广西玉林市2005—2012年狂犬病病原学监测及病毒N基因特征分析

目的分析2005—2012年广西玉林市狂犬病病原学监测结果及病毒N基因遗传变异特征,为狂犬病防控提供科学依据。方法 2005—2012年在广西玉林市采集犬脑组织及临床诊断人狂犬病病例的唾液进行病原学检测,检测阳性标本进行N基因核苷酸序列测定、同源性比较和种系发生分析。结果共采集、检测外观健康犬脑组织728份、临床诊断人狂犬病病例唾液33份,RT-PCR检测阳性率分别为0.96%(7/728)和51.52%(17/33)。获得5条犬源、6条人源狂犬病病毒株N基因全序列。该11条序列之间的核苷酸同源性为94.7%~100.0%,与广西以往分离株GX01的核苷酸序列的同源性为94.5%~98.4%,与疫苗株CTN株的同源性为94.6%~99.7%。进化树分析显示,犬源株和人源株病毒N基因亲缘进化关系很近,处于同一分支,都属于基因Ⅰ型狂犬病病毒。结论从病原学和病毒分子水平证实玉林市外观健康犬携带狂犬病毒及17例临床诊断病例为确诊病例,其病原为狂犬病病毒基因I型,阳性带毒犬的流动是造成本病传播和扩散的主要因素,也是造成该地区疫情高发的重要原因之一。     

浙江省山区狂犬病新宿主动物调查

目的 了解浙江省狂犬病疫区野生宿主动物种类及感染状况.方法 采集浙江省丽水市和杭州市淳安县猫、鼬獾、黑线姬鼠、跳麂、野猪脑组织标本共160份,分别取大脑、中脑、小脑和海马回部位组织,用直接免疫荧光试验(DFA)检测狂犬病病毒特异性抗原和RT-PCR方法检测狂犬病病毒特异性核酸,确定阳性标本.结果 脑组织抗原印片经特异性抗狂犬病病毒核蛋白(NV)单克隆抗体免疫荧光染色后在荧光显微镜下可见大量的苹果绿荧光颗粒;狂犬病病毒NP特异性目的基因Nested-PCR得到与预期结果大小一致的扩增产物,两种方法 同时检出狂犬病病毒阳性的野生宿主动物脑组织标本5份,其中鼬獾脑组织阳性标本4份,阳性率为8.33%(4/48);黑线姬鼠脑组织阳性标本1份,阳性率为1.75%(1/57);猫、跳麂、野猪脑组织未检出阳性标本.结论 在浙江省生物多样性的山区检测出狂犬病病毒感染阳性的野生动物鼬獾和野鼠,从病原学角度说明鼬獾和野鼠可能是人间狂犬病的传染来源和狂犬病病毒的宿主动物.     

广西狂犬病病毒与狂犬病疫苗株N基因序列分析

目的了解广西狂犬病病毒（RABV）街毒株与疫苗株N基因序列的差异,为疫苗使用提供理论依据。方法采用直接免疫荧光法（DFA）和巢式RT—PCR法检测,测定病毒N基因序列全长,同时根据N基因序列同源性及系统进化树比较,分析广西近年流行的RABV与国内外10株疫苗代表株N基因序列之间的差异。结果DFA法阳性率为8．84％（350／3961）,RT—PCR法检测阳性率1．29％（51／3961）,获得N基因全序15份;15份N基因核苷酸与氨基酸序列同源性为89．40％。100％和98．40％~99．80％;广西15份（RABV）与国内外10株疫苗代表株N基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85．70％～99．70％和94．90％～99．80％,与中国CTN疫苗株N基因的核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为89．60％,99．70％和98．40％。99．80％。N基因系统发生树分为两大分支,15份（RABV）与中国人用CTN株构成第一分支,其余的疫苗毒株构成第二分支。结论广西犬间流行的RABV与中国人用CTN疫苗株N基因序列同源性最高、亲缘关系最近,在广西地区使用CTN疫苗株效果可能较好。     

