重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的：在原核系统中表达并纯化人血管生成抑素（angiostatin),制备鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化,再用纯化的人血管生成抑素免疫小鼠并制备多抗。结果：通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表在并纯化成功,再利用纯化的人血管生成抑素制备成功鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。结论：表达产物及多克隆抗体为下阶段深入研究提供了重要的实验材料。     

血管生成抑素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:在原核系统中表达并纯化人血管生成抑素（angiostatin）,制备鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。方法:设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化,再用纯化的人血管生成抑素免疫小鼠并制备多抗。结果:通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化成功,再利用纯化的人血管生成抑素制备成功鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。结论:表达产物及多克隆抗体为下阶段深入研究提供了重要的实验材料。     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N¹乙酰基转移酶（SSAT）的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备。方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化。用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测。结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆菌中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高。结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体。     

抗人整合素β3亚基单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中表达

目的:构建抗人整合素β3亚基单链抗体(ScFv)基因,在大肠杆菌中表达并获得具有活性的ScFv。方法:从分泌抗人整合素β3亚基单抗(mAb)的杂交瘤细胞4F12中提取总RNA,RTPCR扩增VH和VL基因,通过PCR在VH和VL基因间插入柔性连接子(Gly4Ser)3,并将其克隆至原核表达载体pQE中,获得含β3抗体基因的高效表达载体pQEβ3ScFv。将重组子转化大肠杆菌M15后诱导表达,并对表达产物进行纯化和凝胶柱上在位复性。结果:获得抗β3单抗的VH和VL基因,构建了pQEβ3ScFv,并在大肠杆菌中获得了表达,表达蛋白相对分子质量约为26×103,以包涵体形式存在,纯化和复性后,ELISA证实其具有良好的抗原结合活性。结论:成功构建、表达了抗人整合素β3亚基的ScFv基因,并获得了有活性的ScFv。     

血管发生抑制因子 restin的克隆表达及其抗血管活性的初步研究

目的：克隆人血管发生抑制因子restin(hRs)，在E.coli中融合表达，并测定其抗血管活性。方法：用RT-PCR法从中国人胎盘组织中扩增hRs基因，重组人pGEM-T载体中并测定鉴定，构建原核表达载体pGEX-hRS，表达融合蛋白GST-hRS。融合蛋白经亲和纯化及凝血酶切后，采用鸡胚绒毛膜尿囊膜试验检测其抗血管生成活性。结果：RT-PCR产物为564bp，测序结果与Genbank中胶原XV(COL15A1)的C端序列一致，但在21位（TCT→TCG）引起丝氨酸的同义突变，82位（ACA→TCA）引起丝氨酸突变为苏氨酸。诱导表达的人GST-hRS融合蛋白经凝血酶切后，分子量为20kD，具有抗血管生成活性。结论：hRS的成功克隆、表达为抗血管生成治疗实体瘤的研究奠定了实验基础 。     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N1乙酰基转移酶(SSAT)的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备.方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆茵细胞.SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化.用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测.结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆茵中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高.结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体.     

人血管抑素克隆表达及抑制血管生成的研究

目的　研究并获得重组人血管抑素 (angiostatin) ,探讨其临床应用价值。方法　采用逆转录 -聚合酶链式反应 (RT PCR )方法 ,从人胚胎肝细胞中扩增出人全长血管抑素cDNA片段。用原核细胞表达载体构建 pBV 2 2 0 /angiostatin重组质粒 ,并将其转化大肠杆菌DH 5α进行表达 ,初步纯化。应用鸡胚尿囊膜血管生成实验及脐静脉内皮细胞增殖实验检测其活性。结果　经SDS PAGE分析 ,表达产物相对分子量约 3 8kD ,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的 3 0 %。活性实验显示 ,重组蛋白能够抑制血管形成。结论　重组人Angiostatin在大肠杆菌中实现高效表达 ,并具有很好的生物学活性     

