线粒体内质网轻度肿胀;而亚低温预处理组肠黏膜上皮微绒毛排列整齐,线粒体内质网肿胀不明显.结论肠缺血再灌注前进行缺血预处理可以上调Bcl-2蛋白的表达,并下调Bax蛋白的表达,从而抑制肠缺血再灌注诱导的细胞凋亡以保护缺血再灌注肠损伤.亚低温状态能增强缺血预处理的保护作用.     

高压氧对大鼠肠缺血-再灌注损伤致细胞凋亡的影响

目的 观察大鼠在小肠缺血-再灌注(I/R)不同时期应用高压氧(HBO)治疗对小肠黏膜细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 采取大鼠肠系膜上动脉(SMA)钳夹缺血60 min,松钳夹再灌注60 min,建立S-D大鼠小肠I/R损伤模型,并随机(随机数字法)分成4组:I/R组、缺血前HBO治疗组或HBO预处理组(HBO-P)、缺血期HBO治疗组(HBO-I)和再灌注期HBO治疗组(HBO-R).再灌注60 min后,取回肠末端小肠标本.采用酶连免疫吸附试验法(Elisa)检测肠道组织TNF-α,用比色法检测肠道组织匀浆含量ATP,用免疫组化法检测小肠组织中半胱氨酸天门冬氨酸特异蛋白酶(Caspase-3)的表达.数据以均数±标准差(-x±s)表示,采用单因素方差分析检验,独立样本间比较采用SNK-q检验.结果 肠道组织TNF-α含量在HBO-I组最低,其次为HBO-P组(每两组比较P＜0.05),但前两组明显低于HBO-R组和I/R组(P＜0.05),HBO-R组略低于I/R组,但差异无统计学意义(P＞0.05);Caspase-3表达在HBO-I组最低,HBO-P组次之(两组比较P＜0.05);HBO-R和I/R组最高(与前两组比较P＜0.05),尽管HBO-R组略低于I/R组,但差异无统计学意义(P＞0.05);ATP含量在HBO-I组最低,HBO-P组次之(两组比较P＜0.05),HBO-R和I/R组最高(与前两组比较P＜0.05),尽管HBO-R组略低于I/R组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HBO、小肠I/R损伤和小肠黏膜上皮凋亡之间存在联系;HBO治疗可以维持黏膜上皮细胞能量代谢,减少ATP耗竭,降低肠道组织TNF-α含量,减轻I/R损伤小肠黏膜上皮凋亡;在缺血期和缺血前应用HBO治疗显示有益结果,特别是在缺血期应用HBO效果最好,再灌注期应用HBO无效.     

Repair of damaged intestinal mucosa in a mouse model of sepsis

BACKGROUND:

The intestine is not only the main target attacked by sepsis but also the vital organ which mediated sepsis. The recovery of the damaged intestinal barrier structure and function is related to the occurrence and outcome of multiple organ dysfunction syndrome (MODS). How to protect and reduce the damage of the intestinal mucosa and how to promote the reconstruction of the intestinal mucosa have been the important topics in sepsis for many years. This study aimed to investigate the influential factors of intestinal mucosal reconstruction after intestinal epithelial injury in vivo in a mouse model of sepsis.

METHODS:

Mice were subjected to cecal ligation and puncture (CLP) for induction of sepsis to assess intestinal mucosal damage, epithelial cell apoptosis, and transformed number of goblet cells, and to detect the concentration of TNF-α, IL-1 and TGF-β1 and TFF3 (trefoil factor 3) expression in the small intestinal mucosa. All above were performed by HE staining, western blot, ELISA and immunohistochemistry respectively. The experimental animals were divided into a sepsis group and a sham-operation group. The animals with sepsis were separately killed at 6 (7 animals), 24 (7 animals) and 48 hours (7 animals) after CLP.

RESULTS:

Injured intestinal mucosa was observed in the 3 groups under a light microscope, in which damage scores in the 24-hour and 48-hour groups were higher than in the 6-hour group and no difference was found between the two groups. Moreover, less of goblet cells or other epithelial cells adjacent to the injured surface migrated into the wound to cover the denuded area. The number of goblet cells was substantially decreased in the three CLP groups compared with the sham-operation group. Protein levels of IL-1 and TNF-α were significantly increased by 3–4 fold at all time points when compared with the sham-operation group, and cleaved caspase-3 by 4 fold. Although TFF3 expression was modestly increased for 6 hours after the onset of CLP, it appeared to decline at 24 hours and 48 hours as shown by Western blot. A similar tendency was observed upon TGF-β1, i.e. the protein level was not elevated at 24 hours and 48 hours, but increased modestly at 6 hours.

