吉林省2001～2014年麻疹病毒血凝素蛋白基因变异分析北大核心

目的研究吉林省2001-2014年麻疹病毒血凝素（H）蛋白的变异情况。方法选取吉林省2001-2014年21株麻疹病毒株,通过病毒分离、核酸提取、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增得到H蛋白基因片段,测序并拼接全序,用生物信息学软件进行变异分析。结果吉林省2001-2014年21株麻疹病毒株均为H1a基因亚型,与中国疫苗株S191相比,H蛋白的核苷酸变异率由2001年的4.69%逐年上升到2013年的5.34%,氨基酸变异率由4.05%逐年上升到5.02%。与H1a中国代表株China93-4相比,核苷酸变异率从0.38%逐步上升为1.14%,氨基酸变异率从0.49%逐步上升为1.41%。吉林省麻疹病毒株均保留了4个糖基化位点,第240位氨基酸均由丝氨酸变为天冬酰胺,导致第5个糖基化位点NLS238-240缺失。21株麻疹病毒H蛋白氨基酸的334、397、493、574、592、603、613和614位点熵值相对偏高,可变性相对较大。结论吉林省2001-2014年麻疹病毒的核苷酸和氨基酸变异率均呈逐年升高趋势,需持续监测关键区域位点变异情况。     

汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性，其氨基端约１００个氨基酸大多具有亲水性，且能被患者和免疫动物的血清及许多抗汉坦病毒的单克隆抗体所识别，是汉坦病毒核衣壳蛋白的主要抗原表位区。本文就近年来 一方面的研究作一简要综述。     

登革病毒E蛋白抗原表位研究进展

提要登革病毒是虫媒病毒B组的一个成员,其RNA编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。研究发现,病毒抗原中既存在有中和性抗原表位,又有免疫增强抗原表位。本文阐述了登革病毒主要抗原E蛋白的表位研究进展。     

汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,其氨基端约100个氨基酸大多具有亲水性,且能被患者和免疫动物的血清及许多抗汉坦病毒的单克隆抗体所识别,是汉坦病毒核衣壳蛋白的主要抗原表位区。本文就近年来这一方面的研究作一简要综述。     

卡氏肺孢子虫kexin蛋白抗原表位预测

[目的]预测卡氏肺孢子虫kexin蛋白的抗原表位。[方法]应用互联网服务器及相关生物软件预测卡氏肺孢子虫kexin蛋白抗原表位,进行生物信息学分析。[结果]kexin蛋白存在多个潜在的抗原表位,其中T细胞表位按积分位于第367～381,38～52,128～156,351～388,426～440位氨基酸等区域,B细胞表位位于第133～215,300～442及660～733位氨基酸区域。[结论]kexin抗原表位可能主要位于第38～215及300～442氨基酸序列区域内或其附近,抗原表位的预测可以有目的地克隆kexin重组基因片段,为研究高效卡氏肺孢子虫疫苗奠定基础。     

H7N9禽流感病毒血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制用于H7N9禽流感病毒诊断的血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体。方法采用H7N9禽流感病毒血凝素特异性线性B细胞抗原表位免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术和间接ELISA法筛选、鉴定获得稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA和斑点免疫印迹技术鉴定其亚型、效价、纯度等生物学特征。结果共获得2株单克隆抗体(7C8H8和8E9E2),其中7C8H8抗体亚类为IgG2a,腹水抗体效价>1∶512000,且可以特异性结合H7N9禽流感病毒血凝素。8E9E2仅具有较低的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白结合力。结论获得1株可分泌高效价、高特异性的抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株7C8H8。     