罗勒多糖对肿瘤转移行为的影响

目的:研究腺病毒介导的鼠内皮抑素基因对胃癌的治疗作用.方法:利用病毒重组技术将内皮抑素克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中,观察体外转染表达后的生物学活性.通过建立荷人胃癌的裸鼠动物模型,分析基因转导后动物肿瘤细胞中内皮抑素的表达情况及对肿瘤的抑制作用.结果:构建了表达内皮抑素的重组腺病毒载体pCA13-mEndo;检测到内皮抑素在体外的mRNA水平和蛋白质水平均有表达;鸡胚绒毛尿囊膜实验表明其对血管生长起抑制作用;荷瘤裸鼠体内肿瘤生长抑制明显.结论:所构建的pCA13-mEndo重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的内皮抑素,使得肿瘤内微血管生成减少,肿瘤细胞增殖减慢,为抗血管生成方法治疗实体瘤的临床应用奠定基础.     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备

目的克隆表达重组人生存素,制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法用RT-PCR方法从培养的人白血病细胞株HL-60中克隆人生存素cDNA,克隆到原核表达载体pET32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,目的蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价,Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性。结果所克隆生存素cDNA序列与Genbank中序列完全一致,将其读码框插入原核表达载体pET32a(+)诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白,表达量占总菌体的30%,纯化后融合蛋白的纯度为95%,所制备的鼠抗血清的效价达1:1600,Western blotting证实其有较好的特异性,可以检测肿瘤细胞生存素的表达。结论我们已克隆并表达了人生存素基因,所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测。     

人CIDE-3蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-3(CIDE-3)蛋白兔抗人多克隆抗体并进行鉴定。方法:将原核表达载体pET28a( )/CIDE-3转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达CIDE-3蛋白,经Ni-NTA Agarose纯化后免疫新西兰白兔,获得人CIDE-3蛋白兔抗血清,并通过免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫组织化学法对抗体进行鉴定。结果:成功地表达、纯化了人CIDE-3蛋白,与弗氏佐剂乳化后,免疫新西兰白兔,获得高效价的人CIDE-3蛋白兔抗血清,ELISA结果证实该抗体具有较高的亲和性,Western blot及免疫组织化学染色显示证实该抗体能够与人CIDE-3蛋白特异性结合,是一种细胞质蛋白。结论:获得了效价高、特异性较强的人CIDE-3蛋白兔抗血清,为进一步研究人CIDE-3奠定了实验基础。     

人吲哚胺2,3-双加氧酶多克隆抗体的制备

背景与目的:吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是一种哺乳动物细胞质中的血红素蛋白,是催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢的限速酶.它的表达不仅能抑制病原微生物的生长,还能抑制T细胞的应答,从而介导肿瘤免疫耐受.本研究的目的是表达和纯化His-hIDO融合蛋白,制备兔抗人IDO多克隆抗体,并用此抗体检测IDO在肿瘤细胞中的表达.方法:将编码人IDO全长cDNA克隆入pET30a( ),测序鉴定表达载体pET30a( )-hIDO,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达目的蛋白His-hIDO;用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人IDO多克隆抗体;用Western blot检测该多克隆抗体与重组蛋白His-hIDO的反应性,并用该抗体分析表皮癌细胞A431和肝癌细胞HepG2经IFN-γ诱导前后的IDO表达情况.结果:His-hIDO融合蛋白可与抗His多克隆抗体特异性结合;兔抗人IDO多克隆抗体的效价高,特异性好,能检测肿瘤细胞经IFN-γ诱导后的IDO的表达.结论:兔抗人IDO多克隆抗体能够有效地识别体外表达的IDO蛋白,为研究IDO在肿瘤免疫耐受中的作用提供有力工具.     

