MTT法检测黄芪和丹参对人乳腺干细胞体外增殖的影响

目的:文献报道黄芪和丹参均可诱导间质干细胞向神经细胞分化.实验以乳腺癌患者乳腺再生为最终目的,通过MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响.方法:实验于2006-09/2007-09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成.①对象:女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科,共24例,患者年龄29～45岁,对治疗及实验均签署知情同意书.②实验方法:取切除的正常乳腺组织,去除血管及脂肪,剪碎至1.0 mm3块,组织块消化培养传代后应用免疫磁珠分离收集MUC-、ESA 标记的细胞,即乳腺成体干细胞,按1×108 L-1密度接种于96孔培养板,无血清培养48h后更换培养基,设立4组:空白对照组不加任何药物;黄芪注射液组分为25,50,100,200 mL/L 4个亚剂量;丹参注射液组分为12.5,25,50,100 mL/L 4个亚剂量;黄芪 丹参复合注射液组分为(25 12.5),(50 25),(100 50),(200 100)mL/L 4个亚剂量.③实验评估:各组加入对应药物后培养72 h,加入5 g/L MTT溶液20 μL,再加入二甲基亚砜振荡溶解,在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值,分析乳腺干细胞的增殖情况.结果:①乳腺细胞形态观察:乳腺组织原代培养后形成腺上皮细胞和肌上皮细胞.②乳腺干细胞增殖检测:黄芪注射液以 50 mL/L为界,剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强(P < 0.01),达200 mL/L时产生抑制作用(P < 0.05).丹参注射液剂量在12.5～100 mL/L范围内变动时,均能够促进乳腺成体干细胞的增殖(P > 0.05).黄芪与丹参复合注射液以(100 50)mL/L为界,复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强(P < 0.01),且复合用药效果好于单独用药,当剂量达到(200 100)mL/L时产生抑制作用(P < 0.05).结论:丹参和小剂量黄芪均可提高体外分离培养的乳腺干细胞增殖能力,且两药低剂量联合使用促增殖作用更为明显.     

不同剂量黄芪合丹参注射液对脑梗死恢复期患者胰岛素抵抗的影响

目的：观察不同剂量补气升阳中药黄芪和活血化瘀中药丹参合用对脑梗死恢复期患者胰岛素抵抗的影响，探讨采用益气活血法防治胰岛素抵抗的量效关系。方法：收集2002—05／2004-12在广西中医学院第一附属医院住院的脑梗死恢复期患者99例，按随机数字表分为黄芪100，50ml．组和对照组各33例。3组于入院后均按西医治疗原则，予控制血压，对症、康复等治疗，在此基础上，黄芪100，50ml．组分别予黄芪注射液100，50mL配合丹参注射液20mL＋50g／L葡萄糖注射液250mL静脉滴注，1次/d，3组疗程均为20d。于治疗前后采取清晨窄腹静脉血检测胰岛素、血糖、总胆固醇、二酰甘油以及血液流变学等，胰岛素抵抗用胰岛素敏感指数反映，应用神经功能缺损评分减分率评定临床疗效（减少91％～100％为痊愈；减少46％-90％为显著进步；减少18％-45％为进步；减少17％左右为无变化）。结果：按实际处理分析，进入结果分析97例。④胰岛素敏感指数：3组治疗后较治疗前均有改善，但黄芪100，50mL组优于对照组（-1．38&;#177;0．19，-1．76&;#177;0．25．-1．87&;#177;0．20，P〈0．01，0．05），日黄芪100mL组优于50mL组（P〈0．05）。②黄芪100mL组总胆固醇、胰岛素、血糖和血液流变学各项指标均较治疗前好转（P〈0．05，0．01），黄芪50mL组血糖和红细胞压积、全血黏度和血浆比黏度均较治疗前好转（P〈0．05，0．01），对照组除红细胞压积降低外，其余均无变化。黄芪100mL组治疗后总胆固醇和血液流变学各项指标均优于50mL组（P〈0．01）。⑧临床疗效：3组总有效率无差异，但黄芪100，50mL组基本痊愈＋显著进步例数多于对照组。结论：高剂量和低剂量黄芪合丹参注射液均有显著降低脑梗死恢复期患者胰岛素抵抗、改善异常升高的血脂、血黏度，并有提高临床疗效的作用，以高剂量黄芪为优。提示脑梗死恢复期患者胰岛素抵抗与气虚程度关系更加密切。     

