TWIST1基因敲低对DFOG抑制OVCAR3源性球细胞自我更新和FoxM1表达的影响

目的:探讨7-二氟甲氧基-5,4'-二-正辛烷氧基金雀异黄素通过下调Twist1/FoxM1表达抑制OVCAR3源性球细胞自我更新作用分子机制.方法:表达TWIST1 shRNA腺病毒感染OVCAR3源性球细胞敲低TWIST1基因表达.肿瘤球形成试验检查细胞自我更新能力.蛋白质印迹法检测细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平.结果:与OVCAR3细胞比较,OVCAR3源性球细胞具有更强自我更新能力以及高水平表达Twist1和FoxM1蛋白.TWIST1 shRNA有效抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和下调Twist1和FoxM1蛋白表达.TWIST1 shRNA协作DFOG(5μM)抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和Twist1和FoxM1蛋白表达.结论:DFOG可能通过调控Twist1表达抑制FoxM1表达,进而抑制OVCAR3源性球细胞自我更新.     

DFOG对A549细胞生长及FoxM1表达的影响

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4′-二-正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人肺癌细胞生长作用及机制.方法:用不同浓度DFOG处理体外培养A549细胞后,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布;平皿集落形成法测定细胞生长;Western blot分析FoxM1蛋白表达.结果:DFOG处理24 h导致A549细胞系G2期细...     

DFOG抑制卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新与活化FoxO3a相关

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4’-二正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新及其作用机制。方法:体外培养A2780细胞,干细胞条件培养基悬浮培养扩增球形成细胞(sphere forming cells,SFCs)。Western blot分析SFCs的CD133和CD44蛋白及磷酸化FoxO3a蛋白表达水平;MTT法测定SFCs增殖活性;肿瘤球形成试验检测SFCs自我更新能力。结果:A2780细胞系SFCs具有自我更新能力。与亲本细胞相比,SFCs高表达CD133及CD44并具有更高的磷酸化FoxO3a蛋白表达水平。DFOG以浓度依赖的方式抑制SFCs增殖与自我更新,并下调SFCs中磷酸化FoxO3a蛋白水平。结论:DFOG抑制人卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新与其活化FoxO3a蛋白相关。     

7-二氟甲氧基-5,4’-二正辛烷氧基金雀异黄素对卵巢癌干细胞样细胞自我更新和FoxM1表达的影响

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4’-二正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人卵巢癌SKOV3细胞系球形成细胞自我更新作用。方法:体外培养SKOV3细胞,干细胞条件培养基悬浮培养扩增球形成细胞(SFCs)。Western blot分析SFCs的CD133及CD44蛋白及FoxM1表达水平;MTT法测定SFCs增殖活性;肿瘤球形成试验检测SFCs自我更新能力。结果:在干细胞条件培养基中,SKOV3细胞生长为非粘附三维克隆性球体。与亲本细胞相比,SKOV3细胞系SFCs高表达CD133及CD44与FoxM1蛋白。DFOG(0.1,1.0,10.0μmol/L)作用72 h,优先抑制源自SKOV3细胞SFCs增殖与自我更新,并以浓度依赖的方式下调SFCs中FoxM1表达。结论:DFOG抑制卵巢癌干细胞样细胞自我更新与其抑制FoxM1蛋白表达相关。     

7-二氟甲氧基-5,4'-二-正辛烷氧基金雀异黄素下调FOXM1抑制卵巢癌细胞生长

目的:研究新型金雀异黄素衍生物7-二氟甲氧基-5,4'-二正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人卵巢癌SKOV3细胞生长作用及其分子机制。方法:采用MTT法和集落形成法分析金雀异黄素以及DFOG对人卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制作用。采用多种分子生物学技术如RT-PCR、Western blot、siRNA以及cDNA转染等探索分子机制。结果:金雀异黄素的9种衍生物抑制SKOV3细胞增殖活性作用均比金雀异黄素强,其中DFOG的抑制作用最强。DFOG和金雀异黄素导致SKOV3细胞生长抑制。DFOG能有效降低FOXM1和它下游基因(CDC25B,cyclin B)表达,上调p27KIP1表达。siRNA下调FOXM1后,再用DFOG处理,增强DFOG的细胞生长抑制作用。cDNA转染上调FOXM1能削弱DFOG诱导细胞生长抑制作用。结论:FOXM1介导金雀异黄素和DFOG抑制卵巢癌细胞生长作用,提示FOXM1可能成为治疗人卵巢癌的一个新靶标。     