SARS冠状病毒S基因序列及细胞抗原表位预测

目的 比较SARS冠状病毒各分离株S基因序列及氨基酸序列之间的差异，预测SARS-CoV的S蛋白的抗原表位。方法 利用Lasergene软件包中的EditSeq从21株SARS冠状病毒分离株截取S基因序列并翻译成氨基酸序列，然后用ClustalX软件对截取序列进行比较分析，确定基准株，最后用Protean软件对基准株进行抗原表位预测。结果 在21株分离株的S基因中有8株核苷酸序列、13株氨基酸序列没有发生点突变；预测出78个可能性抗原表位。结论 SARS-CoV的S蛋白相当保守，只发生个别点突变，可能性抗原表位多，且在其中的14个区域中可能性最显著。     

广东省麻疹病毒血凝素基因的序列分析

目的 探讨广东省麻疹病毒的基因型别和特征。方法 对2000年和2001年分别在广东省中山和韶关地区分离的两株麻疹病毒，通过RT－PCR方法扩增麻疹病毒血凝素（H）基因全序列，并克隆pMD18-T Vector进行序列测定；并分析这两株麻疹病毒和Genbank中麻疹病毒的各基因型代表株序列的同源性。结果 两株广东麻疹流行株H基因之间同源性为97％，和它们在核苷酸水平上同源性最高的毒株分别是China93-4和China94-7，达到99％。和其它已知麻疹病毒的21个基因代表株相比，广东省麻疹毒株在核苷酸水平上最大变异为7．0％，其中广东省2000年流行株在氨基酸240位由丝氨酸（S）突变成天门酰胺（N），造成一个N型糖基化位点丢失。结论 广东省麻疹流行株属于H1基因型。     

吉林省2001～2008年麻疹病毒血凝素蛋白基因特征和氨基酸变异分析

目的研究吉林省2001～2008年麻疹病毒代表株的血凝素蛋白基因（Hemagglutinin,HA）特征和氨基酸变异。方法从吉林省2001～2008年流行的麻疹野病毒中选取5株代表株,提取核糖核酸,用逆转录-聚合酶链反应扩增HA基因片段,对扩增产物进行核苷酸序列分析,并与基因库中的中国麻疹疫苗病毒株沪191以及所有23种麻疹野病毒基因型代表株的H基因序列,进行基因亲缘关系、同源性、氨基酸变异以及糖基化位点变异比较。结果吉林省5株麻疹病毒分离株均属于H1基因型H1a基因亚型,5株病毒H基因之间有6～17个核苷酸差异（0.3%～0.9%）,3～9个氨基酸差异（0.5%～1.5%）。与中国现行疫苗病毒株沪191H基因相比,有89～95个核苷酸差异（4.8%～5.1%）,25～30个氨基酸差异（4.1%～4.8%）。与H1a基因亚型代表株China93-4H基因相比,有9～17个核苷酸差异（0.5%～0.9%）,3～7个氨基酸差异（0.5%～1.2%）。吉林省5株麻疹病毒分离株的H蛋白均保留了4个糖基化位点,第5个糖基化位点在氨基酸第240位由丝氨酸突变成天冬酰胺,导致一个潜在糖基化位点NLS238～240的缺失。结论吉林省2001～2008年流行的5株麻疹病毒,均丢失了一个可能影响抗原性的糖基化位点。5株麻疹病毒的核苷酸、氨基酸差异均不大,但无论与H1a基因亚型代表株China93-4相比,还是与疫苗株S191相比,核苷酸和氨基酸的同源性均呈逐年递减趋势,吉林省麻疹野病毒H基因的变异仍在逐年增加、逐年积累。     

麻疹病毒Edmonston疫苗株血凝素基因克隆及表达

目的 构建麻疹病毒(MV)血凝素蛋白(H蛋白)基因的重组质粒，使其在大肠埃希菌中大量表达H蛋白，为进一步研究奠定基础。方法从MV Edmonston株减毒活疫苗中提取基因组RNA，RT-PCR扩增H蛋白基因。用限制性内切酶Barn-HI和Hind-Ⅲ双酶切H基因片段和pGEMEX-1载体，连接后获得重组质粒MV-H-pGEMEX-1。然后，用IPTC诱导重组质粒在大肠埃希菌JM109(DE3)和BL21(DE3)中表达。结果 RT-PCR获得的片段长度约为1900bp，与MV-H基因相符。MV-H-pGEMEX．1测序结果显示：MV-H基因对码正确，核苷酸序列符合率达99．4％。转化重组质粒的大肠埃希菌，其表达产物经SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，出现与目的蛋白分子量相一致的条带。结论 成功构建MV-H蛋白表达载体MV-H-pGEMEX-1，并在大肠埃希菌中获得表达。     