黄芪和三七对下肢缺血患者骨髓间充质干细胞体外分化的影响

背景：目前临床观察已经证实中药黄芪、三七能够改善下肢缺血症状，假设这种治疗作用与其促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化有关。目的：验证黄芪、三七是否能够有效促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化。设计、时间及地点：骨髓间充质干细胞的体外分化实验，于2005—04／06在北京中医药大学附属东直门医院教育部重点实验室完成。材料：抽取北京中医药大学东商门医院收治的下肢血管缺血性病变患者23例骨髓血，密度梯度法分离骨髓单个核细胞，即骨髓间充质干细胞。相当于生药材2g／mL的黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂产品，主要成分为三七总皂苷的血塞通粉针剂黑龙江珍宝岛制药有限公司产品，CD34抗体为美国BD公司产品，FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。方法：将骨髓间充质干细胞与3mL低、中、高剂量含生药4，12，36g/L的黄芪注射液，3mL低、中、高剂量含三七总皂苷50，100，200mg／L血塞通混悬液进行共培养，并设未加入药物的单纯培养干细胞为空白对照组；隔日换液一次，连续培养3周。主要观察指标：培养3周后，倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测CD34^＋细胞百分比。结果：①骨髓间充质干细胞培养3周后贴壁细胞大部分呈梭形，束状排列，具有内皮细胞形态和特性。②与空白对照组比较，黄芪低、中剂量组和三七中、高剂量组CD34^＋细胞百分比显著增加（P〈0．05～0．01）。结论：黄芪、三七有促进骨髓间充质干细胞增殖并向血管内皮细胞分化的作用，此作用呈剂量依赖性。     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的：比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况，探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法：2005-03／09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组：实验分为空白对照组；胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素ld组，后者又分为10μg/L＋100ng/L,10μg/L＋200ng/L,20μg/L＋100ng/L,20μg/L＋200ng/L,1000μg/L＋100ng/L组。②细胞模型制作：用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5&;#215;10^8L^-1接种，悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组：血清终浓度为体积分数为0．1的胎牛血清。细胞接种48h后，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α各组分别加人相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果：①加人胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d，部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α 10μg/L＋100ng／L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L＋200ng／L，20μg/L＋100ng／L，20μg/L＋200ng／L，1000μg/L＋100ng／L组及空白对照组[依次为：（11.70&;#177;0.55）％，（3.62&;#177;0．78）％，（4．14&;#177;0．41）％，（3.3&;#177;0．63）％，（4．92&;#177;0．34）％，（1．61&;#177;0．68）％，P〈0．05或0.01].结论：骨髓基质细胞在体外培养条件下，经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用，配合使用高浓度（体积分数为0．1）血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元；10μg/L＋100ng／L为最佳诱导分化质量浓度。     

龙虾壳聚糖干预后糖尿病小鼠血糖和糖耐量的变化

目的：观察龙虾壳聚糖对四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降血糖作用。方法：实验于2005-04／12在江苏大学医学技术学院生化研究室和江苏大学医学部实验动物中心完成。实验动物选用45d的健康雄性ICR清洁级小鼠100只。①龙虾壳聚糖对正常小鼠空腹血糖的影响：取正常小鼠20只，禁食3h后测定空腹血糖，按血糖水平的高低随机抽签法分成龙虾壳聚糖组和正常对照组，每组10只。龙虾壳聚糖用10g/L醋酸配制，龙虾壳聚糖组小鼠按剂量200mg／（kg&;#183;d）连续灌胃；正常对照组以10g/／L醋酸20mL／kg灌胃，连续30d。30d后禁食3h测定其空腹血糖值。②制备糖尿病模型：取正常小鼠80只，用四氧嘧啶生理盐水溶液尾静脉注射制备糖尿病小鼠模型，剂量100mg／kg，容积10mL／kg，6d后测定禁食3h后各小鼠的空腹血糖，以血糖值≥25mmol／L者确定为高血糖模型成功动物。③龙虾壳聚糖对尿病小鼠空腹血糖的影响：取高血糖模型成功大鼠40只，随机分成龙虾壳聚糖50，100和200mg／kg 3个剂量组和高血糖模型对照组，每组10只。模型对照组给予10g／L醋酸灌胃，剂量20mL／kg，连续30d；龙虾壳聚糖50。100和200mg／ks剂量组分别给予龙虾壳聚糖50，100和200mg／（kg&;#183;d）（用10g/L醋酸配制），连续30d。第31天禁食3h后测定各组小鼠的空腹血糖值，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。血糖下降百分率=[（实验前血糖值-实验后血糖值）／实验前血糖值]&;#215;100％。②龙虾壳聚糖对糖尿病小鼠糖耐量的影响：在各组小鼠测定空腹血糖值后，龙虾壳聚糖50，100和200mg／kg剂量组分别继续给予龙虾壳聚糖50，100和200mg／（kg&;#183;d）；模型对照组给予10g／L醋酸灌胃，剂量20mL／kg。15-20min后经口给予葡萄糖溶液2．0g/kg,于0，0．5，2h分别测定各组小鼠的血糖值。观察模型对照组与龙虾壳聚糖50，100和200mg／kg剂量组在给予葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积的变化。血糖曲线下面积=0．25&;#215;（0h血糖值＋4&;#215;0．5h血糖值＋3x2h血糖值）。结果：实验小鼠100只均进入结果分析，无脱失值。①龙虾壳聚糖在50，100和200mg／kg的剂量下，糖尿病小鼠的空腹血糖值明显低于模型对照组（P〈0．01，P〈0．001），血糖降低百分率分别达16．08％、19．05和25．00％，模型对照组小鼠的血糖值仅降低9．92％。②龙虾壳聚糖100和200mg／kg剂量组均具有不同程度地增强糖尿病小鼠的糖耐量作用，血糖曲线下面积：模型对照组为（57．6&;#177;3．69）mmz，龙虾壳聚糖100和200mg／kg剂量组分别为[（52．1&;#177;3．06），（49．2&;#177;2．52）mml，明显低于模型对照组（P〈0．05和P〈0．001）。③龙虾壳聚糖对正常小鼠的血糖水平无明显影响（P〉0．05）。④模型制备和行为学结果：糖尿病小鼠模型制备6d测定禁食3h后各小鼠的空腹血糖值为25～28mmol/L。并出现了明显的多饮多尿消瘦等糖尿病症状。结论：龙虾壳聚糖对糖尿病小鼠具有降血糖和增强糖耐量的作用，且不     

