高糖对小鼠足细胞TRPC6表达的影响

【摘要】 目的 研究高糖对小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（TRPC6）表达的影响。方法 体外培养条件永生化小鼠足细胞,分为高渗对照组(甘露醇30mmol/L+葡萄糖5mmol/L),正常对照组(葡萄糖5mmol/L)、实验组(葡萄糖浓度分别为15mmol/L、25mmol/L和35mmol/L);高糖(葡萄糖25mmol/L)刺激足细胞,以刺激后0、12、24、48 h为时间观察点,光镜下观察足细胞形态变化,免疫细胞化学检测小鼠足细胞TRPC6表达及分布,RT PCR和Western Blot分别检测小鼠足细胞TRPC6 mRNA和蛋白的表达。结果 随着葡萄糖浓度的增加,光镜下足细胞胞体明显缩小,足突明显减少或消失,免疫细胞化学检测可见TRPC6主要表达于足细胞胞膜,沿足突分布明显增多,RT PCR和WB检测到TRPC6表达逐渐增加,以25mmol/L变化最明显。糖刺激足细胞后,与0h相比,随着刺激时间的延长,足细胞TRPC6蛋白和mRNA表达量明显增加（P＜005）,在48h达到高峰,呈一定的时间依赖性。结论 高糖可导致足细胞形态学明显改变,引起细胞损伤,随着葡萄糖浓度增加和时间延长,均可导致足细胞TRPC6表达增加,呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。     

心脏特异表达肾素(原)受体转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达(p)RR的转基因小鼠,研究(p)RR在心肌病发病过程中的调节作用.方法 将(p) RR基因插入到心脏特异表达启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,通过显微注射的方法建立(p)RR转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型:Western blot和免疫组化的方法检测(p)RR在心脏组织中的表达;利用小动物超声仪检测转基因小鼠的心脏结构和功能;双色免疫荧光共聚焦进行(p)RR蛋白在转基因小鼠中的亚细胞定位,Western blot方法检测了钙泵(ATP2A2)、钠-钙交换体1(NCX 1)以及肌钙蛋白T(cTnT)在转基因小鼠心脏组织中表达量的变化情况.结果 建立了心脏高表达(p)RR的转基因小鼠品系;内源性和转基因高表达的(p)RR蛋白均定位在细胞内高尔基体和内质网上;心脏特异高表达(p)RR蛋白使小鼠心脏收缩功能增强,主要表现在与同窝阴性对照小鼠相比,转基因小鼠收缩期左室内径( LVID,systolic)降低9％ (P＜0.05,n=18),收缩期容积( LVESV,systolic)减少了23％ (P ＜0.05,n=18),射血分数EF( ejection fraction)升高14％ (P＜0.01,n=18),短轴缩短率FS( fraction shortening)升高20％ (P ＜0.01,n=18);和心脏收缩功能和钙离子相关的ATP2A2和NCX 1表达均下调,而cTnT表达量上调.结论 在心脏中过表达(p)RR能够引起心脏收缩功能明显增强,同时直接或间接调节ATP2A2、NCX 1和cTnT表达.提示(p)RR可能是调节心脏中的钙离子而参与影响心肌功能.     