宁波市狂犬病病毒NB0901株核蛋白基因的序列分析

目的通过RT-PCR方法对2009年宁波市狂犬病病毒分离株（NB0901）的N基因扩增并测序,了解宁波地区狂犬病病毒的流行特点。方法运用RT-PCR方法和序列测定方法获得NB0901株的N基因序列,并在核苷酸和氨基酸水平与疫苗株（3aG和CNT-1）进行同源性比较,同时进行遗传进化分析。结果狂犬病病毒NB0901株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在86.6%～90.1%和95.5%～98.8%之间。NB0901株N蛋白的抗原表位与疫苗株相比后发现在NⅠ和NⅡ抗原表位存在突变。而在Th细胞表位上,NB0901株与CNT-1株完全一致,与3aG株相比变异较大。进化结果表明NB0901株属于狂犬病病毒Ⅰ群中的A亚型。结论狂犬病病毒NB0901株和当前疫苗株虽同属于Ⅰ群,但是与疫苗株相比存在差异,从氨基酸序列水平上分析,CNT-1株较3aG株更能有效保护流行毒株感染。     

狂犬病病毒G蛋白基因重组研究

目的探讨狂犬病病毒G蛋白基因重组及其对病毒属性的影响。方法收集GenBank狂犬病病毒G蛋白基因全序列,经过MEGA4.1对齐、去除空位处理后,运用RDP 2.0软件进行筛查,然后利用SimPlot 3.5.1软件进行相似性分析和BOOTSCAN分析,对基因重组加以验证,并构建最大似然进化树,观察重组片断拓扑结构的改变。结果利用RDP 2.0软件共检测到3个重组序列,分别是DQ849069、AF334789与AY009100。相似性分析和BOOTSCAN分析确认重组序列DQ849069重组特征明显,重组片段为746～1 566nt,重组片断最大似然进化树的拓扑结构也发生了相应改变。而AF334789与AY009100未发现有意义重组信号;地缘分析表明DQ849069是基因重组的产物。结论狂犬病病毒G蛋白在进化过程中存在重组,重组事件对未来病毒毒力的影响有待于深入研究。     

云南省保山市人间狂犬病调查及病毒分子生物学特征分析

目的 了解云南省保山市发生2例狂犬病患者的流行病学特点,根据病原分子生物学特征分析可能的传染来源.方法 采用狂犬病个案调查表进行流行病学调查,采集狂犬病死者脑组织标本,用直接免疫荧光试验(DFA)检测狂犬病病毒抗原,用RT-PCR法检测狂犬病病毒核酸,测定狂犬病病毒P、M和N基因全序列并根据其同源性比较及系统进化树进行分子流行病学分析.结果2006年7月保山市隆阳区发生1例人间狂犬病,2007年4月腾冲县发生1例狂犬病.2例患者犬伤暴露程度均为Ⅲ度.2例死亡病例均采集到脑组织(编号为CYN0601H和CYN0701H),经DFA和RT-PCR两种实验室方法检测确诊为狂犬病病毒阳性.CYN0601H和CYN0701H与国内外狂犬病病毒的P、M和N基因核苷酸和推导氨基酸序列同源性分析显示,CYN0601H和CYN0701H与泰国分离株的同源性最高.系统进化分析显示,2株病毒标本亲缘关系很近,同属于狂犬病病毒基因1型,且与泰国病毒株有较近的亲缘关系.结论从病原学和病毒分子水平证实云南省保山市2例患者均为狂犬病,保山市狂犬病病毒流行株可能为境外传人,应加强云南省边境地区狂犬病防制工作.     

