人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的：构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法：设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到Endostatin cDNA，并在5′端融合编码人胰岛素领带肽序列，经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(-)中，将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(-)/SEND转染HT1080细胞后用G418筛选获得克隆，采用RT-PCR和West-em-blot检测Endostatin的表达。结果：测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确，并且在其5′端融合编码人胰岛素信号肽序列；RT-PCR显示转染后的HT1080细胞可以有效地转录EndostatinmRNA；Westem-blot检测到转染后的HT1080细胞上清有相应的蛋白质，大小为20kD左右。结论：含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(-)/SEND转染HT1080细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外，本研究为Endostatin的功能研究及应用于基因治疗提供基础。     

苦参碱对人HT1080细胞系增殖抑制的体外研究

目的：研究苦参碱（Matrine)对人成纤维肉瘤（HT1080）细胞系生长的抑制效应，并探讨其作用机制。方法：用不同浓度的Mat加入体外培养HT1080细胞中，观察加药后细胞生长数量及其形态的变化；用MTT法检测Mat的细胞毒作用。结果：Mat明显抑制HT1080细胞生长；IC50值为350μg/ml；其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系，结论：Mat能有效抑制HT1080细胞的增殖。     

五倍子酸对人纤维肉瘤HT1080细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究五倍子酸(GA)对人纤维肉瘤HT1080细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别用3.125、6.250、12.500、25.000、50.000和100.000 mg/L的GA处理HT1080细胞48 h后,应用MTT法检测细胞的抑制率;分别以6.250、12.500和25.000 mg/L的GA作用HT1080细胞48 h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,应用免疫细胞化学方法检测GA对HT1080细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。结果:GA对HT1080细胞以剂量依赖的方式抑制其增殖(F=71.214,P<0.001)、诱导其凋亡(F=52.217,P<0.001),并能上调Bax蛋白的表达(F=11.024,P<0.001)、下调Bcl-2蛋白的表达(F=8.741,P<0.001)。结论:GA可能通过上调Bax蛋白的表达和下调Bcl-2蛋白的表达来抑制HT1080细胞增殖和诱导其凋亡。     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的：在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin。方法：一步法抽提胎肝总RNA,RT－PCR扩增endostatin全基因,用T－A克隆技术的构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体。重组质粒分别以PCR,酶切及测序鉴定。电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞,SDS－PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白,MRR法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：RT－PCR获得550bp的特异扩增条带,T－A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确。亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI,Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100％的正确,SDS－PAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/L NacL洗脱的蛋白峰大体外可转异性抑制血管内皮细胞的增殖。结论：在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白。     

内源性血管生成抑制因子Endostatin基因的克隆、表达及活性研究(摘要)

传统的肿瘤治疗手段主要是针对肿瘤实质细胞进行杀灭,但是效果较差.手术一般难以彻底地清除肿瘤,而放疗及化疗由于其对人体毒性的限制,再加上可诱导抗药性的产生,也难以达到令人满意的效果.这样的治疗现状促使科学家另避蹊径,从另一个角度来探讨肿瘤的治疗问题.     

人粒细胞集落刺激因子cDNA的克隆及其在CHO细胞的表达

该文以PKCR6质粒为载体，构建了人体细胞集落刺激因子（hG－CSF）的次级克隆PKCR6－G－CSF，并成功转染CHO细胞，获得高表达、稳定分泌人G－CSF的转基因细胞，为扩大规模基因工程生产重组细胞因子奠定了一定的基础。     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

血管生长抑制因子基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的;获得具有高活性的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ表达,为进一步研究及应用奠定物质基础。方法：用ＰＣＲ法人纤维蛋白酶原ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ基因中,获得Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４）基因,测序验证后,将正确的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（Ｋ１－４）序列,插入Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞ｓｆ９,表达Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ。结果：获得了正确序列Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

肝癌细胞表达差异cDNA克隆的研究

目的：筛选肝细胞癌(HCC)相关基因，探讨其在HCC发病中的临床意义。方法：用差异显示技术对比研究正常肝组织，胎肝组织，HCC组织及癌旁肝组织之间mRNA的表达差异，以肝癌cDNA片段MRG8．2为探针，对10例HCC及癌旁肝组织进行斑点印渍分析，并通过逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测这些标本血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平。结果：获得55个HCC差示cDNA片段，其中24个cDNA片段同时表达于HCC和胎肝组织cHCC差示片段MRG98．2在7例HCC标本中表达阳性(7／10)，癌旁肝组织弱表达(2／10)或元表达。VEGFmRNA在7例MRG98．2阳性表达的HCC标本中6例表达上调。结论：胚胎期某些基因的激活与HCC发生有关，差示片段MRG98．2可能是HCC相关的基因片段，其表达与VEGFmRNA一致，并可能与肿瘤浸润转移及顶后不良有关。     

左旋棉酚对HT1080细胞和HSF细胞的抑制增殖作用

目的:探讨左旋棉酚对人纤维肉瘤细胞HT1080和人皮肤成纤维细胞HSF的抑制增殖作用.方法:采用MTT法检测药物对细胞增殖的抑制率,在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化.结果:左旋棉酚对HT1080细胞和HSF细胞均有抑制增殖作用,呈浓度与时间依赖性.左旋棉酚对HT1080细胞作用24、48、72、96小时的IC50分别为56.6、12.6、9.2、7.0μM,而对HSF细胞作用24、48、72、96小时的IC50分别为192.3、53.6、42.5、19.4μM.随着药物浓度的增加,HT1080细胞数逐渐较少,脱落的细胞逐渐增多.而HSF细胞变化不明显.结论:左旋棉酚对人纤维肉瘤HT1080细胞有明显抑制增殖和选择性杀伤作用.     