Reduced ability of hemagglutinin of the CAM-70 measles virus vaccine strain to use receptors CD46 and SLAM

The CAM-70 measles virus (MV) vaccine strain is currently used for vaccination against measles. We examined the fusion-inducing ability of the CAM-70 hemagglutinin (H) protein and found that it was impaired in both CD46- and signaling lymphocyte activation molecule (SLAM)-expressing cells. We also generated recombinant MVs possessing H genes derived from the CAM-70 strain. The CAM-70 H protein impaired viral growth in both CD46- and SLAM-expressing cells. In peripheral blood lymphocytes (PBL) and monocyte-derived dendritic cells (Mo-DC), the CAM-70 strain did not grow efficiently. Infection with recombinant MVs revealed that impaired growth of the CAM-70 strain was attributed to the H gene only partly in PBL and largely in Mo-DC. Thus, impaired fusion-inducing ability of the H protein may be one of the underlying molecular mechanisms resulting in the attenuation of the CAM-70 strain.     

2005年浙江麻疹流行株与疫苗株基因组比较分析

目的 通过对麻疹暴发疫情中分离的麻疹流行株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4与麻疹疫苗株沪191全基因组比较,分析当代麻疹流行株与疫苗株的基因差异.方法 通过测定从2005年浙江省麻疹暴发疫情中分离到的麻疹流行株MW/Zbejiang.CHN/7.05/4的全基因组序列,采用MEGA 3.1软件对流行株与疫苗株的全基因组序列进行比对和分析,并结合流行病学资料对毒株的变异进行分析.结果 流行株与疫苗株相比全基因组共发生822个碱基突变(变异率为5.17%),含161个异义突变,其中有3个变异位点导致了病毒糖基化位点的变异;用毒株制备抗血清进行交叉中和试验,流行株与疫苗株抗原比相差5.66倍.结论 浙江省2005年麻疹暴发疫情分离的流行株MVi/Zhejiang.CHI/7.05/4和中国现行使用的麻疹疫苗株沪191在全基因组层面已存在一定的差异,疫苗对免疫人群的保护作用需做进一步追踪探讨.     

宁波市麻疹病毒血凝素基因的序列分析

目的：探讨现阶段在宁波市流行的麻疹野病毒的基因型别和特征。方法：在2004年和2005年医院住院麻疹病人中采集含漱液分离麻疹病毒，获得8株麻疹野病毒。通过RT-PCR方法扩增其中两株麻疹病毒血凝素（H）基凼全序列并对其进行序列测定和分析。比较这两株麻疹病毒和Genbank中麻疹病毒的各基因型代表株的同源性。结果：两株宁波麻疹毒株ningbo04-2和ningbo05-2的H基因之间核苷酸同源性为97．7％，与川基因型代表株China93-7之间核苷酸同源性分别为98．3％，97．7％。与它们在核苷酸水平上同源性最高的毒株分别是zhejiang05-2，china94-7，其同源性分别达到99，7％，99．4％。ningbo04-2在氨基酸240位由丝氨酸（S）突变成天冬酰胺（N），造成一个潜在的N型糖基化位点丢失。结论：宁波市麻疹流行株属于H1型，至少存在H1a，HIb两组。     

Antigenic sites of H1N1 influenza virus hemagglutinin revealed by natural isolates and inhibition assays