浙江省丽水市首次狂犬病动物宿主感染率调查

目的调查浙江省丽水市狂犬病病毒在动物宿主中的感染率，为防制该病提供科学依据。方法收集丽水市狂犬病疫区犬和猫的脑组织标本，用DFA和RT～PCR方法分别检测狂犬病病毒抗原及核酸，确定阳性标本。结果犬脑组织阳性标本9份，分动物宿主类别时其阳性率为6．72％，不分动物宿主类别时其阳性率为6．16％，猫脑组织中未检出阳性标本。结论首次在丽水市用免疫学和分子生物学方法进行狂犬病病毒的实验室检测，狂犬病病毒在丽水狂犬病疫区的动物宿主（尤其是犬）之间相互传播，犬狂犬病疫情存在扩散的现象。     

广西狂犬病病毒M基因序列分析

目的 探讨广西13株狂犬病病毒M基因遗传变异特征及其与狂犬病在广西流行的关系.方法 用直接免疫荧光法(DFA)检测2006～2008年广西地区收集到的3961份犬脑组织标本,将榆测结果为阳性的脑组织标本进行RT-PCR扩增,双向测序M基因核苷酸序列,进行生物信息学分析.结果 DFA法检测阳性率为8.84%(350/39...     

人呼吸道合胞病毒分离株基质蛋白基因特征分析

目的 阐明人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV）A、B亚型病毒分离株的基质蛋白（Matrix Protein,M）编码基因特征。方法采用逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transciption-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）对北京市2004年分离的HRSV代表株（A、B亚型各2株）进行M基因全长序列扩增、测序,并和基因库下载的所有HRSV的M基因全长序列进行对比和分析。结果2株HRsVA亚型分离株与A亚型Long株（标准株）M基因之间的核苷酸和氨基酸差异,分别为24、26个（3．1％～3．4％）和1个（0．39％）。2株HRSVB亚型分离株与B亚型参考株9320的M基因之间的核苷酸和氨基酸差异,分别为16、19个（2．1％、2．46％）和2、1个（0．78％、0．39％）。所测定的北京市4株HRSV分离株和从基因库下载的M基因全序列之间的核苷酸和氨基酸差异,分别为24～119个（3．1％～15。4％）和1～21个（0．39％～8．2％）。结论M基因在HRSV基因组中是较为保守的基因之一,A或B亚型的型内差异相对较小;但A、B亚型之间有较大差异,变异平均分配于整个M基因中。M基因的这些基因特征使其可以作为A、B亚型基因检测分型诊断的候选靶基因。该研究为HRsV基因快速诊断试剂的研制提供了基因信息学数据。     

广西狂犬病病毒分子流行病学研究

目的分析广西狂犬病毒的分布和来源,从病原学角度分析广西狂犬病疫情高发的原因。方法2005年9月~2006年4月在广西玉林、贵港、柳州、来宾、南宁和河池等6市共收集健康犬脑标本1 352份,用直接免疫荧光法(DFA)和RT-PCR法检测狂犬病毒,其中22份标本完成狂犬病毒N基因编码区下游720bp核苷酸序列的测定。结果用DFA法检测出阳性标本160份,阳性率为11.83%,RT-PCR检测出阳性标本26份,阳性率1.9%,对其中22份标本完成N基因编码区下游720bp核苷酸序列的测定,核苷酸序列同源性为87.8%~100%,推导氨基酸序列的同源性为97.5%~99.6%,表明广西病毒标本N基因核苷酸序列的变异主要是同义突变。种系发生分析显示,广西病毒标本分为A、B、C群,各群分布范围不同,具有明显地域性特征;中国存在的3群狂犬病毒(CHINA-1、CHINA-2和CHINA-3群)目前在广西均有分布。广西流行的3群病毒来源各不相同:A群可能来源于与广西相邻的湖南、贵州;B群可能由广西北部省区传入;C群是在广西境内循环的毒株。结论广西境内普遍存在狂犬病毒感染犬只,并有外省狂犬病毒的传入,可能是近年广西狂犬病疫情上升的重要原因。     