CONCLUSIONS:

Sepsis from CLP shows less restitution on the surface of injured intestinal mucosa. There is evidence that both constant inflammatory reaction and epithelial cell apoptosis may affect mucosal reestablishment of the intestine at the onset of sepsis. Mucosa after severe sepsis showed the state of high inflammation, and declined goblet cell function and mucosal reconstruction, which affected the repair of damaged intestinal barrier. Constant inflammatory reaction, and declined goblet cell function and mucosal reconstruction ability may affect the reestablishment of intestinal mucosa at the onset of sepsis.KEY WORDS: Sepsis, Cecal ligation and puncture, Intestinal mucosa, Restitution, Goblet cells, Intestinal trefoil factor 3, Transforming growth factor β1, Cysteine-containing aspartate-specific proteases     

神经节苷脂对大鼠急性脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

背景:大鼠急性脑缺血再灌注损伤后有细胞凋亡及凋亡相关基因的表达。目的:观察神经节苷脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。设计:随机对照动物实验。单位:吉林大学中日联谊医院神经内科。材料:实验于2002-04在吉林大学中日联谊医院动物实验室完成。健康雄性Wistar大鼠48只,鼠龄三四个月,体质量(220±50)g。大鼠随机分为缺血再灌注组和缺血再灌注 给药组(缺血前30min腹腔注射神经节甘脂GM-1),24只/组。其中又根据再灌注时间不同,每组分别分为3个时相点,即3h、6h和24h点,每个时相点8只大鼠。方法:①建立大鼠全脑缺血再灌注模型。②应用二苯胺法测定大鼠脑缺血后3h、6h、24h脑组织DNA裂解率变化,取大脑皮质100mg加0.9mL裂解液制成10%匀浆,加入离心管中,反复冻融,收集上清和沉淀,DNA裂解率=上清吸收值/(上清吸收值 沉淀吸收值)。③免疫组织化学方法观察蛋白激酶Cδ表达,以及神经节苷脂给药后的变化。主要观察指标:大鼠脑皮质DNA裂解率的变化及蛋白激酶Cδ表达强度的变化。结果:实验过程中盐水对照组再灌注6h时死亡1只,麻醉过量死亡,再灌注24h时死亡2只,分别予以补充。随着再灌注时间的延长,DNA裂解率变化明显增加,24h达高峰,蛋白激酶Cδ表达于再灌注6h达高峰,以后逐渐呈下降趋势;神经节苷脂组相应时间点的DNA裂解率及蛋白激酶Cδ表达明显减少。结论:神经节苷脂能抑制脑缺血再灌注后细胞凋亡的发生,并减少蛋白激酶Cδ的表达,对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。     

肠缺血/再灌注时卡巴胆碱对肠上皮细胞凋亡的影响

目的研究肠缺血/再灌注(I/R)时卡巴胆碱对肠上皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法雄性Wistar大鼠,戊巴比妥钠腹腔麻醉,结扎肠管造成长约8cm肠袋,采用夹闭肠系膜上动脉(SMA)阻断血流45min后恢复血流的方法,制备肠I/R损伤模型。将动物按随机数字表法分为假手术组(n=40)、I/R模型组(n=40)和卡巴胆碱组(n=40)。卡巴胆碱组在阻断血流的同时向肠袋内注射卡巴胆碱(0.1mg/kg),I/R模型组给予等量生理盐水。分别在再灌注0、30、60、120和240min时,采用病理学方法按Chiu's评分观察肠上皮细胞损伤;原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测肠上皮细胞凋亡指数的变化;免疫组化法检测肠上皮细胞凋亡相关半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase-3)和Bcl-2蛋白表达的变化。结果与I/R模型组比较,卡巴胆碱组肠上皮细胞病理学变化较轻,凋亡指数明显降低,caspase-3阳性肠上皮细胞数明显减少,而Bcl-2阳性肠上皮细胞数明显增加(P均<0.01)。结论卡巴胆碱能抑制I/R时肠上皮细胞caspase-3表达,增加Bcl-2表达,减少肠上皮细胞的凋亡。     

Antithrombin III prevents 60 min warm intestinal ischemia reperfusion injury in rats

We investigated the effect of antithrombin III on 60 min warm intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury in rats. Sprague-Dawley rats, weighing 220–250 g, were divided into three groups: group 1 sham-operated group (no IR injury, n=8), group 2 ischemic control group (control, Ringer’s lactate infused, n=8), group 3 Antithrombin III treated group (250 U/kg before ischemia, n=8). Intestinal ischemia was induced in rats by occluding the superior mesenteric artery for 60 min. Malondialdehyde (MDA) levels, myeloperoxi-dase activity (MPO) and mucosal damage were investigated after 120 min reperfusion. Elevated MDA levels and MPO activity and severe histopathological damage were observed in the control group compared with the sham group (P<0.05). Decreased MDA levels and MPO activity and less histopathological damage were detected in group 3 compared with the control group (P<0.05). Accumulation of lipid peroxidation products and neutrophils in mucosal tissues were significantly inhibited by antithrombin III treatment. We conclude that treatment with antithrombin III before intestinal ischemia prevents histological damage in rats.     

