大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。     

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定.方法:针对筛选确定的人STUB1 基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I 和EcoR I 酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA 慢病毒载体.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒.结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒.结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体.     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

Robo1RNA干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的 构建Roundabout (Robo1) siRNA慢病毒载体,并在SKOV3卵巢癌细胞中鉴定其转染及基因沉默效果.方法 根据GenBank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备Robo1 DNA片段,在T4 DNA连接酶作用下,将线性化的病毒载体GV118与DNA片段制备合成GV118-siRNA目的 质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒载体在工具细胞SKOV3卵巢癌细胞中的转染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot方法 检测Robo1 siRNA慢病毒对SKOV3中Robo1的干扰作用.结果 成功构建Robo1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,病毒滴度为2×109 TU/mL;用该病毒体外转染SKOV3卵巢癌细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blot方法 检测Robo1基因沉默的效率分别为76.7%、56.0%.结论 成功构建了Robo1 siRNA慢病毒载体GV118-siRNA,该病毒载体在体外转染SKOV3卵巢癌细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果.     

人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体.方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligoDNA,退火形成双链DNA,与经Xba I和XhoⅡ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体.在此基础上,引入外源设计的PTEN mRNA,与经EcoR I和BamH I酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN.2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定.分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293/包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度.结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6 × 105和5.6 × 105pfu/mL.结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体.有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体.     

针对丝聚合蛋白基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建及筛选

目的构建丝聚合蛋白(FLG)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法设计针对人FLG基因的mRNA干扰靶序列,合成相应双链DNA,通过BamH I和EcoRI酶切后的PGLV/H1/GFP载体连接产生shRNA载体,并与pHelper 1.0、pHelper 2.0两种载体共转染293T细胞培养,获得重组慢病毒载体后,转染目的细胞,实现针对FLG基因的RNA干扰。结果经鉴定该实验的慢病毒载体,对人正常皮肤细胞HACAT干扰效果达75%~95%,以RNAi3的沉默效应最佳。结论重组的慢病毒载体为有关FLG基因的进一步研究奠定良好实验基础,并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。     

人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装

目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达.方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析.通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定.结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率 > 90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml.结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考.     

Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

KCTD10在神经胶质瘤中表达的初步研究

目的：初步探讨 KCTD10（potassium channel tetramerisation domain-containing 10）基因在神经胶质瘤中的表达及意义。方法：收集人神经胶质瘤标本6例,同时收集正常脑组织标本2例,用免疫组化染色法检测 KCTD10在这些标本中的表达情况。结果：在6例人神经胶质瘤切片中均检测到 KCTD10的高表达,而在2例正常脑组织中未检测到 KCTD10的表达。结论：KCTD10在人神经胶质瘤标本中表达水平较正常脑组织中明显增高,提示KCTD10可能在人神经胶质瘤的发生发展中起作用。     

KCTD10在上皮型脑膜瘤中表达的初步研究

目的:初步探讨KCTD10基因在上皮型脑膜瘤中的表达及意义。方法:收集正常脑膜及新鲜上皮型脑膜瘤标本7例,用免疫组化染色法检测KCTD10在这些标本中的表达情况。结果:在3例正常脑膜中未检测到KCTD10的表达,在所有上皮型脑膜瘤(WHOⅠ级)组织中均检测到KCTD10的高表达。结论:KCTD10在上皮型脑膜瘤中表达水平高,提示KCTD10可能在上皮型脑膜瘤的发生发展中起作用。     

简易部分肝切除自体肝移植大鼠模型的建立

目的:建立一种简易的大鼠部分肝切除自体肝移植模型.方法:采用SD大鼠,在既往自体肝移植模型基础上进行简化和改进,摒弃传统的门、腔及颈内静脉置管转流方法,改进冷灌注方法,建立了研究大鼠部分肝切除自体余肝移植模型.结果:手术过程大大简化,成功率为96.7％.门静脉、下腔静脉置管时间不超过1min,无肝期为16～18(中位时...     

