腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下：利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子（CD11a promoter,CD11Ap）、甲病毒载体元件（nsP）、目的基因（GFP）、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数（100MOI）分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP＋细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP＋细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,增强VSMC中gax基因的表达。方法　采用位置特异性重组方法构建携带大鼠 gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体(AdCMV gax) ,经 2 93细胞扩增 ,纯化制备高滴度病毒转染液 ;以病毒转染液常规转染VSMC后 ,应用RT PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中 gaxmRNA和蛋白质的表达。 结果　流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV gax转染VSMC后 ,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高 ,转染后 2 4小时即可达 80 %左右 ,高水平的表达可维持 5天以上 ;AdCMV gax转染前 ,PDGF BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用 ,AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中 gax基因的表达均比转染前显著增高。 结论　腺病毒载体可有效地介导 gax基因转染VSMC ,并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究 gax基因对VSMC生物学行为的影响     

重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达

目的 构建肌凝蛋白轻链-2(MLC-2v)启动子调控的NIS腺病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性.方法 将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体,再与含有骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌(BJ5183)同源重组,经人胚肾细胞(HEK293)包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作为对照组.腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞,通过Western blot检测NIS蛋白的表达,行动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性.通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响.结果 成功构建重组NIS腺病毒.Western blot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达;感染Ad-MLC-NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达,而心肌细胞中NIS蛋白高表达.动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844.0、833.6、846.0放射性计数·min-1.H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制.感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞,感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小.结论 MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础.     

对乏氧和射线应答的嵌合性基因启动子的研究进展

介绍两种应用射线和乏氧应答启动子调节的GDEPT(定向基因酶前体药物治疗)系统。用治疗性、条件性或肿瘤特异性启动子控制GDEPT是一种控制靶基因在肿瘤内表达的方法。通过选择性启动子，使基因靶向肿瘤内表达，提高特异性和靶向性，解决了肿瘤基因治疗中的主要限制。     

RGD修饰携带tumstatin及eGFP新型腺病毒载体的构建及其表达研究

目的 构建RGD修饰表达绿色荧光蛋白(eGFP)和肿瘤抑素(tumstatin)的新型腺病毒载体.方法 PCR扩增tumstatin基因,经克隆后构建pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体.重叠PCR方法将RGD序列插入到Ad5纤维蛋白的HI环中,获得pMfiber-RGD穿梭载体.穿梭载体与腺病毒骨架载体线性化后共转化E.coli BJ5183,构建pAd-RGD-eGFP骨架载体.最后,使用磷酸钙法将pAd5-CMV/tumstatin穿梭载体和pAd-RGD-eGFP骨架载体共转化HEK293细胞.7～10d后收集细胞裂解物得到Ad-RGD-tumstatin/eGFP病毒.将经过修饰的Ad-RGD-tumstatin/eGFP和未修饰的Ad-WT-tumstatin/eGFP病毒分别感染脑胶质瘤U87MG细胞(病毒剂量分别为1、10、100Vp/细胞),通过观察其荧光强度评估其感染效率.以上两种病毒分别感染HeLa细胞,并分别采用RTPCR及Western blotting检测tumstatin细胞mRNA及培养上清中蛋白的表达水平.结果 病毒感染48h后,可观察到修饰后的腺病毒Ad-RGD-tumstatin/eGFP对U87MG细胞的感染效率明显高于未修饰的腺病毒Ad-WT-tumstatin/eGFP.RT-PCR及Westem blotting可检测剑感染Ad-RGD-tumstatin/eGFP后的HeLa细胞中tumstatin的转录和表达.结论 成功构建经RGD修饰并表达tumstatin和eOFP基因的新型腺病毒载体,为进一步研究tumstatin在低表达柯萨奇一腺病毒受体的肿瘤中的作用奠定了良好基础.     

