EBV潜伏膜蛋白LMP2A的研究进展

EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）与多种人类恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（na-sopharyngeal carcinoma,NPC）、何杰金氏病（Hodgkin＇s disease,HD）等的发生有关,肿瘤组织中EBV主要以潜伏感染的形式存在。在EBV潜伏感染细胞中,可表达的EBV基因有10多种,包括EBV核抗原（EB nuclear antigen,EBNA）1,2,3A,3B,3C和LP;潜伏膜蛋白（latent membrane protein,LMP）1,2A和2B;EBV编码的小RNA（EBER）1和2;以及BamHⅠ-A向右开放读码框（BARF0）的转录产物。NPC和其他EBV相关恶性肿瘤中可持续检测到LMP2A的转录物,提示LMP2A在体内病毒持续感染和EBV相关疾病中可能有重要作用。     

EB病毒潜伏膜蛋白2的研究回顾

Epstein Barr病毒 (EBV)属于疱疹病毒科γ亚科 ,在人类中广泛传播。大多数EBV的初次感染是在患者幼儿时期 ,而且没有明显的临床症状 ,终身携带病毒。EBV与越来越多的人类肿瘤相关 ,包括由于免疫抑制引起的免疫增生性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、NPC、HD和多种T细胞淋巴瘤等疾病。EBV潜伏感染时表达 8种蛋白 (6种核蛋白EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNALP和 2种膜蛋白LMP1和LMP2 )。在这些与转化相关的病毒蛋白中 ,EBNA1、LMP1、LMP2是在NPC肿瘤标本和EBV相关肿瘤中可以检测到的蛋白。1　LMP2的功能198…     

潜伏期膜蛋白1与疾病关系的研究进展

EB病毒(EBV)是一种普遍存在的致癌病毒,是高度相关的淋巴和上皮肿瘤的来源和发展,包括伯基特淋巴瘤和鼻咽癌(NPC)等,EBV基因几乎可以在所有细胞中。EBV感染通常与少数潜伏病毒功能的蛋白质表达,包括潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A等和巴尔核抗原1(EBNA1)。LMP1是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,被认为是EBV的主要致瘤蛋白。在EB病毒中通过2个C末端结构域编码基因蛋白LMP1信号来驱动细胞生长,存活和转化。LMP1蛋白目前是惟一已被证实的EB病毒的癌基因,LMP1的表达参与了肿瘤的发生与发展,是目前癌症方面研究的重点。     

鼻咽癌组织中DNA损伤与EB病毒感染的相关性研究

目的分析鼻咽癌(NPC)组织磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的表达水平和EB病毒(EBV)的感染情况,探寻二者的相关性。并用细胞实验进行验证,以阐明EBV诱导DNA损伤应答进而促进NPC发生发展的可能机制。方法选取NPC标本50例和鼻咽炎(NPI)20例,采用免疫组化法检测γ-H2AX及EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,对LMP1阴性标本采用原位杂交方法检测EB病毒编码的RNA(EBER);采用Western blot法检测EBV感染鼻咽癌细胞CNE1后γ-H2AX表达的变化。结果NPC组γ-H2AX的阳性率达94%,显著高于NPI组的40%;EBV阳性率为94%,显著高于NPI组的30%;97.9%EBV感染的NPC组织γ-H2AX阳性,二者表达有相关性(P0.05)。通过Western blot法检测进一步验证,EBV感染可使CNE1中γ-H2AX的表达量增高。结论γ-H2AX表达和EB病毒感染有密切关联性,EBV感染可能是通过诱导细胞DNA损伤,造成基因组不稳定从而促进NPC的发生发展。     

潜伏膜蛋白1基因异质性及上皮致瘤性的研究进展

潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)为EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)编码的膜蛋白,在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)和EBV相关胃癌(EBV associated gastric cancer, EBVaGC)等上皮恶性肿瘤中均有表达。作为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体家族的一员和CD40的组成性活性模拟物,LMP1参与了多种诱导上皮细胞形态和表型改变的信号通路,在啮齿动物成纤维细胞中显现出强大的致癌特性。此外,LMP1是EBV基因组中异质性最高的基因之一。研究LMP1的异质性与其致癌特性有助于发现EBV高危病毒株并为疾病的防治提供新途径。文章就LMP1的异质性及其在上皮恶性肿瘤中的作用两方面的研究进展展开综述。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因, 并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A, 转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株.方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中, 与两辅助病毒载体PHIT456、 PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T, 测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929, 经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆, 用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况.结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108 cfu/L, 感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A.结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础, 也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路.     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1有关信号传导通路的研究进展

