肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。     

肠道病毒71型SHZH03结构蛋白基因的遗传进化分析

目的对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(台湾98年、日本99年、及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的结构蛋白基因进行遗传进化分析。方法在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA-STAR软件对结构蛋白基因进行遗传进化分析。结果SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。结论我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年EV71大规模流行时的毒株。     

表达肠道病毒71型VP1蛋白的重组乳酸菌构建及免疫效果评价

目的 基于乳酸菌表达系统构建可以表达肠道病毒71型（EV 71）主要抗原蛋白VP1的重组乳酸菌并评价其诱导机体产生黏膜及体液免疫的能力。方法 通过RT-PCR的方法扩增EV 71主要抗原蛋白VP1,并使用pNZ8148乳酸菌表达载体构建pNZ8148-EV 71 VP1重组质粒,通过电转化的方法将重组质粒转化到NZ9000食品级乳酸菌中从而构建NZ9000/pNZ8148-EV 71 VP1重组乳酸菌,并使用Nisin进行诱导表达以及使用Western-blot方法检测EV 71 VP1蛋白的表达情况。通过小鼠口服试验以及ELISA检测方法检测NZ9000/pNZ8148-EV 71 VP1重组乳酸菌诱导机体产生IgA及IgG的抗体水平。结果 成功构建了NZ9000/pNZ8148-EV 71 VP1重组乳酸菌,经过Western-blot结果表明,该重组乳酸菌经10 ng/mL的Nisin诱导表达4 h,可以在破碎菌体后的上清中检测到EV 71 VP1蛋白表达。并且诱导后的重组乳酸菌通过口服后可以刺激机体的黏膜与体液免疫反应。结论 EV 71 VP1蛋白作为主要抗原蛋白,可以通过构建重组乳酸菌的方式诱导机体产生黏膜与体液免疫反应。     

EV71亚单位VP1的原核表达、纯化及免疫原性分析

目的原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)亚单位VP1蛋白,分析其免疫原性。方法采用PCR技术扩增EV71 VP1(AB204852.1)基因序列,构建重组质粒p ET32a(+)-VP1并转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His-VP1融合蛋白,将表达的蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化、TGE液复性后免疫新西兰大白兔,制备抗VP1的抗血清,用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组工程菌p ET32a(+)-VP1/BL21(DE3)高效表达了相对分子质量约为42 k D的VP1融合蛋白,蛋白经纯化复性后免疫新西兰大白兔所得抗血清效价大于1︰625 000。结论原核表达系统p ET32a(+)/BL21(DE3)能高效表达EV71亚单位VP1融合蛋白,蛋白经纯化复性后具有良好的免疫原性,为进一步研制以双歧杆菌为抗原载体的新型疫苗奠定了基础。     

肠道病毒71型疫苗研究进展

肠道病毒71型主要引起手足口病,目前尚无针对手足口病的疫苗和有效抗病毒药物.本文对肠道病毒71型的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、表位肽疫苗和VLP疫苗研制现状进行了综述.     

肠道病毒71型研究进展

<正>肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71病毒)是人肠道病毒中的一种,可以引起多种临床表现,包括皮肤、内脏和神经系统症状,多数患者症状较轻,少数患者可以转变为脑干脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿,被认为是自脊髓灰质炎病毒消除后,一个重要的嗜神经组织的肠道病毒~([1])。EV71病毒自1969年从美国加利福尼亚州发现以来,在很多地区和国家出现散发病例或小规模的暴发,21世     

南京市2012年-2013年肠道病毒71型分离株VP1基因特性分析

目的了解南京地区肠道病毒71型流行株的遗传学背景。方法采集2012年-2013年手足口病患者咽拭子样本,经特异性逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定EV71病毒核酸阳性者进行细胞接种分离病毒。选取阳性分离株扩增其VP1完整编码区全长基因并进行序列测定,利用生物信息学软件对序列加以分析,构建序列遗传亲缘关系树。结果共分离得到14株EV71毒株,经VP1全长基因测序分析发现,所分离病毒VP1区核苷酸与EV71病毒A型代表株同源性为79.6%~81.3%,与B型代表株的同源性为81.7%~84.7%,而与C型代表株的同源性明显较高,为86.0%~95.2%,其中与C4代表株(AY895144)的同源性最高,为93.8%~95.2%。进化树分析发现本地流行株与上海、安徽等地区流行株的亲缘较近,而与台湾地区流行株亲缘较远。相应的氨基酸位点分析也表明符合C基因型的氨基酸模式。结论南京地区2012年-2013年肠道病毒71型的流行株主要为C4亚型,与上海和安徽地区流行株亲缘较近,可能具有同一来源。     