DFMG调节TLR4信号通路对氧化损伤的内皮细胞诱导巨噬细胞增殖的影响

目的:观察7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)诱导的THP-1(人单核细胞系)源性巨噬细胞(MΦ)增殖的影响及探索其可能的发生机制.方法:制备溶血性磷脂酰胆碱(LPC)氧化损伤HUVE-12与MΦ 共培养模型,浓度梯度DFMG、TLR4特异性拮抗剂(CLI-095)、TLR4特异性激动剂(LPS)干预LPC氧化损伤HUVE-12与MΦ 共培养;MTT法观察MΦ 的增殖;western blot检测HUVE-12 TLR4蛋白的表达水平.结果:LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞增殖,DFMG抑制LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖,上调TLR4表达进一步促进LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖,下调TLR4表达抑制LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖.结论:DFMG可能通过下调LPC氧化损伤HUVE-12的TLR4蛋白表达水平,抑制炎症反应,从而抑制巨噬细胞增殖.     

新型金雀异黄素衍生物抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移和侵袭的作用及机制

目的 检测新型金雀异黄素衍生物HNPG对骨肉瘤MG-63细胞迁移和侵袭的抑制作用及其可能分子生物学机制。方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞,用MTT检测HNPG对MG-63细胞的增殖抑制作用;用划痕实验检测HNPG对MG-63细胞迁移抑制作用;用Transwell检测HNPG对MG-63细胞侵袭的抑制作用;用PI染色FCM检测HNPG对MG-63细胞G1期的阻滞作用;用AV-PI染色FCM检测HNPG对MG-63细胞凋亡的诱导作用;用Western blotting检测HNPG对MG-63细胞p53、bcl-2和bax蛋白表达的调节作用。结果 HNPG在体外呈时间和浓度依赖性抑制MG-63细胞增殖,24 h的IC50为(4.8±0.6)μmol/L,5μmol/L的HNPG作用MG-63细胞24 h增殖抑制率为(45.2±4.6)%,较NS组的(0.40±0.02)%显著升高,差异有统计学意义(P0.05),划痕愈合率为(38.24±2.48)%,较NS组的(71.23±4.62)%显著降低,差异有统计学意义(P0.05),侵袭抑制率为(44.66±2.06)%,较NS组的(0.34±0.03)%显著升高,差异有统计学意义(P0.05),伴随着细胞G1期比例增高(78.65±3.48)%,较NS组的(64.40±2.02)%显著升高,差异有统计学意义(P0.05),细胞凋亡率增高(24.63±2.12)%,较NS组的(2.75±0.20)%显著升高,差异有统计学意义(P0.05);同时p53和bax蛋白表达上调,而bcl-2蛋白表达下调,与NS组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HNPG在体外可以显著抑制MG-63细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与其阻滞细胞于G1期、上调p53蛋白表达,进而激活bax蛋白表达、抑制bcl-2蛋白表达、诱导细胞凋亡所致。     

