肾小球系膜细胞转化生长因子—β1基因启动子中氧化低密度脂蛋白应签元件的研究

目的：了解在氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)刺激下，转化生长因子－β1（TGF－β1）基因启动子中顺式作用元件的应答情况。研究在大鼠肾系膜细胞中，Ox-LDL对TGF－β1基因启动子转录活性的影响作用。方法：用聚合酶链反应（PCR）、酶切和亚克隆的方法，构建出5个TGF－β1启动子缺失体一虫荧光素酶（luciferase)报告基因，利用其瞬时转染系膜细胞并检测luciferase相对活性。结果：在Ox-LDL(100mg/L)刺激下，luciferase的活性12h即出现，并于36h达到平台期。对Ox-LDL刺激的应答。TGF－β1启动子－1550到－845之间可能存在着增强子，－629到－422之间则可能有抑制子。计算机软件分析表明，前者内有一转录激活蛋白－1（AP－1）精确识别位点。结论：在大鼠肾系膜细胞TGF－β1基因启动子中，AP－1结合序列（TGAGTCA）可能是应答Ox-LDL的顺式作用元件。Ox-LDL上调TGF－β1的表达至少部分是通过AP－1蛋白来介导的，且Ox-LDL可能通过蛋白激酶C（PKC）信号通路激活AP－1从而正调控TGF－β1基因的转录过程。     

肾小球系膜细胞转化生长因子-β1基因启动子中氧化低密度脂蛋白应答元件的研究

目的 :了解在氧化低密度脂蛋白 (Ox LDL)刺激下 ,转化生长因子 β1(TGF β1)基因启动子中顺式作用元件的应答情况。研究在大鼠肾系膜细胞中 ,Ox LDL对TGF β1基因启动子转录活性的影响作用。　 方法 :用聚合酶链反应 (PCR)、酶切和亚克隆的方法 ,构建出 5个TGF β1启动子缺失体—虫荧光素酶 (luciferase)报告基因 ,利用其瞬时转染系膜细胞并检测luciferase相对活性。　 结果 :在Ox LDL(10 0mg/L)刺激下 ,luciferase的活性 12h即出现 ,并于 36h达到平台期。对Ox LDL刺激的应答 ,TGF β1启动子 15 5 0到 845之间可能存在着增强子 , 6 2 9到 4 2 2之间则可能有抑制子。计算机软件分析表明 ,前者内有一转录激活蛋白 1(AP 1)精确识别位点。　 结论 :在大鼠肾系膜细胞TGF β1基因启动子中 ,AP 1结合序列 (TGAGTCA)可能是应答Ox LDL的顺式作用元件。Ox LDL上调TGF β1的表达至少部分是通过AP 1蛋白来介导的 ,且Ox LDL可能通过蛋白激酶C(PKC)信号通路激活AP 1从而正调控TGF β1基因的转录过程。     

低密度脂蛋白对人肾小球系膜细胞产生炎性介质的影响

目的：探讨脂蛋白在肾小球损伤中的作用，观察人低密度脂蛋白（ＬＤＬ）对体外培养的人肾小球系膜细胞（ＧＭＣ）产生活性氧（ＲＯＳ）、血小板活化因子（ＰＡＦ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）的影响，并与经ＬＤＬ刺激后ＧＭＣ的增殖水平相比较。方法：将ＧＭＣ加或不加ＬＤＬ刺激，分别收集３０ｍｉｎ、１８ｈ或４８ｈ后的上清，测定其Ｈ２Ｏ２、Ｏ２＾、ＴＮＦ、ＰＡＦ和ＬＤＨ的水平，以四唑蓝（ＭＴＴ）摄入     

内皮素-1、NF-κB及AP-1对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞纤维连接蛋白表达的影响