EB病毒的致癌性与细胞源性基因和潜伏感染基因有关，其中潜伏膜蛋白（1atent membrane protein，LMP）家族LMP1、LMP2A、LMP2B可干扰信号传导通路并诱导B细胞转化。     

CD21非依赖性EB病毒对人胃印戒细胞癌细胞系的感染

目的　探讨CD2 1非依赖性EB病毒 (EBV)对人胃印戒细胞癌细胞系 (HSC 39)的感染作用。方法　用Akata和P3HR 1EBV毒株感染HSC 39,有限稀释法对感染细胞进行克隆。结果　两种EBV毒株感染细胞中均可检测到EBV编码的小RNA(EBER)的表达 ,两种EBV毒株感染的亲代细胞及大多数细胞克隆表达EBV核抗原 (EBNA1) ,但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白 (LMP1)和LMP2A。表现为潜伏Ⅰ型感染。未感染的HSC 39细胞及P3HR 1感染的细胞克隆CD2 1表达阴性 ,而AkataEBV感染的部分细胞克隆CD2 1mRNA阳性。结论　EBV可能通过不依赖CD2 1受体的途径感染HSC 39,印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。     

EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达

目的　寻找在真核细胞中表达Epstein Barr(EB)病毒潜伏膜蛋白 2 (Latentmembraneprotein 2 ,LMP2 )的有效途径 ,研究LMP2蛋白功能及深入探讨其在诱导细胞免疫应答中的作用。方法　将EB病毒LMP2蛋白的基因重组至逆转录病毒载体LXSN上 ,通过脂质体将重组质粒导入PT6 7细胞 ,G418筛选抗性克隆 ,收集含重组病毒的上清 ,将其感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3 ,测定病毒滴度 ,提取转染细胞DNA进行PCR鉴定 ,间接免疫荧光法检测外源基因在感染病毒的NIH 3T3中的表达。结果　培养上清的病毒滴度为 5 .8× 10 5 PFU ml,聚合酶链反应 (PCR)结果证实 ,转染细胞的DNA中含有目的基因的特异性片段。免疫荧光结果表明EBV LMP2基因在小鼠成纤维细胞中获得表达。结论　重组逆转录病毒成功地将EB病毒LMP2基因整合到细胞中并得以表达     

三种不同复染液在骨髓EBER原位杂交的应用比较

<正>EB病毒(EBV)不仅广泛存在于健康人群,更重要的是它被发现与越来越多的恶性肿瘤尤其是血液系统肿瘤关系密切~([1-3])。EBER是EBV潜伏感染的细胞内数量最多的病毒转录产物,表达于各型潜伏感染中(大多数细胞系中EBER1的含量是EBER2的10倍)原位杂交实验检测到EBER1是组织感染EBV的可靠指标。目前,EBER已经作为一种分子标志物,通过原位杂交检测组织切片中该标志物存在与否已经成为判读是否感染EBV的金标准。在该实验过程当中普遍采用苏木精进行复染,但在骨髓组织切片中由     

EB病毒潜伏膜蛋白1诱导细胞免疫的研究进展

Epstein-Barr Virus（EBV）是1964年Epstein等发现的。研究证实EB病毒与许多人类肿瘤相关。潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein1,LMP1）是EBV编码的潜伏感染过程中表达的病毒膜蛋白,是较早被确认的病毒癌基因之一。近期研究发现LMP1的氨基酸序列中存在诱导细胞免疫应答的多肽表位。可以诱导LMP1特异性细胞免疫反应。本文就LMP1在细胞免疫应答方面的研究做一介绍：     

EB病毒潜伏膜蛋白2 DNA疫苗的构建及其初步免疫效果观察

目的：以EB病毒潜伏膜蛋白2（latent membrane protein 2,LMP2)为靶基因,构建EBV－LMP2的侯选DNA疫苗,并初步探讨其在小鼠体内诱导特异性细胞毒方面的作用,为研制鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC)等EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗提供有益资料。方法：将EB病毒LMP2全cDNA片段克隆至含CMV早期启动子的真核表达载体pCDNAⅢ,构建CMV启动子EB病毒LMP2DNA疫苗,在体外将重组质粒转染COS细胞,以RT－PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒在转染的COS细胞中的转录和表达,采用50μg,100μg,200μg3种质粒剂量进行初步的小鼠后可诱发机体产生会对LMP2蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫,50μg,100μg,200μg 3种免疫剂量产生的抗体水平差异不大。在免疫接种6周后,重组质粒免疫的小鼠产生针对LMP2的特异性CTL均明显高于空载体免疫小鼠,3种剂量的CTL结果显示：在100μg,200μg免疫组,小鼠诱导产生的CTL水平要略高于50μg免疫组。结论：EB病毒重组质粒LMP2免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异的体液和细胞免疫应答,这些结果为研制鼻咽癌DNA疫苗提供有益的资料。     