DFOG下调CD44表达抑制SKOV3卵巢癌干样细胞体外侵袭和迁移

目的 ：研究金雀异黄素类似物7-二氟甲氧基-5,4’-二正辛基金雀异黄素（7-difluoromethoxyl-5,4’-di-n-octyl genistein,DFOG）能否通过下调肿瘤干细胞表面标志蛋白CD44表达抑制SKOV3源性卵巢癌干样细胞（OCSLCs）体外侵袭和迁移能力。方法 ：慢病毒递送系统敲低CD44基因表达（Lent-shCD44）、DFOG(0.1、1.0和10.0μM)或DFOG(10μM)联合Lent-shCD44处理OCSLCs细胞。免疫蛋白印迹法分析OCSLCs细胞CD44蛋白的表达水平。Transwell小室侵袭试验检测OCSLCs细胞体外侵袭能力以及伤口愈合法检测OCSLCs体外迁移能力。结果 ：Lent-shCD44有效降低SKOV3源性OCSLCs细胞侵袭率和迁移能力。DFOG以剂量依赖方式下调OCSLCs细胞肿瘤干细胞标志物蛋白CD44表达和降低侵袭能力和迁移能力。此外,Lent-shCD44协作DFOG抑制OCSLCs细胞侵袭能力和迁移能力。结论 ：DFOG通过下调CD44蛋白表达抑制细胞OCSLCs细胞侵袭能力和迁移能力。     

5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮体外抗人卵巢癌作用研究

目的:研究5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮(DOdFMG)体外抗人卵巢癌作用。方法:体外培养CoC1细胞,MTT比色法测定DOdFMG对CoC1细胞增殖的影响;台盼蓝染色细胞计数法评价DodFMG对CoC1细胞的生长抑制作用;AO/EB染色法荧光显微镜观察DOdFMG诱导CoC1凋亡细胞的形态学改变;Western blotting法分析DOdFMG对CoC1细胞NF-κB蛋白表达和活性的影响。结果:MTT比色法结果显示,DOdFMG有效抑制CoC1细胞增殖活性,呈剂量依赖性;其IC50值为11.9μM。DOdFMG显著抑制CoC1细胞的生长,DOdFMG(10.0μM)使CoC1细胞群体倍增时间从37.8 h(溶媒对照组)延长到50.6 h;AO/EB染色荧光显微镜观察DOdFMG处理后,部分CoC1细胞呈现典型凋亡细胞形态特征;Western blotting分析结果表明:DOdFMG抑制NF-κB/p65表达,呈浓度和时间依赖性。结论:DOdFMG具有抑制体外培养人卵巢癌CoC1细胞增殖、生长和诱导细胞凋亡作用;其作用与抑制NF-κB/p65表达有关。     

DFMG对内皮细胞COX-2表达和黏附功能的影响

目的 :观察7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)中环氧化酶2(cyclooxygenase-2,C0X-2)蛋白表达的影响及内皮细胞的保护作用。方法 :TNF-α诱导建立人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)损伤模型,不同浓度的DFMG进行干预;流式细胞术检测细胞凋亡、Western Blot检测COX-2蛋白表达、ELISA检测E-选择素、单核趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的释放,蛋白定量分析法测定内皮细胞与单核细胞的黏附率。结果 :DFMG呈浓度依赖性阻断损伤的内皮细胞活性的下降、下调COX-2蛋白的表达、降低内皮细胞与单核细胞的黏附率。结论 :DFMG可能通过下调COX-2蛋白表达水平,从而减少单核细胞/内皮细胞黏附作用,减少炎症渗出,抑制炎症反应,保护血管内皮。     

组蛋白去乙酰化酶1基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响

目的：观察组蛋白去乙酰化酶1（HDACl）基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响.方法：体外合成针对HDAC1的小干扰RNA （siRNA）,利用脂质体转染入人卵巢癌SKOV3细胞;通过Western blot方法检测细胞内HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4（Ac-H4）的表达,利用荧光定量PCR方法检测HDAC1、尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）和尿激酶型纤溶酶原激活因子受体（uPAR）基因的mRNA表达;通过划痕实验检测细胞迁移能力,利用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果：经转染HDAC1基因siRNA后,卵巢癌SKOV3细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达水平均下调,细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加;SKOV3细胞迁移速度降低,穿过Transwell滤膜的细胞数量减少;SKOV3细胞内uPA和uPAR基因mRNA表达也降低.结论：HDAC1基因沉默能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞迁移和侵袭能力,机制可能与增加组蛋白乙酰化水平、抑制uPA和uPAR基因表达有关.     