The antigenic sites of hemagglutinin (HA) are crucial for understanding antigenic drift and vaccine strain selection for influenza viruses. In 1982, 32 epitope residues (called laboratory epitope residues) were proposed for antigenic sites of H1N1 HA based on the monoclonal antibody-selected variants. Interestingly, these laboratory epitope residues only cover 28% (23/83) mutation positions for 9 H1N1 vaccine strain comparisons (from 1977 to 2009). Here, we propose the entropy and likelihood ratio to model amino acid diversity and antigenic variant score for inferring 41 H1N1 HA epitope residues (called natural epitope residues) with statistically significant scores according to 1572 HA sequences and 197 pairs of HA sequences with hemagglutination inhibition (HI) assays of natural isolates. By combining both natural and laboratory epitope residues, we identified 62 (11 overlapped) residues clustered into five antigenic sites (i.e., A-E) which are highly correlated to the antigenic sites of H3N2 HA. Our method recognizes sites A, B and C as critical sites for escaping from neutralizing antibodies in H1N1 virus. Experimental results show that the accuracies of our models are 81.2% and 82.2% using 41 and 62 epitope residues, respectively, for predicting antigenic variants on 197 paring HA sequences. In addition, our model can detect the emergence of epidemic strains and reflect the genetic diversity and antigenic variant between the vaccine and circulating strains. Finally, our model is theoretically consistent with the evolution rates of H3N2 and H1N1 viruses and is often consistent to WHO vaccine strain selections. We believe that our models and the inferred antigenic sites of HA are useful for understanding the antigenic drift and evolution of influenza A H1N1 virus.     

昆明地区流感病毒血凝素的蛋白质结构分析

目的 对从昆明地区分离10株流感病毒的血凝素(HA)基因进行蛋白质结构分析,与WHO推荐株进行比较,分析其异同.方法 从流感病毒中提取RNA,进行RT-PCR扩增血凝素基因,对扩增产物测序进行蛋白质结构分析.结果 蛋白质结构分析表明A/Kunming/01/2008(H1N1),A/Kunming/07/2008(H1N1)测出的序列大部分位于HA1,包括一小部分HA2和WHO 2007-2008年推荐株EU 100724.1对比,主要是第226位点不同,分别被Arg和Gln取代;A/Kunming/02/2008(H3N2)、A/Kunming/04/ 2008(H3N2)和WHO2007-2008年推荐株CY034116.1相比,变异位点为154 Asp→Asn,188 Gln→His,218 Val→Gly,248 Asn→Asp,255 Ile→Val,均位于蛋白表面,但对蛋白的结构没有产生大的影响;B/Kunming/10/2008和B/Kunming/09/2008有3点突变,分别为221Ala-Ile、281 Arg-Gly、550 Asp-Ile,但未引起蛋白质表面形状和电荷的变化;另外4株(两株H1N1和两株B型)与推荐株基本一致.结论 两株A(H1N1)与推荐株EU 100724.1的抗原性基本一致,另外两株A(H1N1)与流行株代表株的同源性相对前两株要略低,HA基因已有位点发生突变;两株A(H3N2)与分离年代较近的全国流感病毒流行株代表株同源性较高,高氨基酸的突变只有一个,突变对蛋白的结构没有产生大的影响;4株B型毒株属于Victoria系和国外地区及近年国内流行株代表株同源性相对较低,存在地区差异和抗原性差异,有必要对毒株的变异加强监测.     

