表型和分子分型技术在霍乱弧菌研究中的应用

目的分析1999～2005年广州地区O1群和O139群霍乱弧菌代表菌株的致病基因型和PFGE型别,确定霍乱菌株的分子流行病学特征和同源性,研究本地霍乱弧菌的分子特性。方法采用多重PCR方法检测霍乱弧菌的4种致病相关基因,采用限制性内切酶Not I,以脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对菌株进行分子分型,采用分型处理软件BioNumerics Version对PFGE图谱做聚类分析。结果本地霍乱弧菌代表株中存在3种致病基因型(A、B、C型),病例分离的霍乱弧菌多为A型基因,而环境分离的霍乱弧菌则多为C型和B型。总共96株霍乱弧菌分为60个不同的PFGE型,带型范围:8 kb-650 kb。相同或相近的PFGE型(相差1～3条带)存在于多次霍乱暴发疫情分离株中、环境分离霍乱与临床株之间、输入病例与本地病例分离霍乱弧菌间,不同的PFGE克隆型(4～6带及以上)的流行病学联系也较远。结论将致病基因分型、PFGE型与流行病学资料结合,揭示了本地霍乱菌株从受污染的珠江水及水产品传递给人并引起霍乱暴发、散发的特征,提示开展霍乱菌株PFGE分子分型监测及加强地区间合作的必要性和急迫性。     

深圳市1993-2002年霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的 分析深圳市1993—2002年霍乱弧菌菌株的相关性。方法 60株霍乱弧菌基因组DNA经Not Ⅰ酶切，通过脉冲场凝胶电泳获得电泳图谱，利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果 60株霍乱弧菌被分为39种脉冲场凝胶电泳图谱，聚类分析将大部分菌株分为A、B两群。结论 深圳地区霍乱弧菌存在紧密相关的流行克隆群。霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析，有助于霍乱的主动监测和传染来源追踪。     

脉冲场凝胶电泳分子分型方法用于霍乱弧菌相关性分析

目的用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型方法,分析辽宁丹东和广东珠海两地区从水体和水产品中分离的霍乱弧菌之间的相关性。方法对39株霍乱弧菌用内切酶Not I酶切DNA后进行PFGE分子分型,并在0.5×TBE电泳缓冲液中加入终浓度为3.8 mg/L的硫脲溶液电泳。结果所有39株霍乱弧菌的基因组DNA显示出良好的分型结果,从朝鲜排污口、丹东鸭绿江水体中的鲫鱼、河蟹以及丹东排污口分离出的霍乱弧菌之间的相似度达到100%,说明这些产品之间应为同一个污染源;珠海的大头鱼和鳙鱼之间的相似度达到100%,说明这两者之间应为同一个污染源;珠海鲫鱼中检出的霍乱弧菌和鸭绿江水体中检出的霍乱弧菌之间的相似度达到88.4%,说明这两者之间可能为同一个污染源。结论PFGE技术适用于霍乱弧菌环境样品分离菌株的相关性分析和传染源的追踪。     

脉冲场凝胶电泳用于霍乱弧菌分子流行病学研究

目的：从分子生物学基础上了解同一次流行、不同来源的霍乱弧菌之间的遗传相关性，为有效控制传染源提供依据。方法：采用PCR技术对2005年分离的70株霍乱弧菌检测CT基因后，进行PFGE分型研究。结果：分离自患者01、0139群霍乱弧菌均有CT基因，而分离自外环境1株01群稻叶菌株及1株0139菌株CT基因为阴性。所试菌株PFGE分型共呈3大亚类8种带型。结论：霍乱流行期间分离于患者的霍乱弧菌PFGE图谱基本一致，与外环境分离的非流行株在分化关系上较远。     

