不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建登革病毒1型和2型外膜蛋白(E蛋白)DⅢ区融合基因的重组腺病毒,在BHK-21细胞中表达。方法用PCR法扩增登革病毒1型和2型EDⅢ基因,依次克隆入pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCDNA-D1/D2EDⅢ。以此为模板,扩增包含CMV启动子-D1/D2EDⅢ-BGHpA的表达片段,与pENTR4载体连接形成质粒pENTR4-D1/D2EDⅢ,与pAd/PL-DEST进行体外同源重组,形成重组腺病毒载体pAd-D1/D2EDⅢ,在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,进一步感染BHK-21细胞,用间接免疫荧光法和Westernblot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况。结果重组腺病毒构建成功,转染293A细胞后获得2×109pfu/mL滴度的重组腺病毒,感染哺乳动物细胞后能够表达1型和2型EDⅢ区目的蛋白。结论不同型别融合基因的重组腺病毒表达载体能有效地表达相应型别的目的蛋白,为进一步构建单一的四价重组腺病毒应用于登革疫苗研究奠定基础。     

4T42肽腺病毒载体的构建包装及抗SKBR3乳腺癌细胞的效果

目的构建携带有肿瘤抑素相关T42肽(以下简称T42肽)基因的重组腺病毒载体,并转染HEK293细胞中进行病毒包装,最终感染SKBR3乳腺癌细胞,体外四倍体T42肽(4T42)抗SKBR3乳腺癌细胞的效果。方法利用同尾酶连接技术将T42肽进行两次克隆形成4T42,并将其亚克隆至穿梭质粒pEC3.1(+)-EGFP中,获得重组质粒pEC3.1(+)-EGFP-4T42。体外重组至骨架载体pAd/BLOCK-iTTM-Dest(pAd-BL-Dest),获得重组质粒pAd-EGFP-4T42。将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用RT-PCR方法和荧光显微镜观察标志蛋白-绿色荧光蛋白的表达情况以判断T42转染成功与否。利用病毒倍比稀释法利用荧光显微镜检测病毒滴度,用重组腺病毒感染SKBR3乳腺癌细胞。采用流式细胞仪检测感染重组腺病毒的SKBR3胞凋亡率,MTT实验检测感染重组腺病毒的MCF细胞的生长情况。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,重组腺病毒获得成功包装,纯化的病毒滴度为4*108 DRP/ml。重组腺病毒rAd-EGFP-4T42感染MCF细胞后较对照组未转染空白组细胞凋亡率高(P<0.05);Ad-EGFP-4T42质粒转染组与对照组相比,明显抑制MCF细胞生长(P<0.05)。结论体外4T42肽具有显著促进SKBR3乳腺癌细胞凋亡和抑制SKBR3乳腺癌细胞生长的作用。     

S1P2受体shRNA腺病毒载体的构建及筛选

目的 为探讨S1P2受体介导血管内皮细胞衰老的机制,构建和筛选特异性S1P2受体shRNA腺病毒载体.方法 设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle载体,测序正确后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞(HPAEC),通过RT-PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,提取质粒DNA,经双酶切,回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段,亚克隆到腺病毒表达载体(pAdeno-X),筛选出正确重组子,转染HEK 293A细胞,收集重组的腺病毒,测定病毒滴度,通过Western blot方法检测S1P2受体沉默效果.结果 测序结果证实所构建的pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA质粒正确,并从4对ds oligos筛选出对S1P2受体沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,经亚克隆到腺病毒表达载体.转染人肺动脉内皮细胞后,Western印迹检测显示构建的腺病毒载体pAdeno-shRNA对S1P2受体蛋白的沉默有明显效果.结论 成功地构建和筛选出介导特异性shRNA-S1P2的重组腺病毒.     

口蹄疫病毒P1+3CD基因重组腺病毒的构建

目的构建包含有O型口蹄疫病毒(FMDV)强毒结构蛋白(P1)基因及弱毒非结构蛋白(3CD)基因的重组腺病毒,为进一步研制FMD活载体疫苗奠定基础。方法通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDV P1、3CD编码区的目的基因。P1基因经BglⅡ和XhoⅠ,3CD基因经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后与经BglⅡ和XbaⅠ双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAd Track-CMV连接。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌内同源重组获得重组腺病毒质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观测细胞病变及报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒。结果在pAd Track-CMV载体中成功克隆了P1+3CD基因,并与腺病毒骨架载体在大肠杆菌中实现了同源重组。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞后可观测到典型的细胞病变与绿色荧光蛋白的表达。结论成功获得了含有FMD P1+3CD基因的重组腺病毒,为FMD活载体疫苗的研制提供了依据。     