浙江省麻疹病毒流行株血凝素基因的变异及其与国内外流行株的差异

目的 探讨浙江省麻疹病毒(measles virus,MV)流行株血凝素基因的变异情况,及其与国内外流行株的差异.方法 选取浙江省1999-2011年分离保存的麻疹病毒流行株33株,提取病毒核酸,采用RT-PCR法扩增其血凝素(H)基因全序列,并与GenBank上下载的中国麻疹疫苗株沪191,以及95株国内外各基因型麻疹毒株的H基因序列进行比较分析.结果 从浙江省1999-2011年麻疹患者咽拭子标本中分离麻疹病毒株33株,与1993-2007年我国其他地区麻疹流行株构建H基因系统进化树,结果表明33株浙江麻疹流行株均属于H1a亚型,流行株分布无明显时间和地域特征.以疫苗株沪191为参考株,我国2003-2011年H1a亚型流行株H基因的核苷酸、氨基酸平均变异率以及进化率分别为5.15％、4.44％和5.81％,分别高于1965-1993年(4.75％、3.86％和5.30％),以及1994-2002年(4.80％、4.08％和5.37％)流行株平均变异率与进化率;3个时间段流行株H基因非同义替换率与同义替换率的比值(dn/ds)分别为0.19、0.21和0.23,表明1993-2011年我国H1a型麻疹流行株尚未受到明显的正向选择作用.我国2003-2011年H1a亚型毒株与沪191之间,在H基因上共存在24个稳定的氨基酸变异位点;H1a亚型流行株与A基因型疫苗株间差异最大,遗传距离为0.053,氨基酸差异数为26 ～28个,而B3、D4型代表株与沪191间稳定的氨基酸差异仅为15个.另外,H1a型流行株与B、D基因型毒株间差异明显,组间遗传距离分别为0.074和0.071,氨基酸差异数达27～33个.结论 麻疹病毒H1a亚型流行株与疫苗株以及其他基因型麻疹病毒株,在H基因上存在明显差异,且该差异随时间累积而增大,应该引起足够的重视.     

不同人群血清对麻疹疫苗株与流行株的中和能力比较

目的探讨不同人群血清对麻疹流行株与疫苗株中和能力的差异。方法采集麻疹患者急性期与恢复期血清、麻疹疫苗免疫前后儿童血清以及流动人口血清，分别对疫苗株沪191与2005年麻疹流行株进行中和抗体（NT）滴度测定。同时，利用疫苗株、浙江省当地流行株制备动物免疫血清，与相应毒株进行交叉中和试验，测定各毒株之间抗原比。结果疫苗免疫后儿童血清对疫苗株的中和抗体几何平均滴度（GMT）为50.82，高于流行株MVi／ZJ／05／7（GMT值为27．35）1．86倍；患者恢复期血清对流行株的中和能力（GMT值为386．95）显著高于疫苗株（GMT值为151．83）；流动人口血清对流行株中和抗体GMT值均小于疫苗株，差异为2．22～4．17倍；MVi／ZJ／99／1、MVi／ZJ／04／1和MVi／ZJ／05／7与疫苗株间抗原比分别为4．28、5．24和5．66。此外，部分患者急性期血清对疫苗株存在低滴度的中和抗体，GMT值1：4左右。结论不同人群血清对麻疹疫苗株与流行株的中和能力的差异有统计学意义，低滴度的疫苗抗体不能有效保护个体免受麻疹流行毒株的侵袭，应加强麻疹病毒变异与疫苗效果的相关研究。     

广西禽流感H5N1亚型病毒HA基因序列分析

目的了解广西禽流感H5N1亚型病毒的基因特性.方法2011年在广西农贸市场采集污水、笼具涂抹、粪便标本,经H5亚型特异实时荧光定量PCR方法(Real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测,阳性样本进行病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因扩增后对产物直接测序,测序结果与已知参考毒株进行序列比对及系统进化分析.结果对阳性样本病毒HA基因测序获得6份HA序列,均分布在进化分支2.3.2的Ⅱ-1分支下.广西的6序列无论是氨基酸还是核苷酸的都是高度同源的,其核苷酸同源性在99.5%~100%,氨基酸同源性在99.5%~99.8%;序列测定的结果同时表明无论是受体特异性还是连接肽都是禽源的.结论2011年广西农贸市场流行的禽流感H5N1亚型病毒主要以进化分支2.3.2Ⅱ-1为主,均为禽源性的病毒.