增强大鼠神经干细胞生物活性的黄芪注射液

背景：黄芪对神经功能缺损疾病治疗及神经再生的作用已受到神经科学和脑科学研究者的密切关注,其对神经干细胞的影响也成为一个新的探索方向。目的：探索黄芪注射液对大鼠神经干细胞生物活性的影响。方法：分离、培养Wistar大鼠胚胎神经干细胞。采用荧光免疫细胞化学法鉴定巢蛋白染色阳性,原代培养细胞传至第2代纯化后,随机分为对照组、50,200,400g／L黄芪注射液组分别培养6,12,24h后。采用MTT法检测细胞活性,通过比较细胞活性,选50g／L黄芪注射液组诱导分化7d后用免疫组化法检测神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达。结果与结论：MTT显示药物作用6h,50,200,400g／L黄芪注射液组细胞的活性与对照组相比明显升高（P〈0．05）;但24h后不同质量浓度的黄芪注射液对细胞活性逐渐趋于一致（P〉0．05）。免疫组织化学检测显示,与对照组相比,50g／L的黄芪注射液组诱导的细胞分化快速,细胞中神经元特异性烯醇化酶阳性细胞数量也明显增加（P〈0．05）。实验提示黄芪注射液可以促进神经干细胞增殖,对细胞分化也具有一定促进作用。     

刺五加和川芎嗪改善老年性椎基底动脉供血不足性眩晕及对血脂、血液流变学的影响

目的：观察补气活血药刺五加和川芎嗪对椎基底动脉供血不足性眩晕，以及对患者血脂、血液流变学和中医症状、体征的改善作用。方法：选择2001-01／2004-01阳江市中医医院收治的椎动脉型颈椎病引起的椎基底动脉供血不足性眩晕急性发作期患者60例，随机分成刺五加＋川芎嗪组和丹参组各30例。丹参组用丹参注射液20mL加入50g／L葡萄糖注射液或9g／L氯化钠注射液250mL，静脉滴注；刺五加＋川芎嗪组用刺五加注射液60mL、川芎嗪注射液200mg分别加入50并／L葡萄糖注射液或9g／L氯化钠注射液250mL，静脉滴注。两组均连续治疗14d。记录两组患者眩晕、恶心呕吐和纳差消失时间；用中医症状、体征积分值（共6项，每项0-4分，0分为无症状，4分为症状重，患者主动叙述，总分24分）评估患者症状改善情况，并根据其改善情况（治疗后较治疗前下降≥60％为显效，下降30％-59％为有效，下降〈30％为无效）评估疗效；同时观察治疗前后血脂（三酰甘油和总胆固醇）、血液流变学（全血比黏度、血浆比黏度和红细胞压积）和经颅多普勒超声椎基底动脉血流速度改善情况；所有患者随访6个月，观察复发率。结果：按意向处理分析，60例患者全部进入结果分析。①症状消失时间：刺五加＋川芎嗪组眩晕、恶心呕吐和纳差症状较丹参组提前消失[（18．56&;#177;1．62），（10．24&;#177;0．86），（30．42&;#177;3．2）h；（36．24&;#177;1．73），（30．12&;#177;1.25），（48．22&;#177;1．6）h，P〈0．01]。②中医症状、体征积分值：刺五加＋川芎嗪组治疗后较治疗前显著降低，并低于丹参组治疗后（5．02&;#177;4．35，18．50&;#177;4．65，9．46&;#177;4．02，P〈0．05）。③临床疗效：刺五加＋川芎嗪组明显优于丹参组（97％，77％，P〈0．01）。④血液流变学和血脂变化：刺五加＋川芎嗪组治疗后全血比黏度、血浆比黏度、红细胞压积、三酰甘油和总胆固醇均较治疗前下降（P〈0．05或0．01）。丹参组治疗前后无变化（P〉0．05）。⑤椎基底动脉血流速度：治疗后刺五加＋川芎嗪组收缩期及舒张期末血流速均明显增快（P〈0．01），丹参组也较治疗前加快（P〈0．05），但还较刺五加＋川芎嗪组慢（P〈0．05）。⑥6个月复发率：刺五加＋川芎嗪组低于丹参组（40％，90％，P〈0．05）。结论：刺五加加川芎嗪可有效控制椎基底动脉供血不急性眩晕的急性发作，具有起效快、复发率低等特点，而且对血液流变学、血脂和椎基底动脉血流速度也有明显改善作用。     