人类激肽释放酶基因4、5在卵巢癌中的表达

目的研究人类激肽释放酶基因4(KLK4)与激肽释放酶基因5(KLK5)在卵巢癌组织中的表达水平,探讨其在恶性肿瘤中的作用机制。方法50例卵巢肿瘤组织标本分为恶性肿瘤组(n=23)、交界性肿瘤组(n=6)和正常或良性肿瘤组(对照组,n=21)。采用荧光定量RT-PCR技术对各组卵巢肿瘤组织标本进行检测,获得KLK4与KLK5的表达水平。结果KLK4在卵巢癌中的表达水平显著高于对照组(P<0.05);KLK5在卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中的表达水平也显著高于对照组(P<0.001);KLK5在浆液性囊腺癌中的表达水平显著高于其他组织学类型的恶性肿瘤(P<0.05)和对照组(P<0.001),且低分化浆液性囊腺癌的表达水平高于中分化浆液性囊腺癌的表达(P<0.05)。KLK5的表达水平与血清CA125水平呈正相关。结论KLK5在卵巢癌,尤其是浆液性囊腺癌的发生与发展过程中可能具有潜在促进作用。     

曲妥株单抗联合顺铂对卵巢癌细胞株的抑制作用

目的研究曲妥株单抗对卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法与流式细胞术检测人卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制及凋亡情况。结果 （1）顺铂（DDP）、曲妥株单抗及DDP＋曲妥株单抗合药均对卵巢癌细胞株SKOV3有一定的生长抑制作用;在同一浓度、同一作用时间下,DDP组的抑制率高于曲妥株单抗组,DDP＋曲妥株单抗组的抑制率高于DDP组;3组均随着药物浓度的增加、作用时间的延长而抑制作用增强（P〈0.05）。（2）DDP、曲妥株单抗及DDP＋曲妥株单抗3组的凋亡率均较对照组高,且3组的凋亡率均随作用时间的延长而升高;在同一作用时间下,DDP组的凋亡率高于曲妥株单抗组,DDP＋曲妥株单抗组的凋亡率高于DDP组（P〈0.05）。结论 DDP、曲妥株单抗及其联合DDP均能明显抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖,诱导细胞凋亡,并呈剂量和时间依赖性,联合DDP效应增强。     

微小RNA-145对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 评估微小RNA-145(miR-145)对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。方法 选取上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及3AO,过表达miR-145后,qRT-PCR检测转染前后细胞株miR-145的表达,Transwell小室实验检测转染前后细胞迁移及侵袭能力。采用生物信息学方法特异预测出miR-145靶基因zeb-2后,通过双荧光素酶报告实验进行验证,再敲低zeb-2后检测细胞移动能力。 结果 过表达miR-145后,SKOV3(t=10.752,P=0.000;t=5.617,P=0.005)及3AO细胞(t=10.111,P=0.001;t=21.746,P=0.000)的迁移及增殖能力均明显下降。双荧光素酶报告实验结果显示,共转染miR-145 mimic和WT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性明显低于共转染mimic control和WT 3’UTR表达载体的细胞(SKOV3:t=4.572,P=0.010;3AO:t=3.528,P=0.024),共转染miR-145mimic和MUT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性与共转染mimic control和MUT 3’UTR表达载体细胞差异无统计学意义(SKOV3:t=0.227,P=0.831;3AO:t=0.040,P=0.970)。过表达miR-145 48 h后,实时定量PCR检测结果显示,与阴性对照相比,SKOV3(t=1.490,P=0.211)和3AO细胞(t=0.114,P=0.914)中zeb-2 mRNA表达差异无统计学意义。过表达miR-145 72 h后,Western blot检测结果显示,与阴性对照相比,SKOV3(t=3.769,P=0.020)及3AO细胞(t=4.452,P=0.011)中zeb-2蛋白的表达水平明显下降。转染zeb-2 siRNA 72 h后,Western blot检测结果显示,SKOV3(t=4.660,P=0.010)和3AO细胞(t=4.594,P=0.010)中的zeb-2蛋白表达水平明显下调;Transwell小室实验检测结果显示,SKOV3(t=18.655,P=0.000;t=18.026,P=0.000)及3AO(t=5.500,P=0.005;t=8.780,P=0.001)细胞的迁移和侵袭能力明显下降。结论 miR-145可能是通过靶向抑制zeb-2来抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭能力。     