肠道病毒71型所致疾病及其流行病学特征

目的 探讨肠道病毒(EV)71型(EV71)所致疾病的流行特征.方法 对江苏省及北京市7个研究现场10 158名6～35月龄儿童进行为期1年的队列随访,系统调查EV71所致疾病及其流行病学特征.结果 EV71感染所致疾病发病密度为15.17/千人年,其中手足口病、疱疹性咽峡炎、呼吸系统疾病、消化系统疾病和其他疾病分别占82.00％、2.67％、13.33％、1.33％和0.67％.病例以12～ 23月龄婴儿为主(58.67％),不同月龄组发病密度之间的差异有统计学意义(f=7.789,P=0.020).发病时间主要集中在4-6月;重症病例9例(男性7例,女性2例),占病例总数的6.00％,均为手足口病病例;3个年龄段(6～11、12～23、24～35月龄)重症病例分别为1、7、1例.手足口病、非手足口病病例的病程M值分别为9d和6d,差异有统计学意义(Z=-4.000,P＜0.001),排毒周期的M值分别为9d和11d,差异无统计学意义.结论 EV71感染所致疾病以手足口病为主,主要影响婴幼儿,且具有一定的季节性.     

肠道病毒71型感染的临床研究

肠道病毒71型(EV71)自1969年首次分离出来后,已在世界范围内引起了数次爆发流行.EV71是手足口病的主要病因,常引起多种与神经系统相关的严重疾病.目前缺乏有效的抗病毒治疗和高效疫苗,故早期发现和检测尤为重要.此文就EV71感染的流行情况、临床表现、检测技术及治疗等研究作了介绍.     

肠道病毒71型的分子流行病学现况

目的 肠道病毒71(Enterovirus 71,EV71)是导致婴幼儿感染的重要病原之一,可引起多种疾病,具有较广的疾病谱.EV71可引起大规模的手足口病(Hand,Foot,and Mouth Disease,HFMD)爆发,也可引起脑干脑炎等神经系统感染,导致死亡.现对EV71分子流行病学研究方法和研究进展进行综述,总结和分析了EV71各种基因型/亚型毒株的进化史及进化地位,对国际上EV71各种基因型/亚型的流行现况进行了概括总结.     

肠道病毒71型手足口病研究进展

手足口病重症和死亡病例多由肠道病毒71型引起,为降低手足口病重症和死亡的发生率,科学防控手足口病,本文就肠道病毒71型手足口病的流行病学、诊断、临床治疗、快速诊断试剂开发进展、疫苗研发进展及手足口病防控亟待解决的问题等方面内容进行综述。     

重组肠道病毒71型反向遗传系统构建

目的 利用反向遗传技术分别对肠道病毒71型（EV71）强毒株SDLY107和弱毒株SDLY1的3C和3CD编码区进行置换,拯救重组病毒。方法 使用PCR技术得到重组片段3C（1）-3D-3'UTR（107）和3CD（1）-3'UTR（107）,并克隆入pMD19-T。利用双酶切、T4连接酶将两种重组3CD-3'UTR分别置换入本室构建并保存的EV71的SDLY107株的感染性cDNA克隆pMD19-T-107,得到重组pMD19-T-107后,将其线性化并转染入横纹肌肉瘤（RD）细胞,盲传得到重组病毒107（1-3C）和107（1-3CD）。对收获病毒进行鉴定。结果 构建了重组EV71全长cDNA克隆;RNA转染并盲传至第3代,36 h后RD细胞出现细胞病变（CPE）,48 h出现明显的CPE,成功拯救重组病毒SDLY107（1-3C）和SDLY107（1-3CD）;重组病毒产生的CPE更接近SDLY107。结论 成功构建了重组EV71反向遗传系统,拯救了重组病毒SDLY107（1-3C）和SDLY107（1-3CD）,为进一步研究3C与3D蛋白在EV71致病机制中的作用提供基础。     

