粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

目的：构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒载体。 方法： 采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段, 使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒 FUGW中，经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，鉴定。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液 GM-CSF表达水平，电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合; GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染 FUGW-GM-CSF包装细胞上清液 GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。 结论： 成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体，为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。     

HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞的研制

目的：制备慢病毒载体为基础的野生型及突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK/HSV-sr39TK）基因工程T细胞（TK^＋T及sr39TK^＋T细胞）,观察给予前体药物丙氧鸟苷/无环鸟苷后小鼠T淋巴细胞对其敏感性及存活情况。方法：构建含HSV-TK/HSV-sr39TK及内部核糖体进入位点序列（IRES）和绿色荧光蛋白基因（GFP）的双顺反子慢病毒载体;采用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,收集病毒上清感染刀豆蛋白刺激的小鼠T淋巴细胞,给予不同浓度的前体药物GCV/ACV,用Cell Counting Kit（CCK-8）等方法检测T细胞的存活率。结果：转染293T细胞后,病毒滴度达10^6/U/ml以上;含不同启动子的病毒载体转染效率CMV〉PUB〉PGK,对小鼠T淋巴细胞的感染效率以CMV启动子最高;IC50值的测定显示sr39TK^＋T细胞对GCV和ACV的敏感性较TK^＋T细胞分别提高约2.5和17.4倍;ACV及GCV浓度在1～10μmol/Lsr39TK^＋T细胞活率下降最为明显,ACV组细胞存活率由（98.4±2.7）%下降为（49.9±5.9）%,GCV组由（97.9%±2.7）%下降为（33.7±5.3）%,P〈0.05,随ACV及GCV浓度的增加,细胞活率下降趋势有所减弱;TK^＋T细胞对GCV敏感,细胞活率由（97.9±2.7）%下降为（38.4±5.5）%,（P〈0.05）,对ACV不敏感,细胞活率由（98.4±2.7）%下降为（73.8±7.4）%,P〉0.05。结论：成功构建了HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞,不同启动子对慢病毒载体在293T细胞的转染效率、转导自杀基因在T淋巴细胞内的表达均有影响;HSV-sr39TK^＋T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK^＋T细胞。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

AFP启动子驱动的yCD/TK双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究

目的： 研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶/胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内外靶向性杀伤肝癌细胞的效果和机制。方法: 构建携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因表达质粒。通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721细胞,用MTT法测定不同浓度氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及联合治疗的杀伤作用,用流式细胞仪检测细胞周期。建立裸鼠肝癌皮下种植瘤模型,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果: 成功构建的携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞无表达,GCV、5-FC及两者联合可有效抑制HepG2细胞生长,随药物浓度的增高而杀伤作用增强,药物间抑瘤效果比较是GCV＋5-FC＞5-FC＞GCV,而SMMC7721细胞的生长未受影响。体内实验可见GCV、5-FC及两药联合对转染后的HepG2细胞种植瘤有明显的抑制效果,并检测到明显的细胞凋亡,而对SMMC7721细胞种植瘤的生长无影响,种植瘤内极少凋亡细胞。结论: 携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达**

背景：趋化因子受体7(chemokine receptor-7, CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。 目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。 方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7 DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒     ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。 结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7 DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293 FT细胞后,24 h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108 U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。 关键词：趋化因子受体7;未成熟树突状细胞;慢病毒载体;真核表达;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.029     

重组Ad-Cp-CDglyTK双自杀基因腺病毒载体构建及体外抑制鼻咽癌细胞的实验研究

目的：构建含EB病毒Cp启动子的CDglyTK双自杀基因靶向腺病毒载体 Ad-Cp-CDglyTK，探讨Cp启动子能否特异性调控自杀基因在转染鼻咽癌细胞中表达及靶向性治疗鼻咽癌的可行性。方法：采用pDC316穿梭质粒系统，高保真PCR扩增tk、 cd、 Cp等基因序列，采用定向克隆方法构建含Cp启动子的双自杀基因pDC316-CP-CDglyTK重组质粒，经DNA测序、酶切法鉴定所构建质粒，在293细胞中进行重组腺病毒Ad-Cp-CDglyTK包装、扩增、纯化与病毒滴度测定，体外转染鼻咽癌细胞株CNE1与正常鼻咽NP69细胞株，RT-PCR法检测转染细胞中CDglyTK基因的表达，MTT法观察Ad-Cp-CDglyTK/GCV+5-FC系统对CNE1细胞株的体外杀伤作用。结果： 经DNA测序、限制性酶切法分析显示pDC316-Cp-CDglyTK含完整正确的tk、cd、Cp基因序列，在293细胞中包装扩增后病毒滴度为5.6×1012 TCID50/L，体外转染鼻咽癌CNE1细胞株与正常鼻咽NP69细胞株后，采用RT-PCR法从CNE1细胞株总RNA中扩出Cp片段，而NP69细胞株未检测到相应基因mRNA表达，MTT结果显示经前体药物处理转染后CNE1细胞株与NP69细胞株，5-FC+GCV联合用药较单一前体药物对CNE1细胞具有更强的抑制作用（P＜0.05），联合用药对NP69细胞株未见明显杀伤作用。结论： Cp启动子可以特异性调控CDglyTK融合自杀基因在鼻咽癌细胞株(CNE1)中表达，融合自杀基因/前药系统较单一基因对鼻咽癌细胞具有更强的杀伤作用。     

EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定

目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞（hDCs）信号传导通路抑制因子1（SOCS1）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因（NM-0037）,筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（含U6启动子和EGFP）连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

不同启动子指导的HSV1-sr39TK/GCV系统对小鼠淋巴细胞的敏感性研究

目的观察慢病毒载体中不同启动子指导的突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-sr39TK)基因在小鼠T淋巴细胞内的表达差异,并进一步比较对丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)的敏感性。方法用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-sr39TK基因分别连接至慢病毒载体不同启动子后,然后在HSV1-sr39TK基因后以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)连接绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein,GFP)报告基因;采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A(concanavalin,ConA)激活的小鼠淋巴细胞,分别用流式细胞术、RT-PCR法鉴定HSV1-sr39TK和GFP基因在小鼠淋巴细胞的表达,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察感染不同病毒的淋巴细胞对前体药物GCV的敏感性。结果不同启动子指导的HSV1-sr39TK及GFP基因均可在小鼠淋巴细胞表达,巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子驱动表达能力最强,磷酸甘油激酶(phosphoglycerokinase,PGK)启动子最弱。感染含CMV启动子病毒的淋巴细胞对GCV的IC50值最小。结论在小鼠淋巴细胞内CMV启动子驱动的慢病毒载体HSV1-sr39TK基因表达最强,对前体药物GCV敏感性最高。     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.     

腺病毒介导的CD-TK融合基因联合GCV和/或5-Fc对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的：研究腺病毒介导的CD—TK融合基因联合前体药物对人膀胱癌细胞的杀伤作用。方法：利用含有CD—TK融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒转染人膀胱癌细胞株T-24细胞,GFP表达可作为转染是否成功的间接标志,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测转染后细胞CD及TK基因序列的表达情况。用丙氧鸟苷（GCV）和／或5氟胞嘧啶（5-FC）,作为前体药物,以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测其对转染后T-24细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果：腺病毒在体外能高效转染T-24细胞,72h转染效率可接近100％。GCV和／或5-FC均能有效杀伤转染后膀胱癌细胞,给予相同浓度前体药物时,联合用药组显示出较强的肿瘤杀伤作用。0．5mg／ml GCV、0．1mg／ml 5-Fc和GCV＋5-Fc作用于转染后T-24细胞72h细胞生存率分别为23．30％、20．63％、10．10％。旁观者效应杀伤实验表明5-Fc组较GCV旁观者效应明显,而联合用药组显示出更强的旁观者效应。利用Hoechst-PI双染色法检测经前体药物作用后转染细胞,各组均可见凋亡细胞,但联合用药组凋亡细胞较单一用药组多。结论：CD—TK融合基因联合应用GCV和／或5-Fc能有效杀伤膀胱肿瘤细胞,并存在较强的旁观者效应,其杀伤机制可能与凋亡相关,为适用于人膀胱癌的治疗提供一条新思路。     

慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默

目的: 利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因, 建立RelB基因低表达的骨髓致耐受DC, 为自身免疫病的防治提供新方法.方法: 设计小鼠RelB基因干扰的靶序列R5, 合成并克隆到慢病毒载体上, 与慢病毒的包装材料在293FT细胞中包装成病毒颗粒, 收集病毒上清, 测定病毒滴度, 然后包装慢病毒感染DC, RT-PCR和免疫荧光方法检测, 灰度扫描并用软件分析RelB基因的表达水平, 未成熟DC作对照组, 选择T6包装病毒为RNAi的阴性对照.结果: RT-PCR和免疫荧光方法发现R5病毒感染的DC RelB基因表达水平与未成熟DC基因表达水平接近, 低于成熟DC的表达水平(P<0.05), 而实验对照T6组病毒感染的DC其RelB基因表达水平高于未成熟DC(P<0.05)和R5病毒转染DC组(P<0.05).结论: 小鼠骨髓DC表达的RelB基因被慢病毒载体有效沉默, 有望成为DC免疫治疗的新载体.     