高糖对足细胞表达结缔组织生长因子及其受体蛋白的调节

目的:研究长期高糖对体外培养的足细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)及其受体--低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的影响以及可能涉及的信号途径.方法:以体外培养的小鼠肾小球足细胞为研究对象,应用Western印迹分析技术,检测高糖刺激不同时间对足细胞表达CTGF蛋白的影响.观察高糖对丝裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信号途径活化的影响以及MAPKS信号途径在高糖调节足细胞表达CTGF中的作用,同时检测高糖对足细胞CTGF的受体LRP蛋白的影响.结果:体外培养足细胞表达基础水平的CTGF蛋白,高糖刺激2天后足细胞表达CTGF水平开始升高,第4天达高峰,第6天下降,第8天降至对照组水平.正常糖和甘露醇组CTGF蛋白没有明显变化.高糖可以激活足细胞外信号调节激酶(ERK1/2),于刺激30 min时ERK1/2即开始活化,6 h达高峰,持续至24h,48 h接近基础水平.正常糖和甘露醇在各个时间点均不活化ERK1/2.应用ERK1/2活化特异抑制剂PD98059可以消减高糖刺激CTGF表达增加的效应.在各个时间点,长期高糖环境对足细胞CTGF的受体LRP蛋白没有明显作用.结论:短期(2～4 d)高糖通过活化ERK1/2信号通路刺激足细胞CTGF的表达,高糖继续培养(6～8 d)对足细胞内的CTGF蛋白表达水平没有影响.长期高糖环境对足细胞上CTGF的受体LRP蛋白的表达无影响.     

高糖对小鼠足细胞向间充质细胞 转分化的影响

目的 通过观察高糖环境下小鼠足细胞表达NEPH1、desmin、TGF-β1 和Smad7 的变化,探讨高糖损伤足细胞 的机制。方法 将培养成熟的小鼠足细胞用RandA 1.0 软件完全随机分为高糖1、2、3 组（葡萄糖浓度分别为15、25 和30mmol/L）和对照组（葡萄糖浓度5mmol/L）,倒置显微镜下观察高糖干预前后足细胞的形态变化,采用RT-PCR 和Western blot技术分别检测足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1 和Smad7 的mRNA 和蛋白表达变化。结果 与对照组相比,高糖环境下培养48h 后,足细胞形态发生不同程度变化。NEPH1 和Smad7 的mRNA 表达较对照组显著减少（P＜0.05 或0.01）,desmin 和TGF-β1的mRNA 表达较对照组增加（P＜0.05 或0.01）。其中高糖2 组的NEPH1 和Smad7 的蛋白表达较对照组显著减少（均P＜0.01）,而desmin 和TGF-β1的蛋白表达较对照组显著增加（P＜0.01）。小鼠足细胞在高糖培养下NEPH1 mRNA 和desmin mRNA 的表达呈显著负相关（r=-0.993,P＜0.01）;NEPH1 mRNA 和TGF-β1 mRNA 的表达呈显著负相关（r=-0.989,P＜0.01）;TGF-β1 mRNA 的表达和Smad7 mRNA 的表达呈显著负相关（r=-0.996,P＜0.01）。结论 高糖可能通过激活TGF-β/Smad信号通路诱导小鼠足细胞发生表型转化。     

黄芪甲苷对高糖所致小鼠足细胞凋亡及其相关基因表达的影响

目的 探讨黄芪甲苷（AS-Ⅳ）对高糖（HG）所致小鼠足细胞凋亡及相关基因表达的影响.方法 将条件性永生的小鼠足细胞分为正常葡萄糖（NG）组、HG组、甘露醇高渗对照组（MA）及HG＋不同剂量（10、50、100 μg/ml）AS-Ⅳ干预组,并采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测足细胞凋亡,同时采用荧光试剂盒和实时定量PCR法分别检测足细胞Caspase 3活性及足细胞凋亡基因Bax/Bcl-2mRNA表达.结果 HG组足细胞凋亡率和Caspase 3活性均较NG组增高（均P〈0.05）;各剂量AS-Ⅳ组的足细胞凋亡率和Caspase 3活性均较HG组下降（均P〈0.05）,且呈剂量依赖关系.HG组足细胞促凋亡基因Bax mRNA表达水平较NG组增高.而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA则较NG组下降（均P〈0.05）;各剂量AS-Ⅳ组的足细胞Bax mRNA水平均较HG组下降,而Bcl-2 mRNA水平则均较HG组增高（均P〈0.05）,且均呈剂量依赖性.结论 AS-Ⅳ可能通过调节足细胞Bax/Bcl-2 mRNA表达水平,从而抑制HG所致的足细胞凋亡.     

