2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌β-溶血素的原核表达及其溶血活性检测

目的为进一步研究金黄色葡萄球菌β-溶血素的致病性及免疫保护作用,对金黄色葡萄球菌β-溶血素进行了表达。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从金黄色葡萄球菌中扩增出β-溶血素基因,将该基因克隆到原核表达载体PET-32a中,获得重组质粒PET-32aβ-,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测分析,并对纯化后表达产物进行平板溶血试验,检测其溶血活性。结果PCR扩增的β-溶血素基因片段全长为982bp;表达的β-溶血素重组蛋白大小为57kD;纯化的重组蛋白可使绵羊红细胞发生明显溶血。结论结果表明所克隆的β-溶血素基因在大肠杆菌中得到了良好的表达,并保持良好的溶血活性。     

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及原核表达载体构建

目的　构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes,LMO)溶血素基因重组表达质粒。 方法　本文采用PCR方法扩增出LMO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin ,hly)基因 ,将其克隆到pMD18-T中 ,筛选带有插入片段的阳性质粒。经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。继而用SalⅠ和XbaⅠ双酶切阳性质粒 ,目的片段定向插入pPROEXTMHTa中进行鉴定。结果　hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6bp。核苷酸序列鉴定后 ,其核苷酸序列与国外报道的LMOF6 789株、LMOF2 36 5株同源性分别为 99 70 %和 99 39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99 82 %和 98 90 %。重组表达质粒经PCR及酶切鉴定表明为正确重组子。结论　在国内首次克隆到LMOhly全基因 ,并构建出含hly基因的原核表达载体。此项工作为进一步LMO溶血素基因的表达奠定了基础。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273的原核表达及纯化

目的 原核表达猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273。方法 通过PCR方法检测该基因在不同血清型猪链球菌中的分布情况,然后利用获得的猪链球菌2型05SSU0273基因片段, 构建重组表达载体pET32a::05SSU0273。将质粒转入E. coli BL21中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot实验证实目的基因的表达, 然后以His亲和层析柱纯化重组蛋白。结果 在S. suis 2 35个血清型标准株中,有20株分离株扩增出目的条带。重组质粒可在宿主菌中高效表达,经镍柱亲和层析得到相对分子质量为43 kD的重组蛋白。结论 本实验成功获得S. suis 2 MCP蛋白,为研究其在猪链球菌2型致病过程中发挥的作用奠定了基础。     

粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定

目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。     

单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因的原核表达

目的为获得大量的单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lmo）溶血素（Hemolysin，hty）蛋白，以便研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制方面的作用。方法本文应用Primer Premier5．00设计引物，引入13amHI和x幻工酶切位点。以前期合成构建的pMDl8-T-hly质粒为模板，通过PCR方法扩增出Lmo0586株溶血素基因。相应酶切后，克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建pGEX-6p-hly重组质粒，转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。带有重组质粒pGEX-6p-hly的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE及免疫印记分析。结果PCR体外扩增hly基因产物大小约为1624bp，成功构建了重组表达质粒pGEX-6p—hly；SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为72ku，重组蛋白主要以包涵体形式表达。表达量占菌体总蛋白的20．8％；Western免疫印记表明具有良好的反应原性。结论在国内首次构建重组质粒pGEX-6p-hly，并以融合蛋白的形式进行了高效表达，同时该蛋白具有特异的抗原反应性，为研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制中的作用奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素基因表达及溶血活性检测

目的为了进一步研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α-溶血素(Hla)的分子致病机理及其抗原性,对S.aureusHla进行了表达纯化。方法用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureuswood46株中扩增出hla基因,将该基因经BamHI和SalI双酶切后克隆到表达载体PET-32a中,获得重组质粒pET-32a(+)/hla,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,然后进行纯化和用溶血试验检测其活性。结果扩增的hla基因序列与已发表的hla基因序列同源性为100%,构建的重组表达质粒pET-32a(+)/hla在E.coliBL21(DE3)中得到表达,重组α-溶血素蛋白为53kDa,纯化后的溶血活性为5000HU。结论成功表达并获得了有活性的重组Hla蛋白。     