狂犬病病毒浙江街毒株糖蛋白基因序列分析

目的 测定狂犬病病毒浙江株(鼬獾源和犬源)糖蛋白(GP)基因组全序列,从分子水平比较狂犬病病毒浙江株与其他地区代表性街毒株和疫苗株GP之间的差异.方法 乳鼠接种分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定狂犬病病毒浙江株GP基因核苷酸序列,并进行序列和编码蛋白的比较分析.结果测序获得浙江5株鼬獾源狂犬病病毒和9株犬源狂犬病病毒GP基因序列,全长1575个核苷酸,编码524个氨基酸.浙江病毒株与其他地区街毒株、疫苗株核苷酸和氨基酸序列相似性在82.3%～99.9%和85.1%～99.8%之间,种系分析显示浙汀株均为基因1型,GP编码蛋白无重组,主要抗原位点未出现较大的变异.结论 对GP基因一级结构综合分析表明,在某些区域存在优势抗原表位的可能性较大,可能出现潜在的蛋白质抗原决定簇,浙江株GP基因变异较小,与国内其他地区流行的代表性街毒株相似,但高于其他疫苗株,在基因结构及种系进化关系上存在一定的距离.     

浙江省野生动物鼬獾狂犬病毒全基因组序列测定分析

目的 测定浙江省分离的2株野生动物鼬獾狂犬病毒株全基因组序列,从分子水平进行遗传变异特征分析,了解狂犬病毒在浙江省的流行和变异情况.方法 RT-PCR测定鼬獾狂犬病毒株全基因组核苷酸序列,并进行基因序列和编码蛋白相似性比较及种系发生分析.结果 测序获得2株鼬獾狂犬病毒全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923 nts,leader长58 nts,由5个编码区组成:NP(1353 nts)、PP(894 nts)、MP(609 nts)、GP(1575 nts)、LP(6386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间伪基因ψ长423 nts;trailer长70 nts.核酸BLAST及多序列比对显示,浙江省鼬獾狂犬病毒株全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病毒属特征;鼬獾病毒株负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,编码区基因没有发生重组,编码蛋白仅表现较少的序列变化,多数只发生碱基的替代;中国病毒株之间特别是同种动物狂犬病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,鼬獾狂犬病毒基因组序列相似性在氨基酸水平明显高于核苷酸水平,蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变.结论 鼬獾狂犬病毒与研究中选择的代表性疫苗株或者街毒株的变异位点和变异类型相似,多序列相似性比较和N基因种系发生分析显示,鼬獾狂犬病毒均属于基因1型,具有中国地域性特点,2株野生动物鼬獾狂犬病毒极有可能是存在于自然界中固有的街毒株.     

1株驴源狂犬病毒的分离鉴定及N, G基因序列分析

目的 对武汉市汉南区新分离的1株驴源狂犬病毒(RABV)街毒株的N、G基因进行遗传学分析,比较其与近年来湖北省及周边地区分离的代表性街毒株以及人用和兽用狂犬病疫苗病毒株之间的差异.方法 以直接免疫荧光法检测驴脑组织中的RABV,并将驴脑海马组织研磨后接种乳鼠,观察其发病情况,采用双抗体夹心ELISA法检测驴脑组织及发病乳鼠脑组织悬液中的RABV,然后提取发病乳鼠脑组织RNA,利用RT-PCR扩增RABV的N、G基因,测序后进行遗传学分析.结果 在驴脑组织及发病乳鼠脑组织中检出RABV,该病毒株与近年来湖北省及周边地区分离的代表性街毒株以及国内外人用和兽用狂犬病疫苗病毒株相比,N、G基因核苷酸序列的同源性分别为85.7％～99.1％和82.2％～99.7％,推导的氨基酸序列同源性分别为95.6％-99.8％和87.8％～99.4％,与国内分离街毒株核苷酸和氨基酸的同源性高于疫苗株,且与国内疫苗株CTN-181的同源性要高于国外疫苗株.结论 该病毒株鉴定为驴源RABV,与湖北省及周边地区分离的代表性街毒株及中国人用狂犬病疫苗株CTN-181处于同一个亚群,有较近的系统进化关系.     