疑似霍乱弧菌鉴定及分子分型检测

目的 对北京市某医院肠道门诊2株疑似霍乱弧菌进行鉴定,检测其主要毒力基因,并分析其基因型别特征.方法 利用细菌生化鉴定条(API 20 E)进行生化鉴定,玻片凝集法确定其血清型别,应用PCR及测序技术分析其16 S rRNA基因;PCR检测其8个主要毒力基因,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析其基因型别.结果 经鉴定,该2株疑似霍乱菌株均为非O1非139群霍乱弧菌,经16 SrRNA分析与美国国家生物技术信息中心数据库中霍乱弧菌相似性达100%,均包含毒力基因hylA、ompW和toxR,PFGE结果显示2株菌具有完全不同的带型.结论 2株疑似霍乱弧菌为非O1非139群霍乱弧菌,其致病因素与(hylA)、(ompW)、(toxR)毒力基因有关,并且2株菌遗传关系较远.     

扩增片段长度多态性分析用于霍乱弧菌分子分型的方法建立和应用评价

目的建立霍乱弧菌的基于红外荧光标记引物的扩增片段长度多态性(AFLP)分型方法,评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)和AFLP对霍乱弧菌的分型能力。方法选择PFGE带型均不相同的47株霍乱弧菌作为评价菌株,建立AFLP对于霍乱弧菌的分型方法;确定操作程序后选择83株分离自1962-2005年11个省的霍乱弧菌,进行AFLP和PFGE对于霍乱弧菌分型能力的比较。AFLP分型方法采用了红外荧光标记PCR引物,利用LI-COR4300自动测序仪完成电泳、SagaMX软件对电泳图谱进行编辑。PFGE采用PulseNet提供的标准化程序。结果AFLP用于霍乱弧菌分型时选择性引物携带碱基数为1,最优引物组合为EcoRⅠ-G／MseⅠ-T,AFLP分型实验的重复性达到99．2％。AFLP将83株霍乱弧菌分为52个型别,D值为0．9545;PFGE将此83株菌分为44种带型,D值为0．9251。结论优化固定了AFLP对于霍乱弧菌的分型程序,重复性好;AFLP比PFGE具有更好的分型能力,能够用于分离菌株的分子分型。结合已成为实验室网络监测标准分析方法的PFGE,可对分离株做更细致的分型比较。     

用脉冲场凝胶电泳方法对O139霍乱弧菌分型的研究

目的：利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术探讨O139群霍乱弧菌的分子分型方法。方法：用SfiⅠ酶和NotⅠ酶切O139群霍乱弧菌染色体DNA，经脉冲场凝胶电泳进行片段分离。结果：14株O139群霍乱弧菌经SfiⅠ酶切后电泳分离可得一个PFGE型，用NotⅠ酶切电泳可分为2个PFGE型。结论：脉冲场凝胶电泳技术分析O139群霍乱弧菌，分型发现微小差别有助于分析追踪疫情和来源。     

上海市长宁区2017年肠炎沙门菌多重耐药和分子分型研究

【目的】了解上海市长宁区2017年肠炎沙门菌的分子分型结果及抗菌药物耐药情况。【方法】对2017年上海市长宁区的感染性食源性病原菌监测标本进行沙门菌的分离鉴定、血清分型,检出33株肠炎沙门菌,运用国家致病菌识别网技术手册(2017年)的分子分型方法进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型,使用微量肉汤稀释法进行抗菌药物耐药性的测定。【结果】33株肠炎沙门菌共分为11种带型,优势带型集中在Clade1中,共计30株。耐2种及2种以上抗菌药物的有22株,耐6种及6种以上抗菌药物的19株,并出现2株四代头孢全耐药。【结论】长宁区肠炎沙门菌多重耐药现象比较普遍,PFGE型别差异较小,相同PFGE型别的菌株多重耐药表型相近。     

