抑制整合素连接激酶（ILK）表达对大鼠肾小球系膜细胞细胞间隙连接蛋白43表达的影响

目的研究抑制整合素连接激酶（ILK）表达对大鼠肾小球系膜细胞（RMC）细胞间隙连接蛋白43（Cx43）表达的影响。方法将大鼠肾小球系膜细胞分为RMC组（n-6）、ILK-consiRNA转染组（n=6）和ILK-siRNA转染组（n=6）。合成抑制ILK基因的siRNA，待细胞长至60％融合后，ILK-siRNA转染组和ILK-con siRNA转染组分别用脂质体转染ILK-siRNA或ILK-con siRNA，RMC组仅加入脂质体，24h后收集细胞，提取总蛋白和总RNA，用RT-PCR和Western blotting观察ILK和Cx43 mRNA和蛋白的表达。转染后继续培养24、48、72h，MTT法检测细胞活力。结果与RMC组和ILK-con siRNA转染组比较，ILK-siRNA组ILK mRNA和蛋白的表达均下降30％-50％（P〈0.05，P〈0.01），Cx43 mRNA水平增加30％-40％（P〈0.05），Cx43蛋白水平增加60％-70％（P〈0.01）。应用ILK-siRNA转染系膜细胞后24、48、72h，细胞活力均显著高于RMC组和ILK-con siRNA转染组（P〈0.05，P〈0.01）。结论抑制ILK途径可上调肾小球系膜细胞Cx43的表达，增强细胞活力；Cx43的调节可能是部分通过ILK途径实现的。     

siRNA共转染沉默bcl-2和XIAP基因对UMSCC12细胞放射增敏作用的实验研究

目的 探讨同时沉默bcl-2和XIAP基因对头颈部鳞癌UMSCC12细胞放射敏感性的影响.方法 实验分为4组:对照siRNA转染组、siRNA-bcl-2转染组、siRNA-XIAP转染组和siRNA-bcl-2与siRNA-XIAP共转染组.采用siRNA bcl-2和siRNA-XIAP共转染头颈鳞癌细胞株UMSCC12,Western blot检测蛋白水平基因沉默的效果.以caspase-3和caspase-9活性检测自发和放疗诱导的凋亡,最后以克隆形成实验评价放射增敏效果.结果 共转染siRNA-bcl-2和siRNA-XIAP有效沉默了UMSCC12细胞bcl-2和XIAP的蛋白表达.caspase-3和caspase-9活性检测提示,单独沉默XIAP未增加细胞自发和放射诱导的凋亡.单独沉默bcl-2使放射诱导的凋亡增加,与对照siRNA转染组照射后相比,caspase-3和caspase-9的活性差异有统计学意义(t=5.32、6.27,P＜0.05),但未增加细胞自发的凋亡.共转染后的caspase-3和caspase-9活性在未照射时比对照siRNA转染组分别提高至1.36和1.34倍(t=11.47、6.22,P＜0.05),照射后分别提高至1.72和1.98倍(f=12.02、20.14,P＜0.05).克隆形成实验显示,与对照siRNA转染组比较,siRNA-XIAP的放射增敏比(SER)为1.06,siRNA-bcl-2的放射增敏比为1.15,siRNA-bcl-2与siRNA-XIAP共转染组的放射增敏比为1.41,比其他组显著升高.结论 与单独沉默bcl-2和XIAP相比,同时沉默bcl-2和XIAP增加了UMSCC12细胞的放射敏感性,其机制可能与增加了UNSCC12细胞自发和放射诱导的凋亡有关.     