广州地区EB病毒相关胃癌的临床病理特征及相关分子表达

目的 观察鼻咽癌高发区广州地区EB病毒相关胃癌的构成比、临床病理特征、EB病毒的潜伏类型,并初步探讨DNMT1、p16和cyclin D1在发病过程中的作用.方法 对676例胃癌采用组织芯片和EBER1原位杂交的方法筛选EB病毒相关胃癌,并用免疫组织化学EnVision法检测EB病毒潜伏期膜蛋白(LMP)和DNMT1、p16和cyclin D1的表达.结果 在676例胃癌中,45例EB病毒阳性(6.7%),EB病毒相关胃癌以男性为主,主要发生在胃的中上2/3,以弥漫型多见(P＜0.05).EBNA1和LMP2A的阳性例数分别为42例(93.3%)和24例(53.3%),EBNA2、LMP1和ZEBRA均未见表达.DNMT1、p16和cyclin D1在45例EB病毒相关胃癌的阳性例数分别为35例(77.8%)、10例(22.2%)和29例(64.4%),在40例EB病毒阴性胃癌的阳性例数分别为20例(50.0%)、25例(62.5%)和12例(30.0%),3个分子在两组胃癌的表达率差异均具有统计学意义(P＜0.05).p16与肿瘤的浸润深度有关(P＜0.05).LMP2A与DNMT1、DNMT1与p16、p16与cyclin D1存在相关关系(P＜0.05).结论 广州地区EB病毒相关胃癌占胃癌构成比的6.7%(45/676),EB病毒的潜伏类型部分为Ⅰ型,部分介于Ⅰ型和Ⅱ型之间.LMP2A、DNMT1、p16和cyclin D1的相互作用在EB病毒相关胃癌发生过程中起着重要的作用.     

EB病毒相关胃癌组织中病毒潜伏期基因表达的研究

Epstein Barrvirus(EBV)与多种人类恶性肿瘤如鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤和免疫功能缺陷病人的淋巴组织过度增生性疾病等密切相关 ,近年来研究表明约 2 %～ 16 %的胃癌组织EBV阳性。EBV具有潜伏感染的特点 ,通常认为EBV潜伏期基因如核抗原家族基因 (EBNAs)和潜伏膜蛋白基因 (LMP) 1与病毒的细胞转化功能有关。明确EBV在肿瘤组织中的存在状态和表达活动 ,是研究其致癌机理的基础。本研究首先应用PCR Southern杂交检测 12 6例胃癌和相应癌旁组织中EBVDNA ,进一步采用原位杂交检测PCR阳性标本石蜡包埋组织中EBV编码小RNA(EBER1…     

泛素-蛋白酶体途径与EBV潜伏蛋白

泛素-蛋白酶体途径是真核细胞内重要的蛋白质调控系统,参与调节细胞周期进程、细胞增生与分化,以及信号传导等多种细胞生理过程,因此,细胞内蛋白泛素化降解是蛋白质重要的转录后修饰方式。EBV编码多种病毒蛋白,通过泛素．蛋白酶体途径调节病毒的潜伏,使病毒能在免疫活性较高的宿主体中存活。LMP1和LMP2A可能作为泛素．蛋白酶体途径的底物而受其调控,EBNA1则充当蛋白酶体降解过程中的阻滞剂。对它们在该途径中不同作用的深入了解将促使我们发展治疗EBV相关癌症的新策略。     

EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒的制备及表达

目的 :构建EB病毒潜伏期膜蛋白 2A重组腺病毒 ,研究EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗。方法 :利用RT PCR扩增出EB病毒B95 8株潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)全部编码蛋白的基因 ,并克隆至pGEM T载体中。并将LMP2AcDNA插入E1、E3区替代的腺病毒载体pAX1CW ,选择正确的克隆pAX1CW LMP2A与Ad5DNA 末端肽复合体共转染 2 93细胞 ,通过同源重组获得复制缺陷型的重组腺病毒。提取重组腺病毒转染的 2 93细胞DNA ,通过酶切初步鉴定。选择阳性克隆感染CV1细胞 ,通过流式细胞仪和激光共聚集显微镜分析LMP2A蛋白表达情况。结果 :挑选同源重组 17个克隆中有 9个为阳性克隆 ,扩增到的病毒滴度为 2 3× 10 8pfu/ml。用MOI =10 0的重组腺病毒感染CV1细胞 ,48h后在激光共聚焦显微镜下可见LMP2A蛋白表达于CV1细胞膜上 ,经流式细胞仪检测LMP2A蛋白表达阳性细胞数为 94 4 %。结论 :重组腺病毒能有效地介导LMP2A基因的表达 ,为进一步研究该基因功能及其工程疫苗打下了基础。     

EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究

目的 探讨EB病毒（EBV）对胃癌细胞系的感染作用。方法 用Akata和P3HR－1 EBV毒株感染人胃癌印戒细胞系（HSC－39），有限稀释法对感染细胞进行克隆。结果 EBV感染细胞中可检测到EBV编码的核抗原（EBNA)，2种EBV毒株感染的细胞克隆表现有不同的形态学特征及生长方式。EBV感染的亲代细胞及大部分克隆表达EBNA1，但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白（LMP）1和LMP2A；亲代细胞及所有细胞克隆未观察到裂解感染，EBNA启动子Qp表达阳性，而启动子Cp和Wp未见表达。结论 HSC－39对2种EBV毒株均易感，EBV感染可改变HSC－39的细胞表型，且不同EBV毒株对其影响不同，提示印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。     

EB病毒与恶性淋巴瘤

EB病毒是一种人类疱疹病毒 ,其表达的潜伏膜蛋白LMP1是病毒癌蛋白 ,与B淋巴细胞的转化有关。EB病毒与何杰金淋巴瘤和T细胞淋巴瘤有关 ,而与非免疫缺陷性B细胞淋巴瘤的关系不明显。EB病毒能通过CD2 1感染B淋巴细胞 ,但EB病毒是如何进入T淋巴细胞 ,及其在恶性淋巴瘤发生发展中的作用仍不清楚。进一步揭示EB病毒在恶性淋巴瘤及其他相关肿瘤中的发生机制 ,有利于开发EB病毒的预防疫苗及采取有效的治疗措施。     

EBV-LMP2A和β-catenin蛋白在鼻咽癌中的表达关系及意义

目的 探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)和β-连环素(β-catenin)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达关系及其临床意义.方法 应用免疫组化SP法检测LMP2A和β-catenin蛋白在32例鼻咽黏膜慢性炎、56例NPC和18例NPC淋巴结转移灶中的表达,采用Westem blot法和免疫荧光细胞化学染色法观察LMP2A和β-catenin蛋白在CNE2-LMP2A细胞及其对照组CNE2-Vector和CNE2细胞中的表达.结果 (1)LMP2A在NPC及其淋巴结转移灶中的阳性率分别为89.3％ (50/56)和77.8％(14/18),均明显高于鼻咽黏膜慢性炎(37.5％,12/32)(P均＜0.01);β-catenin在NPC及其淋巴结转移灶中的异常表达率分别为62.5％ (35/56)和83.3％(15/18),均明显高于鼻咽黏膜慢性炎(3.1％,1/32)(P均＜0.01);LMP2A与β-catenin正常表达呈负相关(rs=-0.391,P ＜0.01);LMP2A和β-catenin蛋白在鼻咽癌T分期、N分期和临床分期组间表达率的差异均有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01).(2)CNE2-LMP2A细胞中β-catenin蛋白表达水平明显高于CNE2-Vector和CNE2细胞;CNE2-LMP2A细胞中β-catenin胞质和胞核的表达水平明显高于CNE2-Vector和CNE2(P均＜0.01).结论 LMP2A高表达和β-catenin异常表达与鼻咽癌临床生物学行为进展密切相关,其机制可能与LMP2A上调β-catenin蛋白水平并促进其核转位有关.     

免疫治疗EBV相关肿瘤的研究进展

Epstein-Barr病毒(EBV)属于疱疹病毒科γ亚科,具有噬B淋巴细胞的特性,能够在B淋巴细胞中建立起潜伏感染,刺激细胞的增生和转化。人群中有大于90%的感染率。虽然大部分EBV感染的个体一直处于无症状状态,EBV的感染却增加了发展成不同恶性肿瘤的危险,1997年世界卫生组织国际癌症研