健脾化瘀复方中药血清影响人肝癌BEL7402细胞增殖的作用

目的：观察健脾化瘀中药复方对人肝癌BEL7402细胞增殖的抑制作用，并与已知阳性药物5-氟尿嘧啶进行比较。 方法：实验于2005—03／06在中山大学动物实验中心完成。①服药前及含药血清获得：健康志愿者1名（了解实验目的并签订知情同意书）空腹12h后按0．83，1．67，2．5mL／kg剂量口服健脾化瘀复方960合剂（由莪术、白术、苦参、白花蛇舌草等组成；广州市中医院提供；先将莪术、白术剪碎后用净水浸泡30min，提取挥发油和芳香成分，其渣再与用净水浸泡30min的苦参、白花蛇舌草等水煎提取水溶性成分，各种有效成分混匀制成口服液，每毫升相当于生药1．0g），分别于服药前、服药后1h抽取外周血液，得到服药前和含有健脾化瘀复方有效作用成分的含药血清。②观察服药前血清与小牛血清对BELT402细胞的作用：分别将服药前血清和小牛血清（购于四季青公司）加入RPMI-1640培养液，血清终浓度50，100和200g／L。⑧观察药物血清对BEL7402细胞的作用：将人肝癌细胞BEL7402（引自中山大学动物实验中心）随机分为7组（每组细胞接种lO孔）：对照组（服药前血清加入RPMI—1640培养液，血清终浓度100g／L），5-氟尿嘧啶组[用含100g／L服药前人血清的RPMI-1640培养液配制，5-氟尿嘧啶（上海旭东海普药业有限公司，批号050106，规格10mL／支）终质量浓度为0．3，0．6，0．9mg／L1和健脾化瘀复方组（将按0．83，1．67和2．50mL／kg剂量服药后人血清加入RPMI-1640培养液，血清终浓度100g／L）。④人肝癌细胞增殖能力检测：用四甲基偶氮唑盐比色法检测人肝癌细胞增殖能力，以吸光度似值）表示。计量细胞增殖抑制率[（观察组A值-对照组A值）／观察组A值]。 结果：①相同质量浓度服药前血清与小牛血清对BEL7402细胞增殖能力影响比较，差异不明显（P〉0．05）。200g／L服药前血清和小牛血清促进BEL7402细胞增殖能力最强，明显强于50g／L时（P〈0．01）。②0．3，0．6，0．9mg／L5-氟尿嘧啶药物血清和1．67，2．50mL／kg健脾化瘀复方药物血清抑制人肝癌细胞增殖的能力和抑制率明显高于对照组（P〈0．05～0．01），且药物血清浓度越高，对癌细胞增殖能力的抑制作用越强。1．67mL／kg健脾化瘀中药复方血清对人肝癌细胞增殖能力的抑制率与0．3mg／L5-氟尿嘧啶药物血清相近（30．0％，35．9％，P〉0．05）。 结论：①服药前人血清与小牛血清一样具有促进BEL7402细胞增殖的作用。②健脾化瘀中药复方具有抑制BEL7402细胞增殖作用，且呈剂量依赖性，其中中剂量（1．67mL/kg）含药血清对人肝癌细胞增殖抑制作用与小剂量（0．3mg／L）5-氟尿嘧啶相近。     