目的探讨高糖（HG）对大鼠肾小球系膜细胞（GMC）表达纤维连接蛋白（FN）的影响及内皮素-1（ET-1）、NF-κB和AP-1在FN表达中的作用。方法建立高糖培养条件下的大鼠肾小球系膜细胞模型,在mRNA水平及蛋白水平检测不同条件下的ET-1和FN表达。结果（1）HG组与正常糖浓度（NG）组比较,HG组ET-1及FN的mRNA和蛋白表达显著增加（P〈0.01）。（2）NG组加入ET-1（5nmol/L）后,FNmRNA及蛋白表达增加（P〈0.01）,加入ET-1受体拮抗剂PD142893（10μmol/L）后,HG及ET-1诱导的FNmRNA及蛋白表达均被明显抑制（P〈0.01）。（3）给予NF-κB抑制剂PDTC（10μmol/L）后,HG及ET-1诱导的FNmRNA及蛋白表达均被明显抑制（P〈0.01）。（4）给予JNK特异性抑制剂SP600125（10μmol/L）后,HG及ET-1诱导的FNmRNA及蛋白表达均被明显抑制（P〈0.01）。结论HG增强大鼠GMC表达FN的作用通过ET-1介导,NF-κB和AP-1参与调控ET-1介导的FN表达增加。     

ERK1/2通路在TIMP-1抑制大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路是否参与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)抑制大鼠肾小球系膜细胞的凋亡。方法选择大连医科大学附属第一医院2005年8月至2006年2月应用人正、反义TIMP-1转染大鼠肾小球系膜细胞,分别用高糖(25mmol/L)和MEK1特异性抑制剂PD98059(50μmol/L)刺激24h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;逆转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)观察细胞外信号调节激酶信使RNA(ERK1 messenger RNA)的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测胞浆中p-ERK1/2的表达情况。结果(1)未加PD98059的未转染组、空载体组、正义转染组及反义转染组各组细胞的凋亡率分别为(12.10±2.21)%、(11.90±3.34)%、(5.50±0.50)%和(20.70±3.41)%;正义转染组的凋亡率明显低于未转染组(P<0.01);反义转染组凋亡率高于未转染组(P<0.05)。加入PD98059后各组细胞的凋亡率明显增加。(2)加入PD98059后,各组细胞ERK1mRNA的表达较相应未加PD98059各组明显上调;以正义转染组上调最为明显。(3)ELISA结果显示:加入PD98059后,p-ERK1/2较相应未加PD98059各组明显下调(P<0.05),以正义组下调最为明显(P<0.01)。结论ERK1/2信号传导通路是TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的主要途径之一。     

亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达环氧化酶2的影响

分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终产物孵育大鼠肾小球系膜细胞（RGMC），均可使RGMC环氧化酶（COX）-2mRNA和蛋白表达增加（均P〈0．01）；亚硒酸钠预处理后可抑制上述4种因素诱导的COX-2 mRNA和蛋白表达。亚硒酸钠可能通过抑制COX-2在RGMC的表达，从而在防治糖尿病肾病发生发展过程中发挥重要作用。     

胰淀素诱导人肾小球系膜细胞凋亡

目的:研究胰淀素（amylin) 对人系膜细胞的毒性作用。方法：采用电镜、TUNEL、DNA凝胶电泳和碘化丙啶染色（PI）流式细胞仪分析技术及免疫组化技术，观察amylin对人系膜细胞的作用。结果：光镜和电镜下见细胞体积缩小、梁色质浓梁、致密、边移和凋亡小体形成；TUNEL细胞染色阳性，DNA凝胶电泳出现DNA“梯形”片断；amylin处理48h后，均可见亚二倍体细胞凋亡峰。定量分析示：系膜细胞的凋亡数量与amylin浓度呈剂量依赖性（P＜0．01）。amylin治疗组和对照组乳酸脱氢酶活性细胞释放率无显著性差异（P＞0．05）。结论：amylin对人系膜细胞具有细胞毒性作用，并可诱导系膜细胞的凋亡。amylin诱导人肾小球系膜细胞的凋亡可能是糖尿病肾病患者进行性肾小球硬化和系膜细胞逐渐消失的机制之一。     