细胞色素C依赖的线粒体途径在hTERT干扰促进肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

目的检测靶向RNAi抑制hTERT基因对HepG2肝癌细胞凋亡的促进作用及其与线粒体凋亡途径的关系,探讨hTERT干扰促进细胞凋亡的可能机制。方法收集第20代hTERT基因RNAi真核表达载体稳定转染细胞、对照细胞（转染空载体质粒）及未转染HepG2细胞,采用Western blot检测线粒体、胞质细胞色素C（cyt C）的表达及细胞内caspase-9、Bcl-2、Bax和hTERT的表达。结果与未转染细胞和对照细胞相比,转染细胞hTERT、Bcl-2和线粒体cyt C表达明显减少,Bax和胞质cyt C表达明显增加;未转染细胞及对照细胞仅见约46kD的前caspase-9条带,转染细胞可见46kD前caspase-9条带和35kD caspase-9 p35亚基条带。结论RNAi靶向抑制hTERT基因可通过抑制Bcl-2表达和促进Bax表达引起线粒体cyt C释入胞质,激活caspase-9促进HepG2肝癌细胞凋亡。     

EMMPRIN基因表达对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨特异性小分子干扰（small interference,siRNA）抑制人脑胶质瘤U251细胞株内细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）基因的表达后,对U251细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建EMMPRIN基因小干扰RNA,转染人胶质瘤U251细胞株,运用半定量RT-PCR及Western blot的方法验证转染组及对照组的胶质瘤细胞EMMPRIN基因mRNA及蛋白的表达水平,通过MTT法观察转染48 h后对U251细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染48 h后U251细胞周期及凋亡的改变。结果 EMMPRIN基因的特异性siRNA转染U251细胞后,EMM-PRIN基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加。结论 EMMPRIN基因的特异性siR-NA能抑制胶质瘤U251细胞株的增殖,促进细胞凋亡。     

沉默细胞周期检测点激酶1(Chk1)对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

目的 探讨siRNA沉默细胞周期检测点激酶1（Chk1）基因对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响。方法 合成Chk1基因的小分子干扰RNA（si-Chk1）,将si-NC或者si-Chk1分别转染到宫颈癌HeLa细胞中,0、2、4、6、8、10 Gy剂量的X射线照射细胞,RT-qPCR和Western blot检测转染后Chk1的mRNA水平和蛋白水平的表达,MTT方法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡,克隆形成实验检测转染后HeLa细胞放射敏感性,Western blot检测转染后P21蛋白和抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达水平。结果 si-Chk1转染到HeLa细胞后,HeLa细胞Chk1基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（t=2.12~5.86,P<0.05）,沉默Chk1的表达抑制了宫颈癌HeLa细胞的增殖（t=3.15~6.36,P<0.05）,同时降低宫颈癌HeLa细胞克隆形成能力（t=1.58~6.36,P<0.05）,上调P21（t=4.35,P<0.05）、下调Bcl-2蛋白（t=2.37,P<0.05）的表达水平。结论 siRNA沉默Chk1表达能够增强HeLa细胞放射敏感性。     

白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其机制

目的探讨白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela细胞的凋亡作用及其分子机制。方法应用不同浓度的白藜芦醇作用于人宫颈癌Hela细胞,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡、细胞周期分布：免疫组化法检测Survivin及Caspase-3的表达。结果白藜芦醇能明显抑制Hela细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。经白藜芦醇处理Hela细胞后,FCM分析发现各实验组S期细胞比例增高,G2／M期细胞比例减少,凋亡率明显高于对照组,并呈剂量依赖性（P〈0．01）;各实验组Heal细胞Survivin的表达均低于对照组,而Caspase-3的表达均高于对照组（P〈0．01）。结论白藜芦醇能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与抑制Survivin的表达、上调Caspase-3的表达有关。     