河南省2009-2011年伤寒副伤寒沙门菌分子分型与耐药研究

目的 分析2009-2011年河南省伤寒副伤寒沙门菌临床分离株耐药状况与PFGE分型特征。方法 根据PulseNet公布的伤寒副伤寒沙门菌PFGE分型操作规程与美国临床实验室标准协会(CLSI)沙门菌K-B法药敏测试方案,对2009-2011年分离自河南省监测哨点医院78株伤寒副伤寒沙门菌进行抗生素药敏测试与PFGE分子分型。结果 78株伤寒副伤寒沙门菌对8类13种抗生素均有不同程度的耐药,62株为多重耐药菌株(79.5%),其中耐2～3种4株(5.1%),耐5～8种41株(52.6%),耐9～10种14株(17.9%),耐11～12种3株(3.8%);菌株对头孢类、喹诺酮类等5类抗生素耐药率总体呈上升趋势。经XbaⅠ酶切与PFGE后,获得14种带型,每种带型包含菌株数1～47株不等,相似度为66.03%～100.00%。结论 2000-2011年河南省临床分离的伤寒副伤寒沙门菌耐药状况普遍比较严重,PFGE带型呈现多样性的同时又具有较显著的优势带型特点,部分带型与其对应的耐药谱具有一定的关联性和聚集性。     

上海市山夫登堡沙门菌流行特征和分子分型研究

明,菌株存在遗传克隆的不稳定性和传播途径的复杂性.     

2015-2021年北京市霍乱弧菌病原学和流行特征分析

目的:分析2015-2021年北京市霍乱弧菌的病原学和流行特征,为霍乱防控提供参考。方法:对北京市2015-2021年分离到的霍乱弧菌,进行血清分型、毒力基因检测和PFGE实验;对收集的霍乱病例流行病学和临床资料,用描述性流行病学方法分析其流行特征。结果:北京市2015-2021年共分离76株O1群霍乱弧菌（来源分别为...     

广东省2014年食源性副溶血弧菌病原学特征分析

目的 了解2014年广东省食源性副溶血弧菌分离株的血清型别、抗生素敏感性、毒力基因携带情况以及分子分型特征。方法 对60株副溶血弧菌分离株进行血清分型、抗生素敏感性试验及检测耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh),并进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列(MLST)分型。结果 60株分离株可分为13个血清型,主要型别为O3:K6、O4:K8、O1:K36和O4:KUT;对氨苄西林、磺胺复合物和头孢噻吩的耐药率分别为100.0%、43.3%和28.3%,有56.7%(34/60)的菌株对2类及以上抗生素同时耐药,2株菌对3类抗生素同时耐受。毒力基因PCR检测发现,有63.3%(38/60)的分离株为tdh⁺trh^-菌株,仅1株为tdh⁺trh+菌株。分子分型显示,经NotⅠ酶消化后,60株副溶血弧菌可产生48个PFGE谱型,可分为3个聚类(Cluster A、B和C)。其中Cluster B的菌株主要分离自食源性疾病监测中心散发病例,血清型以O3:K6为主,PFGE谱型的相似度在62.6%～100.0%;Cluster C主要是由4株O4:K8型菌株组成,谱型相似度为56.7%～62.5%。60株菌MLST分型可分为26个ST型,其中33株菌为ST-3型,主要是O3:K6和O1:K36菌株;4株O4:K8菌株聚集成另一个不同于ST-3型的相对优势的菌群。结论 2014年广东省副溶血弧菌菌型多样性可能是疾病高发的原因之一,O4:K8型菌株的分子特征与其他优势血清型别明显不同,应高度警惕该型菌株引起暴发的可能。     