雷公藤内酯醇和缬沙坦对高糖诱导小鼠足细胞活性的影响

目的观察不同浓度高糖对小鼠足细胞活性的抑制作用,以及不同浓度雷公藤内酯醇（TP）和缬沙坦（Val）对高糖抑制后小鼠足细胞活性的影响,探讨高糖对足细胞的损伤作用,以及有效的药物干预浓度范围。方法将培养成熟的小鼠足细胞随机分为对照组（11.1mmol/L葡萄糖）和不同浓度高糖组（16.1、21.1、26.1、31.1、36.1mmol/L）,以上述浓度培养48h后采用CCK-8检测足细胞活性的变化。取活性变化最大的浓度为高糖诱导浓度,在此基础上随机分为不同浓度的TP组（4、8、16、32、64ng/ml）和Val组（2×10-8、2×10-7、2×10-6、2×10-5、2×10-4mol/L）,以上述浓度干预48h后,采用CCK-8检测足细胞活性的变化。结果（1）与对照组相比,除16.1mmol/L高糖组外,其余各高糖组的足细胞活性显著减少,其中以26.1mmol/L葡萄糖组减少最为明显（P＜0.01）。（2）与26.1mmol/L葡萄糖组相比,TP组（除4ng/ml组外）和Val组（除2×10-8mol/L组外）足细胞活性部分恢复,其中以16ng/mlTP组和2×10-5mol/LVal组足细胞活性恢复最为明显（P＜0.01）。结论一定浓度范围的TP和Val可部分恢复受高糖抑制的小鼠足细胞活性。     

miR-155在高糖诱导足细胞损伤的表达及其与足细胞损伤相关蛋白表达的相关性

目的 探讨高糖(HG)诱导足细胞损伤中miR-155的表达变化及miR-155与足细胞损伤相关蛋白表达的关系。方法 体外培养人肾小球足细胞(AB8/13),用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激AB8/13 48 h作为HG组,同时以终浓度为5 mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞48 h作为正常对照(NC)组。用CCK8法检测细胞增殖活性。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA和miR-155的表达。Western blot法检测nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin蛋白的表达。鬼笔环肽染色观察细胞骨架变化。细胞免疫荧光检测蛋白nephrin、synaptopodin。结果 HG可抑制足细胞增殖,降低细胞存活率(P<0.01)。HG作用的Ab8/13中的miR-155表达水平升高,nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA与蛋白表达水平降低(P<0.05)。HG会导致足细胞骨架紊乱。结论 H...     

高糖对小鼠足细胞黏附功能的影响及其机制研究

目的探讨高糖（HG）对体外培养的足细胞黏附功能的影响及其可能机制。方法将条件性永生的小鼠足细胞分为正常糖（NG）组、HG组及甘露醇高渗组,分别用荧光定量法和物理离心法检测足细胞黏附功能;同时应用实时定量PCR法及Western印迹法分别检测足细胞α3、β1整合素mRNA和蛋白表达水平。结果HG组足细胞与基底膜蛋白复合物间的黏附功能较NG组显著下降,且呈时间依赖关系（P〈0.05）;HG组足细胞α3、β1整合素mRNA及蛋白表达水平均较NG组明显下降,呈时间依赖关系（P〈0.05）。结论HG对体外培养的足细胞黏附功能具有明显抑制作用,可能与其下调α3、β1整合素表达水平有关。     

Losartan Protects Podocytes against High Glucose-induced Injury by Inhibiting B7-1 Expression

The role of B7-1 in podocyte injury has received increasing attention.The aim of this study was to investigate whether losartan protects podocytes of patients w...     

嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡与COX-2表达及凋亡机制初步探讨

目的研究嘌呤霉素氨基核苷（PA）诱导的足细胞凋亡及环氧合酶-2（COX-2）在足细胞中的表达情况,初步探讨足细胞凋亡的机制。方法条件永生性小鼠的足细胞,经诱导分化成熟后,采用PA诱导足细胞凋亡,分别在诱导后0、8、24和48h检测足细胞活性和凋亡水平,并检测足细胞凋亡过程中caspase-3的活性水平,同时运用Westernblot技术检测足细胞P53及COX-2的表达。结果随时间的延长,PA诱导的足细胞凋亡逐渐增多,在24h及48h较明显（P〈0.05）。各组细胞caspase-3水平无明显差异。24h及48hPA组P53表达较正常对照组明显增多（P〈0.05）。正常足细胞表达COX-2,用PA干预后,24h及48hCOX-2表达明显增加（P〈0.05）。结论PA诱导的足细胞凋亡呈时间依赖性,随时间的延长,足细胞凋亡逐渐增多;PA诱导的足细胞凋亡过程中COX-2、P53表达明显增多;足细胞凋亡过程与caspase-3无关。     

Ad-HBx的构建及在肾小球足细胞系的表达

目的 构建携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体,并感染小鼠肾小球足细胞株MPC5,使目的 基因HBx在该细胞株有效表达.方法 由质粒PCI-neo-HBx中扩增目的 基因HBx.插入至pShuttle-CMV(-)穿梭质粒中,而后再与pAdxsi质粒酶切连接为重组腺病毒质粒pAd-HBx,经酶切及测序鉴定正确后,以Pac Ⅰ酶切线性化转染293细胞进行包装扩增得到Ad-HBx.以Ad-HBx感染MPC5细胞,Western blot检测感染后目的 蛋白HBx的表达.结果 重组腺病毒载体经限制性内切酶酶切、电泳和基因测序鉴定,证实Ad-HBx构建成功;当MOI=50时.MPC5细胞即可100%被重组腺病毒感染,且持续至感染后72 h仍有较强水平的表达;感染Ad-HBx的MPC5细胞可稳定表达HBx蛋白.结论 成功构建了Ad-HBx,并能在MPC5细胞中稳定表达,为进一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用奠定了基础.     

黄芪多糖对小鼠肾小球足细胞Nephrin、Desmin表达的影响

目的:观察黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对阿霉素(adriacin doxorubicin,ADR)诱导的肾小球足细胞损伤中足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin及骨架蛋白Desmin表达的影响。方法:通过体外培养小鼠肾小球足细胞,以ADR诱导制作足细胞损伤模型,分为对照组、ADR损伤组(0.5 mg·L~(-1) ADR)、APS干预组(0.5 mg·L~(-1) ADR+0.8 g·L~(-1)APS)。MTT比色法检测3组细胞活力;免疫荧光染色观察3组Nephrin、Desmin表达;Western blot检测Nephrin、Desmin蛋白表达;RT-PCR检测Nephrin、Desmin mRNA水平。结果:APS干预组、对照组细胞活力[(87.25±11.14)%、(97.05±12.67)%]高于ADR损伤组[(58.62±7.93)%](P<0.05)。免疫荧光显示:APS干预组足细胞Nephrin表达少于对照组,但明显强于ADR损伤组(P<0.05);而足细胞Desmin少量表达,且明显少于ADR损伤组(P<0.05)。对照组、APS干预组足细胞Nephrin蛋白含量及Nephrin mRNA水平高于ADR损伤组(P<0.05),Desmin蛋白含量及Nephrin mRNA水平低于ADR损伤组,差异有统计学意义(P<0.05);而APS干预组与对照组足细胞Nephrin、Desmin蛋白及Nephrin、Desmin mRNA表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:黄芪多糖对ADR诱导的肾小球足细胞损伤具有保护作用,其机制可能与上调Nephrin表达、下调Desmin表达有关。     

雌激素受体在星形细胞瘤中的表达

目的探讨脑肿瘤中的激素受体(ER)的表达与肿瘤细胞增殖和临床病理的关系。方法应用免疫细胞化学方法,检测ER和细胞增殖核抗原(PCNA)在114例星形细胞瘤标本中的表达。结果星形细胞瘤ER阳性率为40%(45/114),PCNA阳性率为66%(75/114)。高度恶性星形细胞瘤(Ⅲ级)ER阳性率(43%)明显高于良性(Ⅰ级)的阳性率(34%)。星形细胞瘤中ER与PCNA,ER与肿瘤分级及PCNA与肿瘤分级之间有相关性。结论ER在神经胶质瘤中的表达随着肿瘤的恶性程度的增高而增加,PCNA的表达与恶性增殖呈正相关。     