沉默EZH2诱导舌癌Tca-8113细胞凋亡及其对放射敏感性的影响

目的 探讨zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）对舌鳞癌细胞凋亡及放射敏感性的影响。方法 以舌鳞癌Tca-8113细胞为研究对象,细胞转染EZH2小干扰RNA（EZH2 siRNA1、EZH2 siRNA2）及小干扰RNA阴性对照（siRNA-NC）,RT-PCR和Western blot检测EZH2表达水平,筛选干扰效果较好的EZH2 siRNA2继续研究。将转染EZH2 siRNA2后的Tca-8113记为EZH2 siRNA2组,同时以不做处理的细胞为对照组,用8 Gy剂量照射转染siRNA对照组和EZH2 siRNA2细胞,并依次命名为照射组和联合组,四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测信号转导与转录因子3（STAT3）、磷酸化的STAT3（p-STAT3）、活性Caspase-3（Cleaved Caspase-3）表达。siRNA-NC组和EZH2 siRNA2组细胞用0、2、4、6、8 Gy剂量照射处理后,细胞克隆实验检测放射敏感性。结果 EZH2 siRNA1、EZH2 siRNA2均能够干扰舌鳞癌细胞中EZH2的表达,且EZH2 siRNA2干扰效果最好（t_mRNA=8.660,P_mRNA<0.01;t_蛋白=2.883,P_蛋白<0.05）。下调EZH2 siRNA2组细胞凋亡率为（29.90±1.64）%,联合组凋亡率为（38.17±1.59）%,二者比较,差异有统计学意义（t=4.742,P<0.05）,同时下调EZH2还可以降低p-STAT3水平,促进Cleaved Caspase-3蛋白表达。干扰EZH2表达后Tca-8113细胞辐射增敏比为1.668。结论 干扰EZH2表达能够协同放疗促进舌鳞癌细胞凋亡,抑制舌鳞癌细胞增殖,增加舌鳞癌细胞放射敏感性。     

siRNA抑制STAT3基因对HepG2细胞辐射敏感性的影响

目的 研究瞬时转染的siRNA抑制STAT3基因表达对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响。方法 以人肝癌HepG2细胞作为研究对象，脂质体包裹化学合成的siRNA进行转染。采用实时RT-PCR和Westernblotting法分别从mRNA水平和蛋白水平检测STAT3基因的表达及编码蛋白磷酸化活化的改变，用CCK-8法和Hoechst33258DNA染色法检测辐射敏感性的变化。结果STAT3特异性的siRNA转染后HepG2细胞中STAT3基因mRNA拷贝数、STAT3蛋白表达和磷酸化水平均明显降低。mRNA水平的抑制效率可达70％。siRNA转染联合60Coγ射线照射后HepG2细胞增殖活力显著低于对照组（P〈0．05）。结论 针对人STAT3基因的siRNA能够抑制HepG2细胞STAT3基因的表达，降低STAT3蛋白活化水平，进而产生辐射增敏作用。     

小干涉RNA质粒抑制Fn14表达对肝癌细胞增殖的影响

目的观察成纤维细胞生长因子诱导的早期反应蛋白14（Fibroblast growth factor-inducible immediate-early response protein 14、Fn14）表达对肝癌细胞增殖的影响。方法构建PAVU6-Fn14 siRNA干涉质粒并将其转染肝癌细胞株QGY7703，MTT法检测抑制Fn14蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响，在培养体系加入肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子（Tumor necrosis factor related weak inducer of apoptosls、TWEAK）蛋白后检测肝癌细胞增殖活性。结果成功构建PAVU6-Fn14 siRNA干涉质粒，转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑，培养体系加入TWEAK蛋白后肝癌细胞增殖活性仍受抑。结论Fn14蛋白表达降低可抑制肝癌细胞的增殖活性，应用RNA干涉技术抑制Fn14表达对肝癌细胞增殖具抑制作用。     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。     