深圳市2007--2008年腹泻病副溶血弧菌监测及分子特性分析

目的 了解深圳地区2007年和2008年腹泻病副溶血弧菌感染状况和临床分离株的分子生物学特征.方法 4个哨点监测医院每月至少对80份腹泻病例的粪便样本进行致病菌分离培养.对所分离的361株副溶血弧菌进行血清型分型和两个主要毒力基因tdh和trh的检测.对2007年8月和2008年9月6个疑似腹泻暴发地点的60株O3:K6型副溶血弧菌分离株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型.结果 4个哨点临测医院共检测4384份标本,分离出361株副溶血弧菌,361株副溶血弧菌分属于28种不同的血清型,其中O3:K6型占67.90%,其次是O4:K8和O1:KUT血清型,所占比例分别为7.50%和6.10%.深圳地区腹泻病副溶血弧菌临床分离株主要是tdh+trh-菌株,361株菌株中有337株是tdh+trh-菌株,11株为tdh-trh-菌株,13株为tdh+trh+菌株.60株副溶血弧菌分型得到20种图谱类型,分别属于3个克隆群.分离自同一个地点的副溶血弧菌菌株具有相同的PFGE图谱,来自不同年份的菌株仅有部分菌株有相同的PFGE图谱.结论 深圳地区腹泻患者的副溶血弧菌分离菌株主要以O3:K6型为主,大部分菌株携带tdh基因,少数携带trh基因.来自6个地点的副溶血弧菌都具有相同的PFGE图谱,说明该地区存在副溶血弧菌腹泻病的暴发.但2007年和2008年菌株的PFGE图谱又不相同,说明副溶血弧菌的来源存在多样性.     

广东省和广西壮族自治区部分地区2014-2016年宋内志贺菌病原学特征分析

目的 了解2014-2016年广东省和广西壮族自治区部分地区宋内志贺菌暴发分离株及散发分离株的病原学特征。方法 对2014-2016年广东省和广西壮族自治区柳州市分离的14株宋内志贺菌暴发菌株和6株散发菌株进行抗生素敏感性试验和PFGE分析,并选择其中6株代表菌株进行全基因组测序,与NCBI上获取的51株国内外宋内志贺菌的基因组进行遗传进化分析。结果 抗生素敏感性检测结果显示,试验菌株对氨苄西林、四环素、庆大霉素、复方新诺明和萘啶酸有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南完全敏感。PFGE分子分型显示,不同地区不同来源的分离株之间PFGE指纹图谱有很高的相似度（93.2%）,基于全基因组的遗传进化分析显示,广东省和广西壮族自治区柳州市的宋内志贺菌分离株同处在一个进化分支上,与来自韩国的菌株亲缘关系最为接近。结论 广东省和广西壮族自治区部分地区分离的宋内志贺菌对常用抗生素具有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南有较高的敏感性。试验菌株之间具有相似的PFGE指纹图谱,遗传进化关系相近。     

非O1/O139群霍乱弧菌致肝硬化失代偿期患者血流感染1例

患者,男性,58岁,乙型肝炎后肝硬化失代偿期、2型糖尿病12年,近1个月再发腹胀、水肿,尿少入院。住院期间患者寒战、发热,取血标本进行培养,选用头孢哌酮/舒巴坦经验性抗感染治疗。确诊非O1/O139霍乱弧菌引起的血流感染,药敏试验提示头孢哌酮/舒巴坦敏感后,继续使用当前药物,头孢哌酮/舒巴坦由3 g q12h改为3 g q8h治疗。10 d后患者无发热,血培养和粪便霍乱弧菌培养阴性,好转出院。     

非O1群非O139群霍乱弧菌血流感染的诊疗及防控2例报告

目的 对2例血流感染患者血培养标本分离的弧菌属进行鉴定和药敏试验,分析非O1群非O139群霍乱弧菌(NOVC)的微生物学特性,为霍乱弧菌感染的诊断和防控提供依据。 方法 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、API细菌生化反应鉴定卡、VITEK 2 Compact鉴定仪和16S rRNA基因测序鉴定2株弧菌分离株,并进行血清学分型、毒力基因分子检测和耐药表型检测。 结果 2株菌株均鉴定为霍乱弧菌,血清学试验确定为NOVC,毒力基因ctxAB检测阴性;药敏试验显示1株菌对氨苄西林、阿奇霉素、多西环素和氯霉素敏感,对四环素和复方磺胺甲唑耐药,另一菌株对所有检测抗菌药物均敏感。 结论 NOVC所致的血流感染在中国少有报道,完善血培养标本分离霍乱弧菌的准确鉴定、分型和耐药表型检测,对诊断、治疗和防控霍乱弧菌感染具有重要价值。     