低密度脂蛋白对体外培养的肾小球系膜细胞表型转化的影响

目的研究低密度脂蛋白(LDL)对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MCs)表型转化的诱导作用。方法采用不同浓度的LDL(O，25，50，100，150μg／mL)刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞的方法，以MTT比色法检测细胞增殖，透射电镜观察系膜细胞的形态学变化，免疫细胞化学染色及Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)及纤维连接蛋白(FN)的表达。结果在LDL作用下，系膜细胞形态发生明显变化，细胞变为长梭形，透射电镜下出现肌动蛋白样结构。免疫细胞化学染色及Western blot显示α-SMA、CTGF、ColⅣ及FN表达增强(P＜0．05)。结论LDL具有诱导肾小球系膜细胞发生表型转化的作用。     

大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因TA载体构建及其在肾小球系膜细胞表达的实验研究

目的 :构建能在真核细胞表达的含大鼠金属蛋白酶组织抑制物 1(tissueinhibitorofmetalloproteinase 1,TIMP 1)反义基因片段的TA克隆载体 ,并在体外培养的肾小球系膜细胞表达 ,为进一步研究TIMP 1反义基因片段抑制肾组织纤维化的作用奠定基础。　 方法 :用RT PCR法扩增大鼠TIMP 1cDNA片段 (313bp) ,并将其反向克隆到真核表达载体pCR 3.1中 ,用脂质体将大鼠TIMP 1反义基因片段导入培养的大鼠肾小球系膜细胞 ,半定量RT PCR法检测系膜细胞TIMP 1表达的变化。　 结果 :①用限制性内切酶鉴定TIMP 1cDNA片段插入方向 ,测序结果证实扩增片段为目的片段 ;②导入TIMP 1反义基因后 ,肾小球系膜细胞内TIMP 1表达明显减少。　 结论 :①成功地构建了含大鼠TIMP 1反义基因片段的TA克隆载体 ;②该载体能在体外培养的系膜细胞中表达 ;③TIMP 1反义基因片段能有效地阻抑培养的大鼠系膜细胞中TIMP 1的表达。     

阿霉素肾病大鼠肾小球系膜细胞部分生物活性的改变

本文应用肾小球细胞体外培养方法和双同位素标记技术,观察了阿霉素肾病大鼠肾小球系膜细胞(GMC)对白细胞介素6的反应、肾病大鼠GMC条件培养液(GMC-CM)对正常大鼠GEC掺人~(35)S和~3H-亮氨酸的影响以及GMC-CM对小鼠骨髓瘤杂交瘤细胞增殖的作用。结果显示:①肾病大鼠GMC对不同浓度IL-6的反应曲线与正常GMC明显不同;②肾病极期GMC-CM明显促进正常大鼠GEC合成含硫化合物;③肾病大鼠GMC-CM中含有骨髓瘤细胞的杀伤物质。以上结果提示,阿霉素肾病大鼠GMC的部分生物活性发生了改变。     

纤溶酶原激活物抑制物-1基因转导对肾小球系膜细胞外基质积聚的影响

目的　利用体外基因转染技术使纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI 1)基因过表达 ,直接观察局部PAI 1对大鼠系膜细胞外基质 (ECM)积聚的影响 ,解析ECM积聚的分子机制。方法　以绿色荧光蛋白 (GFP)为报告基因 ,构建PAI 1/GFP融合基因真核表达载体 ,利用脂质体将外源PAI 1cDNA导入体外培养的大鼠系膜细胞。在活细胞状态下 ,动态观察外源基因的表达。用Northern杂交、ELISA方法检测大鼠系膜细胞纤维连接蛋白 (FN)、层连蛋白 (LN)及IV型胶原表达。结果　PAI 1基因转染后 ,转染组大鼠系膜细胞中的培养上清PAI活性明显增高 ,到 2 4小时达最高值 ( 8.16± 0 .62 )IU/ml,与对照组 ( 2 .2 7± 0 .19)IU/ml相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。同时基因转染组FN( 0 .5 1±0 0 3 )、LN( 1.2 6± 0 .0 7)及Ⅳ型胶原 ( 0 .98± 0 .0 8)水平均较对照组明显增高 (P <0 .0 5 )。结论　首次建立了系膜细胞PAI 1的过度表达体系 ,证实细胞过度表达PAI 1可以直接导致ECM的积聚。局部PA/PAI活性的变化可能是调节系膜细胞ECM积聚与降解的重要因素。     