重组腺病毒Ad/siRNA/环氧合酶-2的构建及其抑制食管癌细胞的效果

目的观察腺病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术对人食管鳞癌细胞（Eca-109）环氧合酶（COX）-2基因表达的抑制效果及其对Eca-109细胞生长的影响。方法采用含RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的质粒pSUPER构建针对人COX-2 mRNA的重组质粒psiRNA COX-2。Not Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切psiRNA/COX-2 得到siRNA/COX-2表达片段．定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack的相同位点得到pAdTrack/siRNA／COX-2．后者与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到腺病毒Ad/siRNA／COX-2．经293细胞包装、扩增后转染Eca-109细胞。ELISA法测定培养液上清的前列腺素（PG）E2浓度，PCR法检洲细胞COX-2 mRNA水平．流式细胞仪检测细胞凋亡与周期分布．绘制细胞生长曲线。结果重组腺病毒Ad／siRNA/COX-2构建成功．转染Eca-109细胞后．细胞COX-2 mRNA水平下降71．7％（P〈0．01）．培养液上清PGE2浓度下降62．0％（P〈0．01）；细胞生长明显减缓．G0-G1期细胞比例增加、S期与G2-M期细胞比例减少（P〈0.01）．细胞凋产增多（P〈0.01）。结论腺病毒介导的RNAi技术可显著抑制人食管鳞癌细胞COX-2基因表达．从而导致肿瘤细胞增殖减缓、凋亡增加。     

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。     

MHCⅡ类转激活因子基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建含有主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）Ⅱ类分子激活物（CⅡTA）基因的重组腺病毒载体。方法回收CⅡTA的PCR产物插入pUC57中,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,U—Gene凝胶回收纯化3300bp目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒载体pShuttle—GFP—CMV,用T4DNA连接酶将上述目的基因片段与pShunle—GFP—CMV片段连接,得到穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—CⅡTA,并经KpnⅠ单酶切及测序鉴定。Ⅰ—CeuⅠ／Ⅰ—SceⅠ双酶切处理,回收目的片段,将pAdxsi载体片段和插入片段进行酶连接,得到腺病毒质粒pAdxsi—GFP—CⅡTA,经XhoⅠ酶切鉴定后转染HEK293细胞并培养出毒。扩增、纯化重组腺病毒AdCⅡTA,并测定病毒滴度。结果重组穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—CⅡTA经KpnⅠ单酶切及测序分析,证实与GeneBank中公布的小鼠CⅡTA（NM_007575）序列完全相符。重组腺病毒pAdxsi—GFP—CⅡTA构建成功后在HEK293细胞中包装产生的重组腺病毒AdCⅡTA对HEK293细胞有致病作用。经多次重复感染并纯化后,病毒滴度达2．0×10^11PFU／ml。结论含小鼠CⅡTA基因的重组腺病毒已成功构建。     

干扰Fas受体表达的串联shRNA表达载体的构建

目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对Fas的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)串联表达的栽体．方法:设计表达2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析．分别用SacI SalI双酶切重组质粒,胶回收酶切pEGFP6- 1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,T4 DNA Ligase连接酶切大、小片段,得到pEGFP6-1-siFas1 siFas2重组质粒．转化感受态细胞DH5α,扩增,提取串联重组质粒进行酶切鉴定．结果:成功构建靶向Fas的2个shRNA串联重组质粒载体pEGFP6-1-siFas1 siFas2．酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功．结论:表达2个靶向Fas的shRNA表达框成功构建在一个重组质粒载体上．     

βig—h3对人神经胶质瘤U87细胞侵袭力的影响

目的应用转化生长因子β诱导基因克隆3（βig—h3）真核表达载体pEGFP—C2／βig—h3转染人神经胶质瘤U87细胞,观察βig-h3对U87细胞侵袭力的影响。方法重组质粒pEGFP-C2／βig—h3用脂质体转染人神经胶质瘤U87细胞,采用明胶酶谱法和Transwell小室细胞侵袭实验检测转染后细胞基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平和侵袭力的变化。结果与未转染的U87细胞和转染pEGFP—C2空载体的U87／vector相比较,在转染重组质粒pEG-FP-C2／βig-h3的U87／h3细胞中,βig-h3mRNA和蛋白表达均显著增高,U87／h3细胞MMPs表达水平明显提高,细胞侵袭率显著增高（P均〈0．01）。结论βis—h3可促进人神经胶质瘤U87细胞分泌MMPs,从而增强细胞的侵袭力,与神经胶质瘤的侵袭和转移密切相关。     