Comparative study of three different DNA fingerprint techniques for molecular typing of Shigella flexneri strains isolated in Romania

In this study, 97 epidemiologically unrelated Shigella flexneri strains isolated during 1994 (69 isolates) and 1997 (28 isolates) were characterised by ribotyping, enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-based PCR typing, and pulsed-field gel electrophoresis. Number of strains belonging to each of the six serotypes is selected equal to their distribution in Romania. The isolates comprise 24 ribotypes based on combination of two restriction patterns obtained with HindIII and PstI, respectively, 7 enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR types, and 92 XbaI pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) patterns grouped in 31 pulsotypes at Dice coefficients of 85% similarity. We find no significant difference in the distribution of isolates collected during the two periods. Macrorestriction analysis by PFGE offers maximal discrimination. There seems to be little genetic variability among circulating S. flexneri strains of serotype 2a, suggesting that even a combination of several molecular techniques, including PFGE, could not easily differentiate an outbreak strain from temporally associated independent isolates.     

丰台区2013年水产品及腹泻患者中副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型

目的 分析丰台区2013年水产品和腹泻患者分离的副溶血性弧菌分子生物学特征及其两者之间的遗传相关性,建立丰台区副溶血性弧菌分子分型数据库。 方法 对水产品及腹泻患者中分离到的72株副溶血弧菌进行PFGE分子分型,利用BioNumerics 5.10分析软件对图谱进行聚类分析。 结果 50株水产品来源的菌株分成48个PFGE型、22株腹泻患者来源的菌株分成13个PFGE型、对菌株间的相似性进行比较发现8个100%同源的PFGE型,其他菌株的分子特征的同源性均大于50%,水产品和腹泻患者来源的菌株分子特征同源性小于80%。 结论 丰台区2013年腹泻患者分离株与水产品分离株间PFGE带型具有相似性,但是两者间的关联需要进一步流行病学证据支持。水产品来源菌株基因型呈多态分布,腹泻患者菌株整体没有发现明显优势菌群。     

江苏省2012-2015年伤寒/副伤寒沙门菌耐药及分子分型研究

目的 回顾性分析2012-2015年江苏省伤寒/副伤寒沙门菌的耐药表型和分子分型特征。方法 采集江苏省伤寒/副伤寒监测病例的血液和粪便标本,分离培养伤寒/副伤寒沙门菌后进行生化鉴定和血清分型;采用Kirby-Bauer纸片法检测菌株对抗菌药物的敏感性;应用PFGE技术对伤寒和甲型副伤寒沙门菌进行分子分型。结果 134株伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌对萘啶酸的耐药率最高,分别为61.2%和86.7%,其余抗生素的耐药率均低于15.0%。伤寒和甲型副伤寒沙门菌中只耐1种抗生素的菌株最多,多重耐药菌在伤寒沙门菌中占2.6%,而在甲型副伤寒沙门菌中占13.3%。2015年伤寒沙门菌的全敏感菌株构成比较2012年增加了44.3%,同年副伤寒沙门菌中出现了耐5种和6种抗生素的多重耐药株。甲型副伤寒沙门菌可分为8种PFGE型别,多重耐药株与其他菌株条带相似性低,不同型别与耐药谱有对应关系;伤寒沙门菌可分为68种PFGE型别,不同型别间变异度较大,与耐药谱无对应关系。结论 2012-2015年江苏省伤寒/副伤寒沙门菌对抗生素的耐药性总体随时间降低,耐药种类数有所增加。伤寒沙门菌株PFGE带型呈现多样性,无耐药谱对应性;而甲型副伤寒菌株PFGE带型较少,有耐药谱对应性。需要加强重点地区重点型别菌株的监测。