Live attenuated rabies virus co-infected with street rabies virus protects animals against rabies

While current rabies post-exposure prophylaxis (PEP) is highly effective, it is costly and the vaccination regimen is complicated, requiring both inactivated vaccines and immunoglobulins. A one-dose rabies vaccine for human PEP remains a long-term goal. Here, we describe development of a highly attenuated rabies virus ERAg3m, with a mutation in the glycoprotein (G) gene and a switch of the G gene with the matrix protein gene in the viral genome. After a one-dose intramuscular vaccination, the ERAg3m virus protected 100% of mice and hamsters from lethal challenge. In co-infections, using a lethal dose of street rabies virus mixed with ERAg3m, 100% of hamsters and 90% of mice survived and were protected against subsequent infection. A mock co-infection, using inactivated commercial human rabies vaccine and a lethal dose of street rabies virus, protected 100% and 40% of hamsters and mice, respectively. In co-infections, when vaccine was administrated in the left leg and challenge virus in the right leg, the ERAg3m virus protected 40% of mice, while the inactivated vaccine showed no protection. Therefore, live attenuated rabies virus when given pre-exposure or co-infected with street rabies virus, is capable of preventing rabies in two different animal models. Overall, this highly attenuated live rabies virus offered better protection than the inactivated vaccine.     

抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体在狂犬病街毒检测中的应用

目的　测试抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体用于间接免疫荧光法检测已确认的狂犬病阳性及狂犬病阴性的动物脑组织标本的灵敏度和特异性。方法　将巴斯德研究所狂犬病参考中心保存的来自不同国家的 6 2份狂犬病街毒动物脑组织标本以及 2 71份法国境内收集的正常动物脑组织标本 ,用上述间接免疫荧光检测 ,并以巴斯德研究所狂犬病参考中心提供的狂犬病毒酶联免疫吸附法、组织细胞分离法及直接免疫荧光法等三个试验作确认试验 ,进行比较。结果　间接免疫荧光法可检测涵盖狂犬病毒 7个基因型在内的所有 6 2份街毒标本 ,对确认为狂犬病阴性的动物脑组织标本检测均为阴性 ,其特异性和灵敏度均达到 10 0 %。结论　抗狂犬病毒核蛋白单抗作为间接免疫荧光法检测狂犬病毒具有良好的应用前景。     

Genetic and antigenic analysis of street strains of rabies virus in GuangxiP.R.China

ＲａｂｉｅｓｗａｓａｓｅｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｉｎＧｕａｎｇｘｉ．Ｉｔｈａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｆａｔａｌｉｔｙｒａｔｅｓａｎｄｎｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｉｎｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ,ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ,ｓｔｉｌｌｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｗａｙｆｏｒｈｕｍａｎｒａｂｉｅｓｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄｒｅｃｅｎｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅ ｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎＮｇ…     

浙江省慈溪市犬类狂犬病病毒携带状况调查及变异研究

目的研究犬类狂犬病病毒的携带状况及变异,为正确有效控制狂犬病疫情提供依据。方法根据狂犬病疫情分布,用分层采样法,采集相关地区犬脑51只,用免疫荧光法、夹心酶联吸附法、小鼠颅内接种试验法及RT-PCR进行检测。分离狂犬病病毒并进行N基因测序。结果在流浪犬只中发现狂犬病毒株(命名CXs)。流浪犬带毒率7.69%,CXs与疫苗株和固定毒株的NJ进化树比较,发现与WZO(H)株100%同源,与狂犬病毒固定毒株相比更接近CTN株(该地区使用的疫苗株)。结论当前使用的狂犬疫苗用于预防狂犬病是可靠的。经狂犬病流行特征和暴露后免疫预防处理分析,加强犬只的管理、免疫,暴露后采用规范清创,正确使用狂犬疫苗,合理使用狂犬免疫球蛋白(或血清)仍是当前防治狂犬病需遵循的原则。     

狂犬病病毒分子流行病学研究进展

狂犬病病毒分子流行病学研究是防控狂犬病暴发的前提.已有的研究成果显示,对狂犬病病毒分子流行病学研究以全基因组测序为好,提高犬狂犬病疫苗免疫覆盖率和建立健全狂犬病疫情预警网络平台可能是扭转我国目前狂犬病高发的关键所在.此文综述了基因序列分析和氨基酸序列分析的狂犬病病毒分子流行病学研究进展.