金属蛋白酶抑制剂对外源Rac1表达介导的细胞侵袭胶原屏障的影响

目的 体外研究金属蛋白酶(MMPs)抑制剂对外源Rac1基因表达介导的HT1080纤维肉瘤细胞侵袭胶原屏障的影响.方法 分别转染显性负调控突变体Rac1V12N17(HN)、持续活化型Rac1V12(HV)或空载体(HW)于纤维肉瘤HT1080细胞,G418筛选.蛋白印迹分析检测外源性Rac1基因表达,并在含胶原蛋白凝胶的3D基质中培养,用得克萨斯红结合的鬼笔环肽染色显示细胞肌动蛋白骨架构型.在含胶原蛋白凝胶覆盖滤膜的Transwell小室进行细胞侵袭胶原屏障实验,并观察MMPs抑制剂和抑肽酶对上述细胞侵袭实验的影响.结果 HV细胞伸出明显的突起,HN细胞形态紧凑,HV细胞侵袭胶原屏障的能力大于HW细胞,而后者又强于HN细胞,这种差别在应用广谱MMPs抑制剂后消失,而抑肽酶则无影响.结论 外源活化型Rac1基因在纤维肉瘤HT1080细胞内稳定表达可诱发肌动蛋白纤维聚集,并可增加HT1080纤维肉瘤细胞侵袭胶原屏障的能力,但这种细胞侵袭胶原蛋白能力的增强可被MMPs抑制剂阻断.     

LY294002对人纤维肉瘤HT1080细胞生长的影响及机制研究

目的 研究PI3K特异性抑制剂LY294002对人纤维肉瘤HT1080细胞生长的影响及机制.方法 将对数生长期的HT1080细胞分组培养,对照组加入不含LY294002的培养液,实验组加入LY294002,浓度分别为5、10、25、50、100 μmol/L,培养12 h和24 h后,用SunBio~(TM) Am-Blue法测定细胞增殖抑制率.100 μmol/L LY294002作用HT1080细胞24 h后,观察细胞形态的改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并收集蛋白标本,Western Blotting检测p-Akt及p-mTOR蛋白的表达.结果 与对照组比较,随着LY294002剂量、作用时间的增加,对HT1080细胞增殖抑制率增大(P＜0.05).LY294002(100 μmol/L)作用24 h后HT1080细胞胞体皱缩,细胞数较对照组减少,细胞早期凋亡率较对照组增加(P＜0.05),p-Akt(0.23±0.01)及p-mTOR(0.32±0.06)蛋白的表达低于对照组p-Akt(0.63±0.02)及p-mTOR(0.71±0.02)蛋白的表达(P＜0.01).结论 LY294002通过抑制PI3K-mTOR信号通路来抑制HT1080细胞的生长,PI3K-mTOR信号通路参与纤维肉瘤细胞的生长调节,该通路可能作为治疗纤维肉瘤的新靶点.     

胃癌组织中血管内皮抑素及微血管密度测定

中图分类号R735.2摘要目的:探讨胃癌组织中血管内皮抑素(Endostatin)的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法:采用免疫组化法检测65例胃癌、20例癌旁正常组织Endostatin蛋白的表达,应用抗CD34单抗标记血管内皮细胞,测定肿瘤间质微血管密度(MVD)。结果:胃癌组织Endostatin阳性表达率(61.54%,40/65)高于癌旁正常组织的20.00%(4/20)(P<0.01);Endostatin阳性表达组的MVD值(22.80±10.82)低于Endostatin阴性表达组(29.84±9.28,P<0.01);随着Endostatin表达程度加强,MVD值减少。Endostatin表达与胃癌浸润深度、TNM分期及淋巴结有无转移有关。结论:Endostatin在抑制胃癌血管生成中可能起一定作用。     

内皮抑素抗肿瘤机制和应用的研究进展

内皮抑素自发现以来一直被认为是肿瘤生长过程中最重要的抗血管形成因子,也成为肿瘤抗血管治疗的重要靶点。内皮抑素抗肿瘤作用机制和临床应用的研究一直是肿瘤靶向治疗领域研究的热点,但其具体的作用机制及其如何提高临床疗效仍然存在诸多争议。现就近年来国内外对于内皮抑素抗肿瘤作用机制及临床应用的研究进展予以综述。     

人HT036蛋白的原核表达及鉴定

目的 原核表达人HT036蛋白并鉴定其正确性.方法 采用PCR技术,扩增人HT036蛋白编码序列,克隆至原核表达载体pET30a( )中,用IPTG诱导表达,免疫印迹鉴定.结果 PCR扩增得到了目的DNA片段,克隆至原核表达载体后经酶切与测序鉴定正确,并在大肠杆菌中获得高效表达,用抗His抗体鉴定融合蛋白表达正确.结论 成功构建了重组原核表达载体并正确表达了HT036蛋白.     

抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达

目的 克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endosbtatin,HES)。方法 从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功。结果 克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40％以上。结论 通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础。     

内皮抑素30肽对SGC-7901细胞增殖活性的影响

目的研究经RGD修饰的人内皮抑素(endostatin)N-端的30肽对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响。方法人工合成人内皮抑素1～30位氨基酸(30肽,25～31序列由RGIR GAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,用WST-1试剂检测30肽对SGC-7901细胞增殖活性的影响。结果 30肽能够有效抑制SGC-7901细胞的增殖,并呈时间剂量依赖性。结论 30肽能有效抑制SGC-7901细胞的增殖,其在临床胃癌的治疗上具有潜在的应用前景。