乙肝病毒相关性膜性肾病足细胞Nephrin表达的改变

目的：观察乙型肝炎病毒相关性膜性肾病（hepatitis B virus associated membranous nephropathy，HBV—MN）肾小球足细胞Nephrin的表达，以探讨其发病意义。方法：经肾活检病理检查确诊的HBV—MN患者8例及原发性膜性肾病（IMN）患者5例，采用间接免疫荧光激光共聚焦显微镜观察足细胞Nephrin表达的变化。结果：HBV—MN组肾小球内Nephrin荧光强度较IMN组明显减弱，且部分节段有缺失。结论：肾小球足细胞裂孔膜蛋白Nephrin表达降低可能在HBV—MN发病中起一定的作用。     

替米沙坦对高血压大鼠肾脏保护作用和足细胞Podocalyxin表达的影响

目的:研究替米沙坦对醋酸去氧皮质酮(DOCA)高血压大鼠肾脏保护作用和足细胞Podocalyxin蛋白表达的影响。方法:18只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(A组)、高血压组(B组)和替米沙坦治疗组(C组)。单肾切除后皮下注射DOCA(5 mg/只,2次/周)和饮用盐水(1%Nacl+0.2%KCl)建立高血压模型。C组用替米沙坦[5mg/(kg.d)]灌胃。测定第4、8周尿蛋白。8周后处死动物,测血肌酐(SCr)、血钠、血钾,取肾组织PAS染色观察病理变化,免疫组化法检测肾脏podocalyxin表达变化。结果:B组4周始血压和尿蛋白较A组逐渐升高(P<0.05)。B组肾小球硬化指数和间质纤维化指数均明显高于A组(P<0.05),podocalyxin蛋白表达较A组降低。C组血压、尿蛋白和病理损伤较B组减轻,podocalyxin表达显著高于B组(P<0.05)。结论:替米沙坦通过上调足细胞podocalyxin表达,减轻DOCA高血压大鼠肾损伤。     

血管内皮细胞生长因子在足细胞内的分布及表达多种亚型的研究

目的：探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）在足细胞内的布及其所表达的VEGF亚型。方法：应用免疫荧光法观察VEGF在足细胞内的分布;逆转录PCR（RT－PCR）检测足细胞表达不同分子质量VEGF的mRNA和免疫蛋白印迹检测VEGF蛋白等。结果：VEGF在足细胞内以细胞核为中心向胞质呈放射状分布,体外培养的足细胞可以表达VEGF121、VEGF165和VEGF189,前两者表达较多,蛋白产物主要以VEGF165为主。结论：该研究首次发现足细胞在体外培养的条件下表达VEGF,并且在细胞内分布具有一定的规律性,为进一步研究VEGF在自身细胞和肾脏病中的作用提供了可靠的实验方法。     

Importance of Cellular Calcium Stores in Glucose-stimulated Insulin Release

The history and progress of organ transplantation in Uppsala are reviewed. Renal transplantation was begun in 1969, and the programme now comprises 50 to 60 transplants per year. Since 1976 the operation is performed at the department of urology. Close collaboration has been established with other departments in the hospital, especially with the medical nephrology unit. The indications for active management of uraemic patients have broadened, and maintaining resources on a par with the demands has constantly been a problem. This report concerns immunosuppressive therapy, transplantation results and research connected with the transplantation programme and deals briefly with the prospects for Uppsala as a transplantation centre in the future.     

重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1构建及在小鼠足细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1及稳定转染小鼠足细胞.方法:用RT-PCR法扩增小鼠肾脏caveolin-1的开放阅读框(ORF),构建TA克隆,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,酶切和测序鉴定.脂质体转染法转染小鼠足细胞,荧光显微镜下动态观察转...