不同剂量TPO对小鼠骨髓MSC增殖的影响

为了探讨不同剂量血小板生成素（TPO）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖的影响，将20只昆明小鼠（35±5g）随机分为低、中、高3个剂量实验组与对照组：给实验组分别腹腔注射TPO25、50和100μg／kg，而给对照组腹腔注射生理盐水0．1ml／g，每日1次，连用5日：每组分别于最后1次注射后12小时收集小鼠骨髓，计数骨髓有核细胞数（BMNC），以10^6／cm^2接种、培养并计数原代成纤维样细胞集落形成单位（CFU—F），同时对其进行成骨、成脂肪诱导分化，用流式细胞术检测BMNC中CD90^＋、CD105^＋、CD34^＋细胞比例并鉴定CFU—F的表型。结果显示：与对照组相比，实验组所获得的BMNC、CD90^＋、CD105^＋、CD34^＋细胞比例和CFU—F集落数明显增加（P〈0．05）。3个剂量中以50μg/kgTPO组增加最明显，但50μg/kg组的CFU—F集落数与100μg/kgTPO组的CFU—F集落数相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。CFU—F样MSC具有成骨、成脂肪分化的能力。结论：TPO促进BMNC数、CD90^＋、CD105^＋细胞数和CFU—F集落数增多，即促进骨髓MSC的增殖，但是TPO促进骨髓MSC增殖的作用不随剂号的增加而增加．     

复方苦参注射液联合热疗抗血管生成作用的实验研究

目的探讨复方苦参注射液联合热疗对体内外血管生成的抑制作用。方法采用MTT法观察复方苦参注射液联合热疗对人脐静脉内皮细胞（讯舰C）、人结肠癌LOVO细胞增殖的影响；采用transwell板，观察复方苦参注射液对HUVEC迁移的影响；采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型，观察复方苦参注射液对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果复方苦参注射液在6．25～200μL/L时具有抑制HUVEC增殖的作用（细胞存活率82．2％-32．5％），与浓度呈负相关（相关系数r及P值分别为一0．972、0．001），此浓度范围内对人结肠癌LOVO细胞增殖的抑制明显低于对HUVEC的抑制，具有明显的抗血管生成作用。12．5μL／mL和25μL／mL复方苦参注射液联合热疗在体外具有抗血管生成的协同效应，6．25μL／mL、50μL／mL、100μL／mL和200μL／mL复方苦参注射液联合热疗在体外具有抗血管生成的次加效应。复方苦参注射液在3．125～25μL／mL时具有抑制HUVEC迁移的作用，在12．5-50μL／mL时对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管具有明显的抑制作用。结论小剂量复方苦参注射液在体内外具有抑制血管生成作用，联合热疗具有协同或次加效应。     

红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的Ca2＋/CaM信号通路

背景：课题组前期研究表明,红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,Ca2＋信号是实现其生物学信号传导的重要途径之一目的：探讨Ca 2＋/CaM 信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化中的作用及机制。方法：实验分为空白对照组和红景天苷诱导组,红景天苷诱导组将不同质量浓度红景天苷（5,10,20,50,100 mg/L）作用骨髓间充质干细胞24 h和100 mg/L红景天苷作用骨髓间充质干细胞12,24,48,72 h。采用Western blot方法分别检测红景天苷诱导骨髓间充质干细胞后神经标志分子MAP2和Ca 2＋/CaM信号通路中关键蛋白CaM、CaMKⅡ的表达水平。另外实验设阻断剂组,分别加Ca2＋信号通路特异性阻断剂：500μmol/L EGTA （细胞外Ca2＋螯合剂）、1 mmol/L Nifedipine （L型Ca2＋通道阻断剂）、10 mmol/L LY294002（PI3K抑制剂）分别作用细胞30 min后,再加入100 mg/L红景天苷作用细胞24 h,采用Western blot方法检测阻断Ca2＋/CaM信号通路后NSE、CaM的表达情况。结果与结论：①红景天苷诱导后,MAP2的表达上调（P〈0.01）,说明红景天苷可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞。②不同质量浓度红景天苷诱导骨髓间充质干细胞24 h后,10 mg/L红景天苷组CaM、CaMKⅡ的表达与其他诱导组比较显著上调（P〈0.01）;同一质量浓度红景天苷诱导72 h后CaM、CaMKⅡ表达明显下调（P〈0.01）。③阻断细胞外Ca 2＋和PI3K信号通路后,NSE与CaM的表达水平较红景天苷诱导组上调（P〈0.05）。结果表明,红景天苷通过抑制Ca2＋/CaM信号通路实现骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化。     