大黄对大鼠肠缺血再灌注所致肺损伤的作用

背景:肠道因素尤其是肠缺血再灌注可导致远隔器官损伤是创伤。中药大黄能通过清除氧自由基,促进肠粘膜内杯状细胞增生,抑制肠道内细菌过度繁殖和肠道内毒素吸收及活血化瘀、改善微循环等途径发挥良好的肠黏膜屏障保护作用,进而可能发挥防治肺损伤的作用。目的:观察大黄对肠缺血-再灌注所致肺损伤的防治效应,以及对肿瘤坏死因子和磷脂酶A2的影响。设计:随机对照观察。单位:解放军兰州军区乌鲁木齐总医院急诊科。材料:实验于2003-02/07在解放军第二军医大学完成。选取SD大鼠80只,随机分为肠缺血再灌注组24只,假手术组16只,治疗组24只,生理盐水组16只四组。方法:肠缺血-再灌注组,术前禁食,麻醉,然后经腹正中切口,分离肠系膜上动脉,无创血管夹夹闭之,缝合切口;45min后取出动物夹,恢复血供。治疗组造模同肠缺血再灌注组,恢复血供前30min经胃管灌入精黄片600mg/kg混悬液,。生理盐水组造模同肠缺血再灌注组,于恢复血供前30min经胃管灌入等量的生理盐水。假手术组除不夹闭肠系膜上动脉外,其余手术过程均同肠缺血-再灌注组。以病理学改变及125Ⅰ标记牛血清白蛋白肺摄取指数作为评价肺损伤的指标,分别测定各组动物不同时间肺组织TNF含量及血清、肺及小肠组织PLA2活性。主要观察指标:观察125Ⅰ标记牛血清白蛋白肺摄取指数,血浆、肺组织肿瘤坏死因子含量,血清、肺及小肠组织磷脂酶A2活性。结果:①肺组织病理形态学变化:假手术组未见明显异常;肠缺血再灌注组6h后肺间质出现水肿,并有中性粒细胞浸润,可见肺泡水肿,有少量出血及纤维蛋白渗出。治疗组仅见轻度肺间质水肿及少量中性粒细胞。②肺组织超微病理变化:假手术组未见明显变化。肠缺血再灌注组6h后,可见肺毛细血管内皮细胞肿胀,中性粒细胞向肺间质及肺泡腔渗出。治疗组无上述变化。③肺组织肿瘤坏死因子变化:假手术组和治疗组(再灌注组30min)明显低于肠缺血再灌注组(再灌注30min)(0.235±0.114,1.374±0.550,16.315±4.587,P<0.01)。④125Ⅰ-BSA肺摄取指数:治疗组明显低于肠缺血-再灌注组和生理盐水组(P<0.01),与假手术组差异无显著性(P>0.05)。结论:早期应用大黄有助于防治肠源性肺损伤的发生。进而发挥组织病程向多器官功能不全综合征发展的重要作用,这种作用可能是通过抑制TNF和PLA2等介质的释放实现的。     

Effects of hyperbaric oxygen on intestinal mucosa apoptosis caused by ischemia-reperfusion injury in rats

BACKGROUND:

Hyperbaric oxygen (HBO) is an effective adjuvant therapy for ischemia- reperfusion (I/R) injury of the brain, small intestine and testis in addition to crushing injury. Studies have shown that HBO increases the activity of villi of the ileum 30 minutes after I/R injury. The present study aimed to observe the effect of HBO on apoptosis of epithelial cells in the small intestine during different periods of I/R and to elucidate the potential mechanisms.

METHODS:

Rats were subjected to 60-minute ischemia by clamping the superior mesenteric artery and 60-minute reperfusion by removal of clamping. The rats were randomly divided into four groups: I/R group, HBO precondition or HBO treatment before ischemia (HBO-P), HBO treatment during ischemia period (HBO-I), and HBO treatment during reperfusion (HBO-R). After 60-minute reperfusion, samples of the small intestine were prepared to measure the level of ATP by using the colorimetric method and immunochemical expression of caspase-3. The levels of TNF-α in intestinal tissue were measured using the enzyme-linked immunosorbent assay method (Elisa).

RESULTS:

TNF-α levels were significantly lower in the HBO-I group than in the HBO-P (P<0.05), HBO-R and I/R groups; there was no significant difference between the HBO-R and I/R groups (P>0.05). The expression of caspas-3 was significantly lower in the HBO-I group than in the HBO-P group (P<0.05); it was also significantly lower in the HBO-P group than in the I/R and HBO-R groups (P<0.05). ATP level was significantly lower in the HBO-I group than in the HBO-P group (P<0.05), and also it was significantly lower in the HBO-P group than in the I/R and HBO-R groups (P<0.05).

CONCLUSIONS:

There is an association between HBO, small intestinal I/R injury, and mucosa apoptosis. HBO maintains ATP and aerobic metabolism, inhibites TNF-α production, and thus prevents intestinal mucosa from apoptosis. Best results can be obtained when HBO is administered to patients in the period of ischemia, and no side effects are produced when HBO is given during the period of reperfusion.KEY WORDS: Hyperbaric oxygen, Ischemia-reperfusion injury, Apoptosis