铜绿假单胞菌LexA蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的克隆铜绿假单胞菌PAO1株的LexA蛋白编码区，在大肠杆菌中表达并纯化表达蛋白。方法提取铜绿假单胞菌PAO1株基因组DNA，PCR扩增LexA蛋白编码区，A—T克隆于质粒pMD18-T载体中。阳性重组子经酶切后，回收目的片段连接至相应线性化的表达型载体pET-28a（＋）中，重组质粒经测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21感受态，筛选高效表达株，表达产物经SDS-PAGE初步鉴定后，用镍珠吸附一步法纯化，表达蛋白转印PVDF膜后，经N-端测序证实。结果本研究成功克隆到PAO1株的LexA蛋白编码区并在大肠杆菌中获得表达，纯化表达蛋白经N-端测序证实确为PAO1的LexA蛋白。结论研究结果为铜绿假单胞菌PAO1株基因组中SOS盒的实验鉴定及LexA蛋白调控基因的筛选奠定了基础。     

猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的克隆表达猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH),并测定其酶活性。方法设计引物采用PCR法自海安病人分离株Habb基因组扩增GDH的编码基因gdh,进行序列分析;构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测;通过亲和层析纯化,获得融合蛋白GST-GDH,用凝血酶剪切去除GST,获得完整的GDH纯化蛋白后测定其酶活性。结果PCR法自猪链球菌菌株Habb基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族I的典型保守序列;体外构建筛选原核表达质粒pGEX4T-2-gdh,诱导重组体,表达的蛋白经PAGE初步测定其相对分子质量(Mr)约为71×103;用凝血酶酶切去除融合蛋白中的GST标签后得到的蛋白相对分子质量为45×103;GDH活性测定显示猪链球菌GDH利用α-酮戊二酸做底物,用NADPH做辅酶催化氨的同化和谷氨酸的合成。结论克隆并表达出猪链球菌GDH;猪链球菌GDH属于GDH蛋白家族I,是NADP(H)-特异性GDH。     

猪链球菌2型毒力因子部分片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型(Streptococcussuistype2)胞外蛋白因子(extracellularfactorprotein,EF)的基因(epf)序列,设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-H的基因组为模板,扩增epf基因1585-2547位序列,进行T/A克隆,转化入宿主菌DH5α中。提取阳性克隆质粒进行双酶切并纯化,将目的片段向克隆到表达载体pET-32a中组氨酸的下游,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导可表达分子量约为53000的融合蛋白。免疫转印分析表明,该融合蛋白具有EF的抗原表位。     

猪链球菌2型和9型菌株的多重PCR检测

目的建立一种快速、特异且敏感的检测方法。方法以猪链球菌2型和9型的荚膜多糖抗原编码基因簇中的cps2J和cps9H基因、猪链球菌2型的主要毒力因子编码基因epf和mrp为靶基因设计了四对引物,建立了检测猪链球菌的多重PCR反应体系。用编码cps2J和cps9H基因的引物可对猪链球菌2型和9型进行分型,用编码epf和mrp基因的引物可鉴定猪链球菌2型的主要毒力相关基因。用该多重PCR反应体系对10株猪链球菌分离株进行了鉴定,并以其它几株阴性对照菌株进行对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌2型菌株进行倍比稀释后进行菌落计数,并将之作为模板,对该多重PCR反应体系检测的敏感性进行了鉴定。结果10株猪链球菌分离株中有5株是9型菌株,另有5株是2型菌株,2型菌株有2种基因型:3株cps2+mrp+epf+型,2株cps2+mrp-epf-型。同时还表明该多重PCR反应体系有高度的特异性和敏感性,当模板含量在10cfu时仍能检出目的菌株。结论该多重PCR反体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。     