乳腺干细胞的体外培养及免疫磁珠法分离

目的：乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得。实验选取乳腺癌旁正常组织，体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的乳腺细胞，拟进一步验证在成人乳腺组织中含有可为组织工程所用的种子细胞。 方法：实验于2007—03／10在吉林大学公共卫生学院放射生物学教研室完成。①细胞来源：标本取材于吉林大学第一医院乳腺外科同期收治的20例女性乳腺癌患者手术切除的癌旁组织（〉3cm），经病理证实为正常乳腺腺体，患者对治疗及实验均知情同意。②实验方法：去除乳腺腺体周围脂肪组织及毛细血管，剪碎成约为0．3cm^3的组织块，离心，去上清，Ⅰ型胶原酶消化，加入含10％胎牛血清的DMEM／F12基础培养基进行原代培养。2周后待细胞接近铺满整个培养瓶底部时，用胰蛋白酶＋D—HANKS液将贴壁细胞消化分离，按1：2或1：3传代。利用免疫磁珠系统分离筛选乳腺成体干细胞。③实验评估：观察原代与传代培养的乳腺细胞生长特点，以及免疫磁珠分选后的乳腺干细胞形态、生长特性。采用免疫组化法对分选结果进行鉴定。 结果：①体外培养的乳腺细胞生长特点：原代培养72h后可见乳腺细胞贴壁，5d后细胞呈纺锤形、多角形生长，10d后细胞生长旺盛且排列紧密，随着培养时间的延长梭形细胞逐渐占据优势。传代后细胞增殖速度加快，细胞更加均匀有序的生长。②乳腺干细胞的形态特点及生长特性：分离出的人乳腺成体干细胞生长状态良好，呈类圆形，培养3d后呈多角形分化生长。③分选结果免疫组化鉴定：免疫磁珠分选出的乳腺干细胞均表达上皮特异性抗原，而不表达唾液黏蛋白。 结论：成人乳腺组织中存在唾液黏蛋白1^-上皮特异性抗原^＋且具有干细胞特性的乳     

人参二醇对鱼藤酮MPP＋诱导的BV2细胞活性下降的作用

目的观察人参二醇对鱼藤酮、MPP＋诱导的小鼠小胶质细胞活性下降的影响。方法以小鼠BV2细胞为研究对象,以鱼藤酮（0．03、0．1、0．3、1、3μmol／L）或MPP＋（10、30、100、300、1000μmol／L）处理24h和诱导细胞活性下降。设阴性对照组、人参二醇对照组（100mg／L）,鱼藤酮（0．1μmol／L）或MPP＋（100μmol／L）损伤组,人参二醇治疗组（10、25、50、75、100mg／L）。采用MTT法检测细胞活性。结果各浓度人参二醇对BV2细胞的活性无明显影响。鱼藤酮或MPP＋处理24h可诱导BV2细胞活性下降,各浓度人参二醇不能逆转鱼藤酮或MPP＋造成的细胞活性下降。结论人参二醇对鱼藤酮或MPP＋诱导的BV2细胞活性下降无保护作用。     

血红素加氧酶1在间充质干细胞上调哮喘患者外周血调节性T细胞中的作用

背景：上调CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞是目前治疗哮喘的新靶点。骨髓间充质干细胞在体外可上调正常人外周血的调节性T细胞,但机制尚未明确。目的：观察血红素加氧酶1对间充质干细胞上调哮喘患者外周血CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞的影响。方法：分别加入0,15,30,45,60μmol/L氯化高铁血红素和0,5,10,15,20μmol/L锌-原卟啉对骨髓间充质干细胞进行预处理,荧光定量PCR检测各组间充质干细胞中血红素加氧酶1mRNA的表达量。密度梯度离心法分离哮喘急性发作期患者和健康对照者的外周血单个核细胞,分别与经氯化高铁血红素预处理、经锌-原卟啉预处理、不经预处理的间充质干细胞共孵育,加入植物血凝素反应72h,流式细胞仪检测各组CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例。结果与结论：人骨髓间充质干细胞中有血红素加氧酶1表达,其表达在体外可被诱导和抑制。间充质干细胞中血红素加氧酶1mRNA的表达量随氯化高铁血红素浓度增加而增加（P〈0.05）,随锌-原卟啉浓度增加而减少（P〈0.05）,具有剂量依赖性。间充质干细胞在体外可提高哮喘患者和健康对照者CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞的水平（P〈0.01）,诱导间充质干细胞中血红素加氧酶1的表达可使共孵育后CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞水平提高（P〈0.01）,抑制间充质干细胞中血红素加氧酶1的表达可使共孵育后CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞的水平降低（P〈0.01）,但仍高于对照组（P〈0.01）。提示骨髓间充质干细胞部分通过血红素加氧酶1上调哮喘患者外周血CD4＋CD25＋CD127low/-调节性T细胞。     