重组腺病毒RNA同时干扰3个基因对胃癌细胞增殖的实验研究

目的应用能同时表达3种不同基因（血管内皮生长因子VEGF、人端粒酶逆转录酶hTERT、抗凋亡基因bcl-x1）的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）的重组腺病毒对胃癌细胞系（BGC-823）进行RNA干扰,观察重组腺病毒对胃癌细胞增殖活性及细胞周期的影响。方法构建能同时表达3种不同的的重组腺病毒Ad—shVEGF—shTERT—sh bcl—x1,同时构建单独表达上述3个基因的重组腺病毒,将上述4种重组腺病毒同时感染BGC-823,MTF法检测BGC-823细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,蛋白印迹检测目的蛋白的表达。结果重组腺病毒感染胃癌细胞后,3个目的基因的蛋白表达显著下调,细胞增殖明显受抑制,大量细胞凋亡。表达3个基因的重组腺病毒生长增殖抑制作用强于表达单个基因的重组腺病毒。结论相对于单独沉默1个基因,同时沉默3种不同基因,对胃癌细胞的生长抑制作用更强。同时沉默多个基因的表达是胃癌基因治疗研究的一个新的有效途径。     

CXCR4基因shRNA表达质粒的构建及筛选鉴定

目的 构建编码CXCR4mRNA的短发卡样RNA(shRNA)表达质粒用以筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 根据GenBank中登录的CXCR4基因的核苷酸序列,应用shRNA设计软件设计并合成4条短发卡shRNA的oligo DNA,构建shRNA重组质粒.采用酶切电泳和测序方法进行鉴定.将鉴定后的CXCR4基因shRNA重组质粒经脂质体介导转染胶质瘤U251细胞,24 h后经RT-PCR筛选有效的shRNA重组质粒.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出目的条带,DNA测序结果与理论序列完全一致.RT-PCR检测显示,转染pG-PU6/GFP/Rac 1-421的U251细胞CXCR4基因mRNA的转录水平下降.结论 成功构建CXCR4基因shRNA表达质粒,并筛选出效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pGPU6/GFP/Rac1-421.     

腺病毒介导的过氧化物酶增殖激活受体-δ小发夹状RNA对胰岛细胞瘤细胞脂代谢的影响

目的 构建小发夹状RNA（shRNA）腺病毒沉默过氧化物酶增殖激活受体-δ（PPAR-δ）表达,探讨PPAR-δ在大鼠胰岛细胞瘤细胞（INS-1）脂代谢中的作用和地位.方法 用限制性内切酶Sal Ⅰ和HindⅢ将shRNA质粒pGenesil-1载体中的PPAR-δ-shRNA片段连同U6启动子一起切下,连接至线性化的穿梭质粒pAdtrack-CMV上,将pAdtrack-CMV与骨架质粒pAdeasy在腺病毒载体电转感受态细菌（BJ5183）中重组得到PPAR-δ-shRNA腺病毒重组质粒.限制性内切酶Pac Ⅰ线性化重组质粒后用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000转染人胚肾细胞（HEK293）,包装得到含PPAR-δ-shRNA的病毒重组子,病毒重组子在HEK293细胞中扩增后,将收集的病毒液感染INS-1细胞、RT-PCR和Western blot检测PPAR-δ蛋白的表达.RT-PCR检测该病毒对INS-1细胞脂代谢相关基因酰基辅酶A氧化酶（ACO）、肉毒碱棕榈酸转移酶1（CPT1）、脂肪酸转运蛋白1（FATP1）、长链酰基辅酶A脱氢酶（LCAD）表达的影响,并检测INS-1细胞内甘油三酯含量的变化.采用SPSS 12.0软件进行统计学分析,组间差异采用方差分析.结果 成功构建了含有大鼠PPAR-δ-shRNA基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为1×1010PFU/ml.重组腺病毒感染后INS-1细胞PPAR-δ mRNA和蛋白表达明显下降.与空病毒组相比,PPAR-δ-shRNA腺病毒使ACO的表达下降40%（分别为0.72±0.05,0.44±0.07,P＜0.05）,CPT1表达下降27%（分别为0.66±0.08,0.48±0.02,P＜0.05）,使FATP1的表达下降55%（分别为0.65±0.07,0.30±0.02,P＜0.05）,使LCAD的表达下降32%（分别为0.66±0.12,0.45±0.10,P＜0.05）.与空病毒组相比,PPAR-δ-shRNA腺病毒使INS-1细胞内甘油三酯含量上升65%（分别为5.27±0.19,8.68±0.34,P＜0.05）.结论 成功构建了PPAR-δ-shRNA腺病毒,该腺病毒能够抑制INS-1细胞的脂肪酸氧化,促进细胞内脂质沉积.     