抗hnRNPA2/B1多克隆抗体制备及其在非小细胞肺癌中的应用

ObjectiveIn order to evaluate potential application for diagnosis and prognosis of non-small celt lung cancer (NSCLC),as well as to determine its role in the pathogenesis of the disease,we prepared anti-human hnRNP A2/B1 polyclonal antibody.MethodsProkaryotic expression vector of pET28a ( )-hnRNP A2/B1 was constructed and transformed into E.coli BL21.The recombinant protein induced by IPTG was purified and injected to rabbits for antibody preparation.Expression of hnRNP A2/B 1 was examined in 45 tissues of NSCLC and 16 inflammatory pseudotumor tissues of lung by immunohistochemistry with the antibody.The commercial hnRNPA2/B1 monoclonal antibody was used as a control.Results(t) Polyclonal antibody against hnRNP A2/B1 with high title was obtained.(2) The positive staining in NSCLC tissues was 62.22%,which was substantially higher than that in normal tissues (40%,P＝0.035) or inflammatory pseudotumor tissues (31.25%,P＝0.033).(3) Expression of hnRNP A2/B1 positively correlated with age and the history of smoking,whereas it negatively correlated with differentiation staging of tumors.(4) Follow-up study showed that the survival time of patients with positive staining was significantly shorter than that of patients without hnRNP A2/B1 expression (P＝0.048).ConclusionIt is successful to make the recombinant protein and prepare the polyclonal antibody agonist human hnRNP A2/B1.It may be a valuable marker for the diagnosis and prognosis of NSCLC.Our results provide a basis for further study in clinical application.     

宫颈癌细胞中NRDR选择性剪接新亚型表达质粒的构建及原核表达

背景与目的:构建宫颈癌细胞中视黄醇脱氢/还原酶-辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)及其选择性剪接亚型NRDRB1原核表达载体,并在BL21-AI大肠杆菌中表达融合蛋白. 材料与方法:用RT-PCR检测宫颈癌组织中NRDR、NRDRB1表达,RACE方法克隆NRDRB1全长cDNA,运用Gateway表达系统将NRDR、NRDRB1编码区序列构建到表达载体,转化到大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白通过金属离子亲和层析纯化. 结果:在宫颈鳞癌组织中发现NRDR新的选择性剪接亚型NRDRB1,构建了NRDR、NRDRB1原核表达载体,在BL21-AI中表达出氨基端含6×His标签的重组蛋白,诱导表达4 h后目的蛋白可占总蛋白量的30%～50%,经一步亲和层析得到了高纯度的NRDR及NRDRB1重组蛋白. 结论:在大肠杆菌中获得高效表达的NRDR、NRDRB1蛋白,为进一步研究其功能提供了实验材料.     

人黑素瘤单链抗体-量子点纳米探针的制备及其与黑素瘤细胞特异性结合

目的：制备抗人黑素瘤细胞单链抗体与碲化镉量子点(CdTe guantun dot, CdTe)连接的纳米探针,观察其对恶性黑素瘤细胞的特异性结合效果。方法：将抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体（antihuman melanoma ganglioside single chain variable fragment antibody,GD/ScFvMEL）基因克隆到pET32a（+）载体中,然后在BL21（DE3）细菌中进行诱导表达,采用变性法纯化表达的蛋白,再用改良的透析法复性目的蛋白,SDSPAGE分析表达的GD/ScFvMEL抗体蛋白。制备的GD/ScFvMEL抗体与量子点连接制备成纳米探针GD/ScFvMELQDs,然后与黑素瘤A375细胞株及胃癌MGC803细胞株孵育,观察纳米探针与肿瘤细胞结合的特异性。结果：PCR、双酶切和序列测定证实重组子的拼接完全正确,SDSPADE结果显示,GD/ScFvMEL抗体的表达量达40%。纯化复性后的GD/ScFvMEL抗体连接量子点制备GD/ScFvMELQDs纳米探针,经扫描电镜、X衍射分析、荧光光谱和SDSPAGE分析证实纳米探针的成功制备。GD/ScFvMELQDs纳米探针能特异性结合A375黑素瘤细胞,不与胃癌细胞MGC803细胞结合。结论：成功制备抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体量子点纳米探针,该探针可特异性结合黑素瘤细胞。     