影响外周血CD34^＋细胞纯化的相关因素

背景：造血干细胞具有良好的自我复制和更新的能力,CD34^＋细胞具备有造血干细胞的标志。目的：分析影响外周血CD34^＋细胞纯化的因素。方法：90例患者,经粒细胞集落刺激因子5μg/（kg·d）动员1～3d后,应用COBE血细胞分离机采集外周血单个核细胞液80～100mL,经CliniMACS免疫磁珠分选技术纯化CD34^＋细胞。结果与结论：90例CD34^＋细胞平均数为（1.73±1.15）×107,经流式细胞仪分析,CD34^＋细胞阳性率大于80%。COBE血细胞分离机单次收集的循环血量在980～1100mL时,利于CD34^＋细胞收集（P=0.005）;动员后白细胞浓度在（16～21）×109L-1时,利于CD34^＋细胞收集（P〈0.05）;中间细胞和淋巴细胞总比例超11%时,利于CD34^＋细胞收集（P〈0.05）;单个核细胞液血小板小于2100×10^9L^-1时,利于CD34^＋细胞的收集（P〈0.05）;年龄小于16岁,CD34^＋细胞数高（P=0.003）;CD34^＋细胞抗体的温度、磁性标记及细胞处理时离心力的大小,均有影响。结果提示,经CliniMACS免疫磁珠细胞分选技术纯化的CD34^＋细胞能满足临床需要,实验稳定性好,重复性好;注重相关因素的影响,可提高纯化的CD34^＋细胞数量。     

D，L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性和细胞相容性

背景：课题组前期实验研制了输卵管避孕器材料D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物,依据国内《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》规定,植入体内的组织工程材料必须进行生物安全评价和细胞相容性实验。 目的：观察D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物的生物安全性。 方法：①内毒素实验：在鲎试剂中分别加入聚合物浸提液、内毒素工作标准品溶液和细菌内毒素检查用水。②致敏实验：在昆明小鼠肩胛骨内侧分别注射聚合物浸提液＋弗氏完全佐剂＋生理盐水、弗氏完全佐剂＋生理盐水,通过皮内诱导、局部诱导和激发阶段,观察动物激发部位皮肤红斑和水肿反应程度。③急性毒性实验：分别在昆明小鼠腹腔注射100%,50%,25%聚合物浸提液及生理盐水。④细胞增殖MTT实验：直接法为将人脐静脉内皮细胞分别接种于聚合物膜、聚乳酸与玻璃片上;间接法为将人脐静脉内皮细胞分别接种于聚合物浸提液、丙烯酰胺溶液及1640培养液。 结果与结论：D, L-聚乳酸基形状记忆聚合物材料无细菌污染状况,符合生物安全标准,无致敏性及毒性,并且具有较好的细胞相容性。     

重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴细胞功能相关抗原1／细胞间黏附分子1信号途径诱导CD4^＋T淋巴细胞活化及增殖的影响

目的：观察在异基因外周血造血干，祖细胞移植中重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号途径诱导的外周血CD4＋T淋巴细胞的影响，验证重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴细胞功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号通路的抑制作用。 方法：选择2006—06/2007—06在解放军总医院血液科异基因外周血造血干细胞移植前进行重组人粒细胞集落刺激因子动员的10例健康供者，对治疗方案均知情同意，且得到医院伦理道德委员会批准。给予重组人粒细胞集落刺激因子10μg，（kg·d）进行动员，在动员前1天和动员后第5天取供者外周静脉血，用miniMACS磁珠分选系统分离纯化CD4＋T淋巴细胞，分别用CD3单克隆抗体OKT3＋细胞间黏附分子1、佛波酯＋离子霉素刺激活化CD4^＋T淋巴细胞，用双色荧光标记检测动员前后CD4^＋T淋巴细胞激活后活化标记CD69，CD25的表达；用四甲基偶氮唑盐法检测动员前后OKT3＋细胞间粘黏附分子1、佛波酯＋离子霉素刺激CD4^＋T淋巴细胞增殖能力变化。 结果：①纯化后CD4^＋T淋巴细胞纯度均在90％以上。②动员后OKT3＋细胞间黏附分子1组、佛波酯＋离子霉素组CD4^＋T淋巴细胞活化标记CD69和CD25的表达均明显低于动员前（P〈0．01）。②动员后OKT3＋细胞间黏附分子1组、佛波酯＋离子霉素组CD4^＋T淋巴细胞增殖率均明显低于动员前（P〈0．05）。 结论：重组人粒细胞集落刺激因子动员可能抑制了淋巴功能相关抗原1/细胞间黏附分子1协同刺激信号，从而使CD4^＋T淋巴细胞活化、增殖能力下降。     