靶向PCSK9基因shRNA慢病毒载体的构建及其对PCSK9基因表达的沉默

目的设计以PCSK9基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对PCSK9基因表达的影响。方法将3条人PCSK9基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pLentilox3．7,与pCDNA3-hPCSK9．FLAG质粒用Lipofectamine2000共转染293细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pCre—VSV-G、pLoxp．CMV—R8．91经293细胞包装后,产生的重组慢病毒感染293细胞,48h后转染pCDNA3．hPCSK9-FLAG质粒,Western blotting法检测人PCSK9基因表达的情况。结果经双酶切鉴定,构建了PCSK9shRNA慢病毒载体pLentilox—hPC—SK9,鉴定出hshRNA-2为最有效的shRNA。重组的慢病毒能明显的抑制人PCSK9的表达。结论慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性的阻断PCSK9的表达,为进一步探讨PCSK9特异性的shRNA治疗脂代谢异常疾病奠定了基础。     

pGenesil-2.1- iASPP-shRNA质粒的构建及转染

目的构建针对iASPP基因的短发卡RNA干扰（iASPP-shRNA）质粒,并转染胃癌细胞AGS（p53野生型）。方法以iASPP为靶基因设计两条带有短发卡结构的寡核苷酸序列,连接到pGenesil-2．1载体,转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒转染胃癌细胞并培养形成稳定的细胞系,PCR检测转染AGS细胞中的iASPP基因。结果构建的pGenesil-2．1-iASPP—shRNA质粒测序证实iASPP基因序列完全正确,该质粒转染AGS细胞后,其iASPP基因表达受抑制。结论成功构建了pGenesil-2．1-iASPP—shRNA质粒,并可成功转染AGS细胞而抑制其iASPP基因的表达。     

CD147基因发夹结构干扰RNA表达载体的构建及鉴定

根据人CD147基因mRNA序列，设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列（shRNA），克隆到空载体pSilencer 4．1-CMV neo中，构建重组质粒，通过测序验证阳性克隆。结果重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同，证实重组质粒构建成功。认为构建CD147RNA干扰表达载体的成功对未来转移性前列腺癌的基因治疗有重要意义。     

核因子-κB反义RNA对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

目的：探讨核因子（NF）-κB反义RNA重组腺病毒预处理对凝血酶诱导培养的自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。方法：分别用表达NF—κB反义RNA的50多重感染（MOI）重组腺病毒和100μmol／L吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC,NF—κB特异性阻断剂）预处理VSMCs 48h和1h．采用WST-1试剂和氚胸腺嘧啶核苷（^3H—TdR）掺人率测定0．5U／ml凝血酶诱导的VSMCs细胞增殖率。结果：与PDTC一样。表达NF—κB反义RNA的重组腺病毒预处理明显抑制凝血酶诱导VSMCs的增殖（P〈0．01）．抑制率〉30％。结论：NF—κB反义RNA与NF—κB特异性阻断剂对VSMC的增殖具有相同的抑制作用,其抑制率超过30％。     