Bcl-2基因特异性小干涉RNA增强食管癌细胞辐射敏感性的实验研究

目的 探讨Bcl-2基因特异性的小干涉RNA (siRNA)对食管癌细胞的辐射增敏作用。方法 构建表达Bcl-2基因特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入食管癌细胞EC109。Western blot检测Bcl-2蛋白在食管癌细胞的表达,流式细胞仪检测食管癌细胞的凋亡,克隆形成实验和裸鼠移植瘤生长抑制实验检测Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射对食管癌的生长抑制作用。结果 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可抑制Bcl-2蛋白在EC109细胞中的表达,诱导EC109细胞凋亡,增强X射线照射对EC109细胞克隆形成的抑制能力,增强X射线照射对EC109裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结论 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可显著增强食管癌细胞对X射线照射的敏感性,具有良好的临床应用前景。     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响.方法 应用RNAi技术,以化学合成的survivin小干扰RNA(siRNA)体外转染A549细胞,采用MTT法及流式细胞仪检测转染前后A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,通过RT-PCR及Western blot分析survivin mRNA和蛋白的表达情况.结果 survivin siRNA对A549的生长抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05),并能引起G1期细胞比率的增加和S期细胞相应的减少,诱导一定数量的细胞凋亡,转染后36、60、84、108、132h的IC50值分别为152.4、151.2、136.0、144.0、150.4nmol/L.100～200nmol/L siRNA转染组细胞的survivin表达在蛋白及RNA水平都显著低于对照组(P＜0.01),但空白对照组与空质粒组间无明显差异(P＞0.05).结论 应用siRNA沉默survivin基因可以下调肺腺癌A549细胞survivin的表达,进而抑制细胞生长、增殖并诱导细胞凋亡.RNAi的抑制效果具有特异、高效和持久的特点.     

多能干细胞核心调控基因Nanog介导生殖母细胞减数分裂的作用研究

目的 探讨多能干细胞核心调控基因Nanog在原始生殖纽胞(PGCs)向生殖母细胞方向分化过程中的作用.方法 取11.0d胎鼠PGCs,按胚胎干细胞(ES)培养标准进行体外胚胎生殖细胞(EG细胞)培养.采用脂质体方法将Nanog靶向特异性小干扰RNA(siRNA)转染人EG细胞.RT-PCR、免疫荧光法检测siRNA的沉默效率;在倒置相差显微镜下进行体外克隆计数,检测EG细胞增殖未分化状态;TUNEL法和透射电镜检测EG细胞凋亡情况;半定量RT-PCR检测与生殖母细胞减数分裂相关的标志基因(Mvh、Stra8、Sycp3)的mRNA表达.结果 转染siRNA后48h EG细胞Nanog mRNA和蛋白表达明显受抑,典型未分化EG细胞克隆数量显著下降,呈现分化现象,悬浮细胞增多.TUNEL法、透射电镜检测悬浮EG细胞呈现凋亡征象.伴随Nanog表达下调,Mvh、Stra8、Sycp基因mRNA表达上调.结论 到达生殖腺后,多能性PGCs发生生殖母细胞化,开始减数分裂,该过程可能与多能干细胞核心调控基因Nanog的表达下调有关.     

RNA干扰沉默cyclin D1基因表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭力的影响

 目的 利用RNA干扰技术下调cyclin D1基因表达,探讨其对乳腺癌细胞体外侵袭和迁移能力的影响,了解cyclin D1在肿瘤细胞转移的作用.方法 设计cyclin D1基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段siRNA51和siRNA52,脂质体介导转染入乳腺癌MDA-MB-231细胞株.应用Western印迹法检测转染前后cyclin D1表达水平;通过单层细胞划痕实验观察细胞转染前后迁移能力的变化,Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 乳腺癌MDA-MB-231细胞株转染cyclin D1的siRNA后,cyclin D1蛋白水平明显下调,细胞的迁移及侵袭能力明显减弱.结论 利用RNA干扰技术能够特异阻断cyclin D1基因表达;cyclin D1基因表达下调能够明显抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力.     

siRNA对骨肉瘤细胞细胞周期及survivin表达的影响

目的 构建人survivin特异性siRNA,探讨其对骨肉瘤细胞MG63细胞周期及survivin表达的影响.方法 构建survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系,以Western blot法检测survivin蛋白表达变化,透射电镜、Hoechst染色检测细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体PsiS,获得了稳定转染的细胞系.与正常MG63细胞、阴性对照细胞相比,MG63/PsiS细胞中survivin蛋白表达减少,部分细胞核致密浓染或碎块状浓染,凋亡率增加了7倍,而G2/M期细胞减少近50%.结论 特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在MG63细胞中的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.     