二元镁合金在细胞培养基中的耐腐蚀能力及其生物相容性

背景：尽管已经有很多研究报道镁及其合金具有一定的骨传导性和可降解性,可以做为承重骨科内植物材料,但是还需要做更多的工作来正确评估它的潜力所在。目的：检测镁和二元镁合金在细胞培养基中的降解特性和对成人骨髓间充质干细胞活性的影响。方法：制备纯镁和8种二元镁合金（Mg-Al、Mg-Ca、Mg-Mn、Mg-Sn、Mg-Si、Mg-Y、Mg-Zn、Mg-Zr）样品;采用α-MEM细胞培养基（含体积分数为10%胎牛血清）模拟体内环境下制备标准浸提液,并检测pH值;电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测浸提液中镁和添加元素含量;AlamarBlue法检测培养达1,3,5,7d时100%、50%、25%浓度的纯镁和8种镁合金浸提液对成人骨髓间充质干细胞增殖的影响,判断8种二元镁合金的生物相容性。结果与结论：Mg-Ca、Mg-Y合金耐腐蚀性较差,浸提液中Mg2＋质量浓度分别达到（408.0±37.9）mg/L和（351±15.3）mg/L,pH值分别为8.87±0.19和8.84±0.15;其次是Mg-Zr合金;其他二元合金耐腐蚀性与纯镁相当。结果表明纯镁和8种二元镁合金100%含量的浸提液均对成人骨髓间充质干细胞的增殖有显著抑制作用,当Mg2＋质量浓度低于110mg/L,pH值7.35~7.65时,纯镁和8种二元镁合金对成人骨髓间充质干细胞的增殖无显著影响。     

间充质干细胞对脐血CIK／NK细胞CD69表达及培养体系中T调节细胞量比的影响

本研究通过Transwell细胞隔离培养体系探讨骨髓源间充质干细胞（MSC）对脐血（CB）来源细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）／自然杀伤细胞（NK）CD69的表达以及对培养体系中CD4^＋CD25^＋T调节（Treg）细胞量比的影响。利用聚碳酯膜孔径0．4μm的Transwell隔离细胞培养系统将实验组分为隔离培养（Transwell）组和直接混合（mixture）培养组;将MSC和CIK／NK细胞按1：20、1：50和1：100的比例分别在Transwell组和mixture组中进行隔离和直接混合培养,每组6个重复孔;培养48小时后通过流式细胞术检测各纽CIK／NK细胞上CD69的表达以及培养体系中CD4^＋CD25^＋细胞量比的变化。结果显示：加入MSC的实验各组CB-CIK细胞和NK细胞上表达的CD69比例均显著低于对照组（P值均〈0．001）．Transwell组中的CIK和NK细胞上表达的CD69,在MSC的高浓度组（1：20组）均显著低于低浓度组（1：50组和1：100组）,其中CIK细胞组间的P值分别为0．046、0．020;NK细胞组间的P值均为0．000。mixture组中不同比例组问CIK细胞上表达的CD69无显著性差异,而NK细胞上CD69的表达在MSC的高浓度组（1：20组）均显著低于低浓度组（1：50组和1：100组）。加入MSC的CB—CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞的量比不论在Transwell还是mixture组中均显著高于对照组（P值均〈0．01）;在Transwell组中．CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞的量比在1：20组、1：50组均显著高于1：100组;在mixture各组中,CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋T调节细胞的量比均有显著性差异。MSC的高浓度组（1：20组）,CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞量比在mixture组显著高于Transwell组;而在MSC的低浓度组（1：50纽和1：100组）,2纽体系中的C04^＋CD25^＋细胞量比无显著性差异。结论：MSC能以直接接触或间接作用的方式抑制异基因CIK／NK细胞的活化,这可能与MSC能上调培养体系中的CD4^＋CD25^＋Treg细胞量比有关,且这种作用与MSC的数量呈浓度依赖关系。     

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道，但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚。 目的：应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植．观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况。 设计：随机对照动物实验。 单位：中山大学附属第二医院小儿外科。 材料：选用BALB／c小鼠24只为受体，鼠龄6～8周，体质量20～352，雌雄不拘购自广州市实验动物中心。实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成。小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供。 方法：实验于2006-07／2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成。将24只小鼠随机分为2组：肝再生模型＋干细胞移植组和肝切除＋干细胞移植组，每组12只。前组分两次按50mg／kg剂量腹腔内注射倒千里光碱（retrorsine），间隔2周，第2次注射4周后行70％肝部分切除制造肝损伤；然后经门静脉分别移植1×10^5羟基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。后组在行70％肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。 主要观察指标：荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化（双荧光染色）、血清白蛋白水平检测其功能状况。将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内，将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照，观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况。 结果：①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况：CFDASE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散