血小板活化因子刺激肾小球系膜细胞的自分泌作用

提出了纯金属电阻率的两个简化模型：一个统计模型，一个电子－声子耦合模型。由统计模型可得出；纯金属电阻率与声子深度及声子平均动量的平方成正比。由电子－声子耦合模型得出：电子的散射几率不仅正比于声子数，而且正比于电子－声子的耦合强度。由这两个模型皆能得出纯金属电阻率在高湿时与温度Ｔ成正比，低温时与Ｔ＾５成正比的结果。由电阻率－温度曲线的比较表明，两模型相当吻合。     

高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞中eNOS/NO的变化及调节机制研究

目的:探讨高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中内皮一氧化氮合酶一氧化氮(eNOS/NO)的变化及可能的调节机制.方法:将大鼠GMCs常规培养在含5.5 mmol/L葡萄糖的RPMIl640培养液中,用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)混合消化酶传代.用RT、实时-PCR和Western blot测定GMCs中eN...     

内皮素对肾小球系膜细胞炎症效应的作用

本文从三个方面观察了内皮素-1(ET-1)对系膜细胞炎症效应的作用,结果表明:①可刺激系膜细胞收缩;②对系膜细胞合成DNA具有刺激作用,而且此作用具有剂量与时间依赖性;③可刺激系膜细胞分泌肿瘤坏死样因子。ET-1对系膜细胞的上述作用,提示它在肾炎发病中可能具有重要意义。     

罗格列酮减轻糖基化终末产物对大鼠肾系膜细胞PAI-1的影响

目的观察过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPAR-γ）激活剂罗格列酮对糖基化终末产物（AGEs）诱导的大鼠肾系膜细胞纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）变化的影响。方法ELISA测定PAI-1蛋白含量，底物发色法检测纤溶酶原激活物（PA）活性，酶谱法分析基质金属蛋白酶（MMPs）活性。结果AGEs（25-200mg／L）可不同程度上调系膜细胞PAI-1表达，降低PA活性，给予罗格列酮（2．5～10mmol／L）可减轻AGEs（100mg／L）引起的PAI-1表达上调，并增加PA和MMP-2活性。结论罗格列酮减轻AGEs引起的PAI-1表达增加，提高PA和MMP-2的活性。     

高糖状态下肾脏系膜细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及氟伐他汀的干预研究

目的观察高糖环境中大鼠肾脏系膜细胞（MC）葡萄糖转运蛋白1（GluT-1）及转化生长因子1（TGF-β1）mRNA表达变化以及氟伐他汀（Flu）的干预作用，探讨其保护肾脏的可能机制。方法原代培养MC分为正常对照（NG）组、甘露醇（MG）组、高糖（HG）组及HG＋Flu组，RT-PCR法检测细胞中GluT-1mRNA和TGF-β1 mRNA的表达，放免法测定各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原含量。结果HG组各时相点GluT-1mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均高于NC组（P〈0．01），从48h开始HG组细胞上清液Ⅳ型胶原的含量较NC组增高（P〈0．05），而HG＋Flu组GluT-1 mRNA表达量、TGF-β1 mRNA的表达、细胞上清液Ⅳ型胶原含量均较同时点HG组明显降低（P〈0．01）。结论高糖刺激使MC内GluT-1 mRNA表达增高，TGF-β1 mRNA表达上调，Ⅳ型胶原分泌增多。高糖状态下，Flu抑制细胞外基质积聚的作用可能与其抑制高糖引起MC GluT-1过表达、减少TGF-β1的合成有关。     

高密度脂蛋白对肾小球系膜细胞损伤的保护作用

利用体外培养的人肾小球系膜细胞，观察了高密度脂蛋白对其生长、释放血小板活化因子和乳酸脱氢酶的影响，同时还研究了高密度脂蛋白对低密度脂蛋白所致系膜细胞增殖的影响。结果发现，高密度脂蛋白有轻度抑制系膜细胞增殖的作用，几乎不增加细胞血小板活化因子和乳酸脱氢酶的释放。低密度脂蛋白浓度为球系膜细胞的损伤有一定保护作用，至少不增加低这旨蛋白的肾毒性。