p16INK4α重表达对人食管癌细胞系EC109生长的抑制作用

目的探讨用腺病毒介导野生型的p16基因在食管癌细胞系表达,研究重表达野生型p16基因对食管癌细胞系EC109生长的抑制作用,为寻找食管癌致癌机制的研究及其基因治疗提供理论基础.方法用基因重组技术,将pcDNA3-p16中的野生型p16基因用Kpn I/BamH I进行双酶切,克隆入腺病毒表达载体pAdCMV中,将重组质粒pad-CMV-p16与腺病毒质粒JM17用Lipofectamime 2000共转染293细胞,产生重组腺病毒.用重组腺病毒感染人食管癌细胞系EC109,在感染后的不同时段,用免疫荧光、打点杂交方法检测p16基因在细胞中的表达用MTT法及流式细胞仪观察p16基因的表达对食管癌细胞株生长的影响.结果经酶切鉴定野生型p16基因克隆入腺病毒表达载体中,与JM17共转染293细胞后,可产生具有感染活性的重组腺病毒,用重组腺病毒感染食管癌细胞株EC109细胞后,可抑制食管癌细胞的生长,同对照组相比其最大抑制率可达52.7%.Multipcycle分析软件分析对细胞周期影响表明,处于G0～G1期的细胞为41%～63%感染后的细胞经Dot blot和Westernblot杂交证实,有外源的p16mRNA及蛋白的表达.结论重组腺病毒可将野生型p16基因导入人食管癌细胞系EC109中,野生型p16基因在p16基因功能缺失的细胞中重表达能抑制癌细胞恶性生长.p16基因功能缺失是食管癌致癌因素之一     

p16-INK4alpha重表达对人食管癌细胞系EC109生长的抑制作用

目的探讨用腺病毒介导野生型的p16基因在食管癌细胞系表达,研究重表达野生型p16基因对食管癌细胞系EC109生长的抑制作用,为寻找食管癌致癌机制的研究及其基因治疗提供理论基础.方法用基因重组技术,将pcDNA3-p16中的野生型p16基因用Kpn I/BamH I进行双酶切,克隆入腺病毒表达载体pAdCMV中,将重组质粒pad-CMV-p16与腺病毒质粒JM17用Lipofectamime 2000共转染293细胞,产生重组腺病毒.用重组腺病毒感染人食管癌细胞系EC109,在感染后的不同时段,用免疫荧光、打点杂交方法检测p16基因在细胞中的表达用MTT法及流式细胞仪观察p16基因的表达对食管癌细胞株生长的影响.结果经酶切鉴定野生型p16基因克隆入腺病毒表达载体中,与JM17共转染293细胞后,可产生具有感染活性的重组腺病毒,用重组腺病毒感染食管癌细胞株EC109细胞后,可抑制食管癌细胞的生长,同对照组相比其最大抑制率可达52.7%.Multipcycle分析软件分析对细胞周期影响表明,处于G0～G1期的细胞为41%～63%感染后的细胞经Dot blot和Westernblot杂交证实,有外源的p16mRNA及蛋白的表达.结论重组腺病毒可将野生型p16基因导入人食管癌细胞系EC109中,野生型p16基因在p16基因功能缺失的细胞中重表达能抑制癌细胞恶性生长.p16基因功能缺失是食管癌致癌因素之一     

RAd-ODC/Ex3as对肺癌A-549细胞抑制作用的研究

目的探讨重组腺病毒rAd-ODC／Ex3as对肺癌A-549细胞的体外抑制作用。方法利用基因GFP测定病毒感染效率，采用MTT法观察rAd—ODC／Ex3as对肺癌细胞A-549生长增殖的影响，用Western Blot检测rAd—ODC／Ex3as对鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因表达的影响。结果当MOI为50时，腺病毒感染A-549细胞的效率约为75％；Western Blot证实rAd—ODC／Ex3as可抑制ODC基因的表达；rAd—ODC／Ex3as以20MOI感染肺癌A-549细胞可明显抑制其生长增殖。结论rAd—ODC／Ex3as在体外能有效地干扰ODC基因的表达，并可抑制肺癌A-54．9细胞的生长和增殖，有单成为治疗肺癌的基因药物。     

HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构建

目的：构建乙型肝炎病毒表面抗原细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体（HBsAg-SCT）真核表达载体，在真核细胞293T中表达，并构建含HBsAg-SCT的腺病毒载体。方法：合成H-2L。限制的HBsAg细胞毒性T细胞表位寡核苷酸，与H-2L“分子融合，构建含HBsAg—SCT的真核表达载体，并转染293T细胞，采用流式细胞技术观察HB—sAg-SCT在细胞表面的表达。将HBsAg—SCT亚克隆到腺病毒载体，转染293A细胞，包装产生携带HBsAg-SCT的重组腺病毒。结果：成功构建了HBsAg-SCT真核表达载体，并在真核细胞中表达。利用重组腺病毒载体制备出高滴度的重组腺病毒。结论：合HBsAg—SCT的真核表达载体能够在真核细胞表面有效表达，获得合HBsAg-SCT的重组腺病毒，为研究HBsAg—SCT免疫治疗HBV感染打下基础。