NF-κBp65特异性siRNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干涉核糖核酸(small interference RNA,siRNA)重组腺病毒载体。方法:设计特异性NF-κBp65siRNA的靶序列对应的双链DNA,插入腺病毒穿梭质粒,然后跟腺病毒骨架质粒共转染HEK-293A细胞,穿梭质粒和骨架质粒在细胞内整合包装重组腺病毒并用β-Gal染色鉴定。重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定后,感染培养的大鼠关节软骨细胞,应用RT-PCR在mRNA水平观察NF-κBp65的表达。结果:β-Gal染色显示重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR结果显示重组腺病毒有效抑制了目的基因NF-κBp65的表达。结论:特异性NF-κBp65 siRNA的重组腺病载体可以抑制目的基因的表达,可以用于体内抑制骨关节炎的实验研究。     

腺病毒载体与肿瘤治疗研究进展

基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。对于病毒载体而言，大多数野生型病毒对机体都具有致病性，因此需要对其进行改造后才能用于人体。近年来，一些病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。对于腺病毒载体，由于它具有①靶细胞种类多，导入效率高；②既可感染分裂期细胞，对增殖停止期细胞也有很高的导入效率，这是逆转录病毒载体所不具备的；③不整合到宿主基因组中从而不会引起插入突变。     

实时定量PCR检测GDNF基因转染大鼠BMSCs后的转录水平

目的 了解外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的转录水平.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将其随机分为GDNF基因转染组、空质粒转染组和未转染组3组;GDNF基因转染组和空质粒转染组分别用GDNF基因和空质粒重组腺病毒感染BMSCs,并按感染后培养时间的不同(3、6、9和12天)又分为4个亚组.采用实时定量PCR技术检测GDNF基因在BMSCs中的转录水平.结果 空质粒转染组和未转染组无GDNF mRNA的表达,GDNF基因转染组在转染后3～12天的GDNF mRNA相对表达量为0.007 51±0.000 67.结论 腺病毒介导的基因转染技术将GDNF基因转染至骨髓间充质干细胞中,有外源性基因GDNF mRNA的表达,这为进一步研究以GDNF基因转染的BMSCs治疗中枢神经系统疾病奠定了基础.     

报告基因显像监测基因治疗研究进展

为评价基因治疗,需要随时对治疗基因的定位和表达进行监测。放射性核素报告基因技术是检测基因表达的最好方法。用基因融合、双顺反子、双启动子及双向转录等重组技术,构建表达报告基因的腺病毒载体,导入靶细胞或组织内,然后注射与报告基因偶合的核素标记的探针,进行PET、SPECT或γ-照相,可无创伤地、重复地定量显示报告基因表达。目前,用于基因治疗的报告基因和报告探针系统有:HSV1-tk(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因)和碘、氟同位素标记的尿嘧啶、鸟嘌呤的衍生物;突变的多巴胺D2R(多巴胺2型受体)基因和(18F-FESP(18F-氟乙基螺环哌丁苯);SSTr2(生长抑素2型受体基因)和生长抑素类似物等。其中,部分已用于临床试验治疗。     

基因活化材料的构建及在骨与软骨损伤中的应用

组织工程技术为关节软骨的再生带来希望，适当浓度的生长因子、合适的微环境无疑会利于这种技术的实施。近年来，生物可降解材料作为基因传送载体转染体细胞的研究正逐渐受到重视，可以利用生物材料的降解特性以及化学构成特点构建具有可控制性、安全性、靶向性的转染系统，通过靶细胞表达转移后的基因片段，可以在局部持续获得治疗性的生长因子。     

基因治疗的现状与展望

综述了近三年人类基因治疗研究的有关进展,认为概念上比传统观点有所拓宽,从而开阔了思路,形成了策略多种和方法多样的局面。在临床上候选的治疗病种日益增多,已从先天性遗传病扩展到后天获得的疾病,如肿瘤等。同时也列举了目前有待解决的问题,指出了光明的前景。     

非病毒载体基因递送系统的研究进展

非病毒载体基因递送系统是相对于以病毒为载体的基因递送系统的另一种基因递送系统。具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特性。本文就非病毒基因载体的种类、在疾病治疗中的应用前景及存在的主要问题作一综述。     

烟雾吸入伤大鼠肺组织细胞凋亡及凋亡调控基因表达的变化

探讨细胞凋亡及凋亡调控基因在大鼠烟雾吸入性损伤发生、发展中的作用及意义。以大鼠烟雾吸入伤为模型，应用TUNEL、免疫组化及RT－PCR技术，观察烟雾吸入伤后不同时相肺组织中Bcl-2、Bax、Fas、Fas配体（FasL)基因mRNA及蛋白的表达状态及其与细胞凋亡异常之间的关系。结果显示，烟雾吸入伤后细胞凋亡指数升高；烟雾吸入伤后可上调Bcl-2、Bax、Fas、FasL表达，mRNA表达在12h达峰值，蛋白表达在24h最高。在各时相点Bax、Fas、FasL基因表达与肺组织细胞凋亡有正相关关系。提示烟雾吸入伤后细胞凋亡增加，细胞存活同时受生存基因（Bcl-2)和死亡基因（Bax、Fas、FasL)的双重调控，凋亡相关基因参与了烟雾吸入伤过程细胞凋亡的调控。     