N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基/RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC)神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl-D-aspar-tate,NR2B)对晚期癌痛患者的恶性情绪体验形成具有重要作用。构建靶向NR2B基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,可为下调ACC神经元NR2B靶基因的表达提供有力工具。方法构建靶向目的基因NR2B的RNAi重组慢病毒表达载体并酶切鉴定,再以NR2B/RNAi慢病毒表达载体和NR2B的基因表达质粒共转染293T工具细胞,以Westernblot方法检测其对目的基因NR2B的敲减效率。结果酶切鉴定NR2B/RNAi慢病毒表达载体Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ构建成功。West-ern blot结果显示,NR2B/RNAi慢病毒表达载体Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ均对NR2B靶基因有敲减效果,但以NR2B/RNAi慢病毒表达载体Ⅲ效率最高。结论成功构建可高效沉默NR2B靶基因的NR2B/RNAi慢病毒表达载体,为下调ACC神经元NR2B的基因表达治疗晚期癌痛患者的恶性情绪体验提供了有力工具。     

NMNAT1基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶.1(NMNAT1)基因慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法:将靶向NMNAT1基因连接到慢病毒载体pGC-E3/Lenti中,获得pGC-E3-NMNATI统一质粒,经PCR检测以及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过LipofectamineTM2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度.结果:PCR扩增和测序结果证实,Nmnatl核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1×105U/L.结论:成功构建NMNAT1基因慢病毒载体,为研究其在面神经损伤修复中的功能和基凶治疗奠定了基础.     

针对小鼠VEGFA基因的siRNA干扰载体的构建和慢病毒包装

目的 针对NM_001025250.3,NM_001025257.3,NM_009505.4,构建4个针对靶基因小鼠VEGFA(血管内皮生长因子A)的小干扰RNA(siRNA)干扰载体,并将其重组转成慢病毒载体.方法 根据靶基因设计并合成4对siRNA干抚序列,将siRNA干扰序列克隆到pcDNA6.2-GW/EmGF...     

特异性针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒载体的构建

目的 以小鼠VEGFa基因为靶基因,构建携带短发夹状干扰RNA(siRNA)的慢病毒载体。方法 设计并合成三对包含靶序列和一对针对无关序列的互补寡核苷酸链,克隆到pRNAT-U6.2/Lenti质粒;从小鼠NIH/3T3细胞扩增、纯化VEGFa cDNA,构建pCDNA-VEGF质粒;实验分6组,pCDNA-VEGF质粒或/和siRNA慢病毒质粒共转染NIH/3T3细胞,筛选最有效siRNA慢病毒表达质粒;将筛选siRNA慢病毒表达质粒和pRNAT-Negative质粒与慢病毒包装质粒混合物混合,共转染293T细胞,48h后收集上清。结果成功构建针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒质粒和质粒pCDNA-VEGF;慢病毒质粒有效抑制pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa表达水平,pRNAT-siRNA3抑制作用最明显,VEGFa mRNA和蛋白表达分别下降80.0%和66.3%;纯化慢病毒滴度均为1×108ifu/mL。结论 成功设计、筛选、生产针对小鼠VEGFa基因沉默的特异性siRNA慢病毒。     

靶向PEGl0的siRNA真核表达载体对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的探讨靶向PEGl0的siRNA真核表达载体（psiRNA—PEGl0）对裸鼠人肝癌移植瘤生长的影响。方法建立人肝癌细胞HepG2的荷瘤裸鼠模型，在接种后第14天分别将psiRNA空载体和psilk—NA-PEGl0瘤内多点注射进行治疗，观察肿瘤大小变化、组织形态学及超微病理改变。结果psiRNA—PEGl0治疗组肿瘤生长受到明显抑制，与生理盐水组和psiRNA组比较差异有显著性（P〈0．001），抑瘤率明显高于其他两组．电镜下可见明显的细胞凋亡。结论靶向PEGl0的siRNA真核表达载体对裸鼠肝癌移植瘤生长有抑制作用。     

靶向PEG10的siRNA真核表达载体对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的探讨靶向PEG10的siRNA真核表达载体(psiRNA-PEG10)对裸鼠人肝癌移植瘤生长的影响。方法建立人肝癌细胞HepG2的荷瘤裸鼠模型,在接种后第14天分别将psiRNA空载体和psiR-NA-PEG10瘤内多点注射进行治疗,观察肿瘤大小变化、组织形态学及超微病理改变。结果psiRNA-PEG10治疗组肿瘤生长受到明显抑制,与生理盐水组和psiRNA组比较差异有显著性(P<0.001),抑瘤率明显高于其他两组,电镜下可见明显的细胞凋亡。结论靶向PEG10的siRNA真核表达载体对裸鼠肝癌移植瘤生长有抑制作用。