小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体的制备及应用简

目的：表达和纯化小鼠成纤维细胞激活蛋白α（FAPα）二肽基肽酶催化核心序列（FAPαc）融合蛋白（His-FAPαc）,制备兔抗小鼠FAPα多克隆抗体,并用此抗体检测FAPα在肿瘤细胞和成纤维细胞以及肿瘤间质中的表达情况。方法：将本实验室构建好的原核表达质粒pET28a（＋）-FAPαc转化大肠杆菌BL21,IPTG 诱导表达目的蛋白His-FAPαc;用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗小鼠FAPα多克隆抗体;用免疫印迹法和酶联免疫吸附试验检测该多克隆抗体与重组蛋白His-FAPαc 的反应性及检测该多克隆抗体的效价,并用该抗体检测FAPα在肿瘤细胞和成纤维细胞以及肿瘤间质中的表达情况。结果：His-FAPαc融合蛋白可与兔抗小鼠FAPα多克隆抗体特异性结合;该多克隆抗体的效价高,特异性好,并且能检测小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast cells,MEF）及结肠癌和乳腺癌的间质细胞高表达FAPα的全长序列蛋白。结论：制备的兔抗小鼠FAPα多克隆抗体能够有效地识别小鼠胚胎成纤维细胞和肿瘤间质细胞表达的FAPα蛋白,为研究FAPα在肿瘤的发生、发展及转移中的作用和以FAPα为靶点而开展的的抗肿瘤研究奠定基础。     

GST-P12融合蛋白的抗体制备、鉴定及免疫组化分析

目的：为了进一步研究p12DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控机制,将已表达纯化好的GST-p12融合蛋白进行多克隆抗体的制备及鉴定.方法：将构建好的融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1转化BL21（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,得到GST-p12融合蛋白,经亲和层析柱纯化后电泳,再割胶研磨作为抗原直接免疫家兔,经Western blot及ELISA检测抗体效价及特异性并做免疫组化分析.结果：得到较高纯度的GST-p12融合蛋白,获得了兔来源的抗p12DOC-1血清,经蛋白免疫印迹杂交反应及免疫组化分析证实所得的抗体具有较高的特异性和效价.结论：成功制备了兔抗人的p12DOC-1抗血清,为进一步研究p12DOC-1在口腔癌中发生缺失的机理打下基础.     

Functional identification of a non-fusion TRAIL extracellular protein and preparation of its polyclonal antibody

Human tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) can selectively induce apoptosis in a variety of transformed cells and is currently being developed as a cancer therapeutic drug. Here we expressed the TRAIL protein including extracellular (114-281aa) without any tag protein named TRAIL-NT, and prepared anti-TRAIL polyclonal antibodies (Poly-Ab). The human TRAIL extracellular gene was amplified from PBMC and cloned into pGEM-T-Easy vector for sequence analysis. The expression vector pET-28a/TRAIL was constructed using the DNA recombinant method, and the recombinant protein without any tag protein was expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The TRAIL-NT protein was purified by cation ion-exchange column and identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. The proliferation inhibition activity of TRAIL-NT was detected by the MTT method, Wright-Giemsa staining assay, and FACS. The polyclonal antibody of TRAIL-NT was obtained after the BALB/C mice were immunized with purificated TRAIL-NT protein. Results showed that the target protein expressed in E. coli BL21(DE3) has the same molecular weight as that expected and could be recognized by anti-TRIAL Poly-Ab. The TRAIL-NT protein could also inhibit proliferation and induced apoptosis of Jurkat cells but no cytotoxicity to human liver cells and PBMC was observed. This preliminary research laid a solid foundation for further research on its biological activity and application in anti-tumor therapy.