siRNA沉默EPAS1基因对低氧条件下大鼠PASMCs增殖的影响

目的 探讨应用siRNA技术沉默EPAS1 (HIF-2α)基因表达对低氧条件下培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响.方法 原代培养大鼠PASMCs共采用免疫荧光法进行鉴定.构建特异性EPAS1 siRNA脂质体,转染PASMCs,从3个干扰靶点中选取效果最好的靶点进行干扰;在常氧(37℃、5％CO2、20％O2)和低氧(37℃、5％CO2、2％O2)条件下分别培养24、48、72h,采用Western blotting检测PASMCs中EPAS1、VEGF蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况.结果 成功分离培养原代大鼠PASMCs并经免疫荧光鉴定证实.将特异性的EPAS1 siRNA脂质体转染到PASMCs,选择干扰效果最好的靶点2进行干扰.与常氧条件比较,低氧条件下PASMCs中VEGF蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高;沉默EPAS1后,无论低氧还是常氧条件下,PASMCs中VEGF蛋白的表达及细胞增殖水平均明显降低.结论 EPAS1基因参与了低氧条件下大鼠PASMCs增殖的调控,其调节可能是通过VEGF介导完成的.     

miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中作用的研究

目的 研究miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中的作用及其机制。方法 实时定量聚合酶链反应检测Raji细胞miR-155的表达,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测PTEN和p-AKT的表达。结果 miR-155 RNA和p-AKT蛋白在Raji细胞中表达较高,而pten基因mRNA和蛋白质表达水平极低,单纯4.0 Gy照射48 h后Raji细胞凋亡率较低;miR-155 siRNA不仅使miR-155 RNA和p-AKT表达水平明显下降,而且pten基因mRNA和蛋白质水平显著增高,同时细胞显示出增殖抑制作用,显著增加Raji细胞对该辐射剂量敏感性,siRNA+射线照射组细胞凋亡率为(36.78±1.35)%,高于单纯照射组(t=12.572,P<0.05)。结论 miR-155 表达对Raji细胞辐射敏感性具有重要影响,其机制与PTEN/PI3K/AKT信号途径激活有关。     

p53调控信号转导子和转录激活子3对肺癌细胞增殖及凋亡的影响

 目的 探讨p53调控信号转导子和转录激活子3(STAT3)对肺癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 细胞分组为空白对照组、阴性对照组、p53 小干扰RNA(siRNA)组、p53 siRNA+STAT3 siRNA组,采用western blot法检测组织中p53和STAT3蛋白表达水平;采用Transwell法检测转染后体外迁移能力和侵袭能力;采用流式细胞术膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶(AV-PI)双染法检测转染后凋亡情况。结果 肺癌组织中p53表达水平明显下调,而STAT3表达阳性率增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染p53的siRNA能显著上调肺癌细胞中STAT3的表达水平;p53 siRNA组和p53 siRNA+STAT3 siRNA组A549细胞凋亡率(17.91%±0.67%,22.51%±0.56%)、细胞的迁移速度[(55.16±6.50)μm/h,(63.30±5.98)μm/h]、穿膜细胞数(58.23±7.12,68.23±7.14),与空白对照组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 p53在肺癌中呈现低表达,p53能负向调控STAT3的表达,从而抑制其增殖和凋亡能力。     

NF-κBp65特异性siRNA的筛选和功能鉴定

目的:筛选有效的核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干扰核糖核酸(siRNA),优化反应条件,用来抑制白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞中一氧化氮合酶-2(NOS-2)和环氧合酶-2(COX-2)的表达,探讨siRNA技术在关节炎治疗方面的应用。方法:体外转录合成NF-κBp65特异性siRNA,质脂体转染软骨细胞,筛选出有效的siRNA。将筛选的siRNA转染培养的软骨细胞,再用IL-1β刺激诱导软骨细胞,提取蛋白质和RNA。利用RT-PCR和Westernblot从mRNA和蛋白质两水平检测NF-κBp65、NOS-2和COX-2的表达,采用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定NF-κB的活性。结果:NF-κBp65特异性siRNA有效干扰NF-κBp65的表达,降低NF-κB的活性,抑制IL-1β诱导的NOS-2和COX-2的表达。结论:NF-κBp65特异性siRNA可用于关节炎治疗的实验研究。