2008年珠海肠道病毒71型分子流行病学研究

目的 通过扩增VP1节段的核苷酸序列,对2008年珠海暴发流行的EV71进行种系进化分析.方法 选取10例手足口病暴发流行中的EV71阳性病例标本用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,由生物技术公司在AB13730型自动测序仪上测序,序列结果用Claxter、DNA Star、Mega软件进行分析.结果 本文的10株病毒与C基因型代表株比较接近,核苷酸同源性在88.2%～99.2%之间,氨基酸同源性在98.7%～99.7%之间;尤其与C4基因型最为相近,与C4基因型相比较核苷酸同源性在97.6%～99.2%之间,氨基酸同源性在99.3%～99.7%之间;而与A、B基因型代表株比较差异较大,核苷酸同源性只在81.8%～84.4%之间,氨基酸同源性在94.6%～98.0%之间;说明本文的10株病毒皆属于EV71病毒C基因型、C4亚型.结论 珠海和新会的病毒株可能与阜阳和浙江分离的EV71病毒有相同的起源,均属于C4亚型,并且C4亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播,因此加强各地流行的EV71病毒基因特征分析,进而探索EV71病毒的可能进化途径,对于肠道病毒的基础研究和防范EV71在中国的大规模暴发与流行具有重要意义.     

深圳市2002年肠道病毒71型的监测

肠道病毒 71型 (enterovirus 71,EV71)是肠道病毒的一个血清型 ,我们于 2 0 0 2年对疑似肠道病毒感染者进行了EV 71的监测。1.材料与方法 :收集深圳市有手足口病和无菌性脑炎、脑膜炎、心肌炎、脑干脑炎等疑似肠道病毒感染症状的儿童粪便标本 12 1份 ,保存于 -80℃。毒株采用EV 71 SHZH98,其全基因组已提交国际核酸与蛋白数据库 (GenBank ,AF3 0 2 996)。病毒RNA提取使用宝灵曼HighPureViralRNA试剂盒。RT PCR利用一个共用的上游和两个不同的下游EV 71病毒特异性引物 ,序列分别为 5’ AAGGGGTG GTACTGGTACTGGAAGTTC …     

杭州市儿童肠道病毒71型灭活疫苗接种特征分析

目的分析杭州市2014-2017年出生儿童肠道病毒71型(EV71)疫苗接种情况,为今后EV71疫苗的接种实施提供依据。方法从杭州市儿童免疫规划信息管理系统中导出2014-2017年出生儿童EV71疫苗接种数据,运用描述流行病学方法进行分析。结果在550888名2014-2017年出生儿童中,第1剂次EV71疫苗接种率为29.15%,2014-2017年各年出生儿童接种率分别为11.55%、22.13%、37.93%和42.16%,城区、城乡结合部、郊县儿童接种率分别为43.85%、20.78%和27.87%。第2剂次接种率为26.59%,2014-2017年各年龄组儿童接种率分别为10.14%、20.03%、35.23%和38.31%,城区、城乡结合部、郊县儿童接种率分别为40.51%、18.59%和24.61%。EV71疫苗主要接种年龄为1岁,其中10~13月龄为接种高峰。结论杭州市EV71疫苗接种率虽逐年上升但有待进一步提高,接种月龄偏晚,需加强EV71疫苗接种宣传,使儿童尽早完成接种获得免疫保护。     

肠道病毒71型致中枢神经系统感染研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染多发生于<5岁幼儿,已成为目前全球范围内取代脊髓灰质炎的最重要的中枢神经毒性病原,严重威胁婴幼儿的健康。近年来,EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势,特别是EV71更易导致中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染,是手足口病患儿死亡的主要原因,已引起广泛的关注。