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。     

2型猪链球菌Rgg调控因子的序列结构分析及原核表达

目的 克隆2 型猪链球菌Rgg转录调控因子编码基因并进行原核表达和纯化,并对其进行生物信息学分析和结构预测.方法 PCR扩增2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组的rgg基因,构建重组表达质粒pQE30-rgg,转化大肠杆菌M15,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 鉴定表达产物;确定最佳诱导条件后,大量培养诱导重组表达菌,Ni²⁺亲和层析柱纯化重组蛋白,非变性PAGE电泳分析其体外聚合状态.结果 整个Rgg蛋白由15个α螺旋和2个β转角组成;构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,15 ℃过夜诱导获得可溶性重组蛋白的比例最高;获得了较高纯度的Rgg重组蛋白,并证实其在体外可形成同源二聚体.结论 成功地原核表达并纯化了Rgg重组蛋白,证明它存在二聚体结构,为进一步研究其调控机制奠定了基础.     

2型猪链球菌层粘连蛋白结合蛋白的原核表达及免疫原性检测

目的表达2型猪链球菌（Streptococcus suis2,S.suis2）层粘连蛋白结合蛋白（Lmb）并检测其免疫原性。方法 PCR检测lmb基因在不同血清型S.suis中的分布。将S.suis2中国强毒株05ZYH33的lmb基因克隆至表达载体pET32a,转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导表达,His亲和层析柱纯化重组蛋白。Western blot检测Lmb的免疫原性。结果 lmb基因存在于大多数S.suis血清型中。诱导表达并纯化后获得较高纯度的重组蛋白。重组Lmb能够和感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应。结论 lmb基因在S.suis不同血清型中广泛分布,Lmb在细菌感染宿主过程中表达,可以作为疫苗开发的候选分子。     

猪链球菌2型四川人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白基因的克隆和序列分析

目的对2005年猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，S．suis 2）四川资阳人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白（FBPS）基因进行克隆和序列分析。方法以ZYH18的基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白基因片段，克隆于pMD-T18栽体，构建成载体pMD-T—fbps，转化到宿主菌TG1中，进行序列测定（GenBank登录号为DQ345444）。测序结果与实验室保存的其它7株猪链球菌2型临床分离菌株测序结果及GenBank提交序列AF438158进行编码区基因的同源性比对。结果成功克隆了实验室保存的分离于不同时间和地点的，包括ZYH18在内的8株S．suis2临床分离菌株的．朋加基因，并对其编码区基因进行了同源性比对。结论实验室保存的8株菌的FBPS编码区基因同源性高达100％，并不因分离时间和地点的不同而不同；与GenBank提交序列AF438158同源性为99％，存在两个氨基酸的差异。     

gdh基因在猪链球菌中的分布及重组GDH的抗原性研究

目的了解谷氨酸脱氢酶基因(gdh)在不同血清型猪链球菌(S.suis)中的分布情况,分析重组谷氨酸脱氢酶(GDH)的抗原性,为其应用于S.suis感染诊断和疫苗研究提供实验数据。方法应用PCR方法检测不同血清型S.suis中的gdh;利用45 kD重组GDH制备多克隆抗体,Western blot方法分析S.suis各血清型菌株与多克隆抗体的反应以及实验感染S.suis2型的猪血清与重组GDH的反应情况。结果在S.suis35个血清型标准株中,除了22、26、27、29、32及34型以外,其余包括1、2、1/2、7、9和14型在内的29个血清型、61株国内外S.suis2型分离株全部扩增出目的条带。用重组GDH免疫小鼠,在小鼠血清中均检测到抗GDH的抗体;Western blot结果显示,全部被检菌株与抗GDH血清反应均有单一特异性反应条带,6份实验感染猪血清均能与重组GDH产生反应条带。结论重组GDH具有免疫原性和反应原性,该蛋白有可能作为建立诊断试验的候选抗原,为进一步开展相关的血清学诊断方法和疫苗研究奠定基础。