人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：利用大肠杆菌表达具有生物活性的人降钙素（ｈＣＴ）。方法：以人类基因组ＤＮＡ，为模板，经ＰＣＲ扩增获取ｈＣＴ基因片段，测序分析克隆到ｐＵＣ１９载体中的ＰＣＲ产物，确定得到两种ＣＴ基因序列，其中１＾＃与文献报道完全一致，２＾＃序列中含有（Ｇ６４／Ａ）点突变，采用带有热诱导启动子的高效表达载体ｐＢＶ２２０，对所获得的基因进行了表达，并利用大鼠降血钙实验，对表达产物的活性进行了检测。结果：所获得的ｒ     

节律基因mPeriod2对Lewis肺癌细胞生长的影响

目的 研究节律基因mPeriod2(mPer2)对肿瘤细胞的生长抑制及诱导分化凋亡的作用。方法 体外培养Lewis肺癌细胞,使用脂质体包裹法将真核表达质粒pcDNA3．1为基础的mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转导入Lewis肺癌细胞内;以免疫组化及流式细胞技术检测mPer2表达;通过流式细胞技术检测稳定转染的mPer2阳性表达的Lewis肺癌细胞的生长及凋亡。结果 mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转染的Lewis肺癌细胞表达PERIOD2蛋白;与对照组比较,其增殖指数下降及凋亡率增加。结论 节律基因mPer2可以抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。     

分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒的构建

本文构建了分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒,并观察了这3种基因的表达情况。首先将K88亚单位基因克隆入痘苗转移或体PGJP-5中,得到嵌合质粒P_5-K88,将K99和LT-B亚单位基因分别克隆至痘苗转移载体PJ16中,得到重组质粒PJK-9和PLT-B。再经细胞体内同源重组技术,将以上3种基因分别插入到痘苗病毒天坛株的TK基因中,经5-BUdR的选择压力在人TK~--143细胞中挑选TK~-表型病毒,分别以相应的~(32)P标记的基因片段为探针进行杂交筛选重组病毒株。我们得到7株含K99亚单位基因的重组病毒V-K99(Ⅰ～Ⅷ),5株含K88亚单位基因的重组病毒V-K88(Ⅰ～Ⅴ);1株含LT-B亚单位基因的重组病毒V-LTB,ELISA检测结果表明,在以上3种重组病毒感染的人TK~--143细胞培养液和细胞裂解物中均未测出相应的基因表达产物。以上结果表明这3种基因可能不易在痘苗系统内有效表达。     

再生障碍性贫血与人类白细胞抗原相关性研究

应用国际标准的微量淋巴细胞毒方法，研究了我国东北地区汉族人群人类白细胞抗原（ＨＬＡ）Ⅰ、Ⅱ类基因遗传多态性与再生障碍性贫血（ＡＡ）易感性的关系。对３１例ＡＡ患者和１０１例健康无血缘关系者对照血样本进行分析。结果表明：ＡＡ患者具有显著高的ＨＬＡ－Ｂ１３、ＤＱ２（ＲＲ＝２．２，９．３；Ｐ＜０．０１），可能是易感等位基因或其连锁的一部分；而ＤＱ３在病例与对照中呈相反结果（ＲＲ＝０．５３，Ｐ＜０．０１），可能为一拮抗等位基因，提示ＨＬＡ基因系统差异对ＡＡ发病起着重要的免疫调控作用。     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

基因转移技术与基因靶向性核素治疗

随着在细胞分子水平上对疾病发病机制认识的深入,基因治疗已成为目前医学分子生物学最重要的研究领域之一。基因治疗过程中基因转移技术起着关键作用,携带目的基因的载体有待进一步开发和改进。在基因治疗过程中,需要进行基因监测,基因显像是其最有效的方法。将基因治疗与靶向核素治疗相结合,即"基因靶向核素治疗"为肿瘤基因治疗开辟了一条崭新的途径。