内部核糖体进入位点控制hytk基因和绿色荧光蛋白的表达

构建一种带有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和ｈｙｔｋｃＤＮＡ（潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因）的新型真核表达载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤听转染效率。利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点，将ｇｆｐ的ＣＤＮＡ与ｈｙｔｋ真核表达载体重组，构建获得含ｇｆｐ和ｈｙｔｋ基因的重组质粒；Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下分别转染ＣＯＳ－７细胞及人膀胱癌细胞株ＥＪ，并检测表达情况。结果示该载体在     

不同药物敏感基因对人胰腺癌细胞PC-2的杀伤作用

目的比较单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（ＨＳＶＴＫ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和胞嘧啶脱氨基酶（ＣＤ）／５氟胞嘧啶（５ＦＣ）两系统对人胰腺癌ＰＣ２细胞的杀伤作用。方法构建表达ＨＳＶＴＫ和ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体,将其直接导入胰腺癌细胞;噻唑蓝法检测转化细胞对前体药物的敏感度及５０％细胞受抑制时的药物浓度,即ＩＣ５０值,并对旁观者效应进行观察比较。结果ＨＳＶＴＫ基因转化细胞ＩＣ５０值为（１０６±０１２）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降５５８倍;ＣＤ基因转化细胞ＩＣ５０值为（３３００±０９５）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降２５８倍;混合细胞中含１０％的转化细胞时,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的生长抑制率为３９％,ＣＤ／５ＦＣ系统为５０３％。结论两系统对胰腺癌细胞ＰＣ２均有很好的杀伤和抑制细胞生长作用,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的治疗指数较高,但其旁观者效应弱于ＣＤ／５ＦＣ系统     

HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.结果载体HSV-TK导入了PA317细胞.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小约11.1%、30.6%和47.2%(均P＜0.001);RT-PCR检测HSV-TK基因在肿瘤组织中有表达;实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

Controlled cell killing by a recombinant nonsegmented negative-strand RNA virus

In most tissue culture cell lines tested, infection with the paramyxovirus simian virus 5 (SV5) results in very little cell death. To determine if SV5 could be used as a vector for controlled killing of tumor cells, a recombinant SV5 (rSV5-TK) was constructed to encode the herpes simplex virus thymidine kinase (TK) gene. MDBK cells infected with rSV5-TK showed a time-dependent loss of viability when infected cells were cultured in the presence of the prodrug acyclovir (ACV) or ganciclovir (GCV) while no significant toxicity was observed in the absence of prodrug. Cells infected with a control rSV5 expressing GFP and cultured with prodrug showed only a slight reduction in growth rate and little cell death. Time-lapse video microscopy of rSV5-TK-infected MDBK cells that were cultured in the presence of ACV showed an accumulation of cells with morphological effects characteristic of apoptotic cell death. An MDBK cell line persistently infected with rSV5-TK retained long-term expression of TK and sensitivity to prodrug-mediated cell killing that were comparable to those found in an acute infection. Titration experiments showed that the rSV5-TK plus GCV combination resulted in cell death for all mouse and human cell lines tested, although the kinetics and efficiency of cell death varied between cell types. Our results demonstrating controlled cell killing by a recombinant paramyxovirus support the use of negative-strand RNA viruses as therapeutic vectors for targeted killing of cancer cells.     

携带大鼠酪氨酸羟化酶基因慢病毒载体的构建及转染

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),观察TH基因的表达.方法:RT-PCR方法获得大鼠TH基因,将其克隆至慢病毒载体.通过瞬时转染法包装出病毒上清,鉴定滴度.感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转染效率,RT-PCR、免疫印迹法分别检测TH mRNA和蛋白的表达情况.结果:重组慢病毒载体质粒pNL-TH-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确,所获TH基因经测序后与GenBank报道序列完全一致;生产的病毒浓缩后滴度为4.1×10~7TU/ml;感染rMSCs结果显示荧光激发可见绿色荧光,TH-rMSCs、空载体-rMSCs组5d转染效率差异无统计学意义.RT-PCR、免疫印迹法显示TH基因成功在rMSCs中表达.结论:成功构建带有EGFP和大鼠TH基因的慢病毒载体,并获得TH-rMSCs基因工程细胞.