二价阳离子对人SKOV3卵巢癌细胞株细胞黏附、细胞侵袭和细胞转移的影响

目的探讨二价阳离子对人SKOV3卵巢癌细胞株细胞黏附、细胞侵袭和细胞转移的影响。方法将人SKOV3卵巢癌细胞株按常规方法进行培养,待细胞长到80%~90%汇合时用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化、传代。取生长良好的P3或P4代细胞按是否加入二价阳离子分为对照组(不加入二价阳离子)和实验组[加入二价阳离子:Ca2+(2.5、5.01、0.0 mmol·L-1)组和Zn2+(1.01、0.0 mmol·L-1)组]。在光学显微镜下对各组黏附细胞进行计数。在570 nm波长的酶标仪下测定各组侵袭和转移细胞的OD值,以OD值代表细胞侵袭率和细胞转移率。结果 Ca2+对人SKOV3卵巢癌细胞黏附具有抑制作用,作用随药物浓度增加而增强,呈剂量依赖性。Ca2+细胞黏附抑制率范围为10.2%~62.2%,各Ca2+浓度组人SKOV3卵巢癌细胞黏附率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Zn2+浓度在1.0 mmol·L-1时,黏附细胞略有增多,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);在10.0 mmol·L-1时,黏附细胞数量显著降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Ca2+、Zn2+对人S...     

罗格列酮诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡过程中hTERT表达变化的研究

目的探讨罗格列酮对卵巢癌细胞株SKOV3细胞的凋亡作用,及细胞凋亡与端粒酶反转录酶(hTERT)之间的关系。方法使用倒置相差显微镜观察药物作用前后细胞形态变化;不同浓度罗格列酮作用24、48 h后,流式细胞仪分别检测卵巢癌SKOV3细胞凋亡情况;免疫荧光检测hTERT蛋白表达的变化;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA变化。结果罗格列酮处理后,倒置相差显微镜检测到卵巢癌细胞变圆,胞质固缩,细胞间隙增宽,部分细胞脱壁并漂浮。25～200μmol/L罗格列酮作用于细胞24 h后即发生细胞凋亡,48 h后凋亡更加明显,同时存在时间和浓度依赖性。药物作用48 h后免疫荧光检测hTERT蛋白表达下调,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达下调,呈浓度依赖性。结论罗格列酮可以诱导卵巢癌SKOV3细胞株凋亡,具有时间浓度依赖性,其机制可能与下调hTERT的表达有关。     

BRMS1对卵巢癌细胞c13*转移侵袭的影响及机制

目的探讨乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)对c13*细胞转移侵袭、粘附的影响及机制。方法由质粒PC-MV-HA-BRMS1中扩增目的基因BRMS1,将其插入pcDNA3.1(+)质粒中,构建pcDNA3.1(+)-BRMS1质粒。经酶切及测序鉴定正确后,转染c13*细胞,PCR、Real-time PCR、Western blot检测BRMS1的表达;划痕实验、Transwell实验、粘附实验检测c13*细胞运动、侵袭、粘附能力;Western blot检测整合素β1、p-AKT、AKT表达。结果成功构建了pcDNA3.1(+)-BRMS1质粒;转染目的基因的c13*细胞中,BRMS1的mRNA和蛋白表达均显著增加,细胞运动、侵袭、粘附能力降低,整合素β1及p-AKT表达均下降,AKT表达无改变。结论成功构建pcDNA3.1(+)-BRMS1质粒。BRMS1可能通过抑制整合素β1/AKT通路,抑制卵巢癌c13*细胞的运动、侵袭和粘附能力。