树血栓性脑缺血中心区及半暗区神经元PAF受体结合特性的研究

目的 :观察血栓性局部脑缺血过程中缺血中心区及半暗区血小板活化因子 (PAF)受体的消长变化 ,探讨PAF在脑缺血中心区及半暗区神经元继发性脑损伤中的分子机制。方法 :建立光化学诱导树鼠句血栓性局部脑缺血模型并提取树鼠句脑细胞膜蛋白 ,用 [3H]-PAF放射配体结合试验检测中枢神经细胞膜不同特性的PAF结合位点 (受体 )。结果 :树鼠句脑细胞膜上存在两种亲和性不同的PAF受体 ,即高亲和性和低亲和性受体 ,其亲和力 (kD)分别为 ( 3 61± 0 72 )nmol/L(kD1)和 ( 17 0 4± 2 4 1)nmol/L(kD2 ) ,相应的最大结合容量 (Bmax)分别为 ( 14 5 7 94± 168 0 1)pmol/g蛋白和 ( 5 0 17 4 0± 74 2 16)pmol/g蛋白。脑缺血 4、2 4h及 72h中心区、半暗区及对侧区高、低亲和性受体的kD值、Bmax值均显著低于假手术组 (P <0 0 1) ,中心区及半暗区尤为明显 ,其中以缺血后 2 4h的变化最为显著。结论 :PAF受体在介导缺血性脑损伤过程中起着重要作用 ,缺血中心区及半暗区机能代谢的不同与PAF受体亲和特性及最大结合容量改变不同有关 ,亦是PAF介导继发性脑损伤的重要分子基础     

树鼩脑缺血半暗区PAF受体介导的微环境改变及GB保护机制的探讨

目的研究树鼩血栓性脑缺血时,血小板活化因子(PAF)受体活化介导的缺血半暗区微环境改变,并探讨PAF受体拮抗剂—银杏内酯B(ginkgolide,GB)的神经保护机制。方法采用光化学诱导树鼩血栓性局部性脑缺血模型,用3H?PAF放射免疫标记法检测缺血区微环境脑细胞PAF受体亲合性(Kd值)和结合特性(Bm ax值)的变化;用密度梯度法及原子吸收分光法分别测定缺血微环境水含量及Na+、Ca2+含量,并于光化学反应后6 h静注GB(5 mg/Kg),观察其对脑血栓形成后24 h时缺血微环境的改善效应。结果树鼩脑血栓形成后缺血半暗区微环境的改变以24 h为著,脑细胞膜高亲和性、低亲和性PAF受体的Kd值及Bm ax值明显降低,其中Kd1及Bm ax1分别为(0.611±0.9)nM和(419.4±72.6)fmol.mg-1蛋白,Kd2及Bm ax2分别为(4.08±0.5)nM和(676.8±98.66)fmol.mg-1蛋白(与对照组相比P<0.01);GB可促使缺血微环境脑细胞PAF受体Kd及Bm ax的恢复,并具有改善局部脑水肿和缓解Ca2+超载(P均<0.01)。结论PAF受体活化在介导缺血半暗区微环境改变中具有重要作用,GB可改善缺血半暗区微环境和逆转PAF受体活化介导的神经元泵功能障碍。     

PAF拮抗剂对光化学反应后脑缺血中心区及半暗区单胺类递质的影响

目的：探讨血小板活化因子（PAF）与单胺类神经递质缺血性脑损伤中的可能机制，并观察PAF拮抗剂银杏内酯B对抗PAF所致脑缺血中心区及半暗区病理生理改变及其逆转单胺类递质代谢紊乱的作用。方法：采用光化学诱导树血栓性脑缺血模型，舌下静脉一次性注射银杏内酯B5mg·kg-1（光化学反应后6h），观察给药后缺血中心区及半暗区单胺类递质及脑水含量的变化。结果：给药组半暗区NE、DA及5－HT依次为（403．64±50.94）ng／gwt、（474．96±44．12）ng／gwt和（495．79±33．19）ng／gwt，均分别高于缺血组（254．95±42.26）ng／gwt（P＜0．01）、（403．28±34．86）ngwt（P＜0．01）和（410.58±33．24）ng／wt（P＜0．01）；而给药组半暗区脑水份含量为（81．75±0．80）％低于缺血组（83．85±0．96）％（P＜0．01）。结论：PAF与单胺类神经递质共同参与缺血性脑损伤，并且银杏内酯B能特异性拮抗PAF受体及减少单胺递质的释放而具有抗脑缺血效应。     

树鼩血栓性脑缺血时单胺氧化酶活性的变化及银杏内酯B作用机制探讨

目的:揭示血栓性脑缺血时缺血区和血清单胺氧化酶(MAO)活性变化及对血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)作用机理的探讨。方法:建立光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血模型,用酶比色法测量缺血后4、24及72h中心区、半暗区、对侧区及血清的MAO活性,并用双缩脲法测定上述各区的蛋白含量。结果:脑缺血后不同时间缺血中心区MAO活性显著低于假手术组或对侧区,以72h最为明显;此时缺血半暗区和血清MAO活性明显高于假手术组(P＜0.01)。光化学反应后6h舌下静脉一次注射PAF受体拮抗剂GB(5mg·kg^-1)后24h时,半暗区MAO活性明显低于缺血组,而中心区则高于缺血组(P＜0.01)。MAO活性变化与相应区域蛋白含量改变一致(r=0.81,P＜0.05)。结论:脑缺血后中心区、半暗区MAO活性改变是相应区域单胺类递质消长变化的主要原因,MAO活性变化与神经元蛋白质合成能力的改变有关;GB的脑保护作用与其拮抗PAF受体和调节MAO活性而促进递质平衡有关。     

光化学诱导树鼩脑缺血时半暗区PAF受体与MAO活性改变的相互关系

目的 :揭示树鼠句血栓性脑缺血半暗区血小板活化因子 (ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ＰＡＦ)受体与单胺氧化酶 (ｍｏｎｏａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ ,ＭＡＯ)活性改变之间的相互关系 ;探讨二者缺血半暗区形成及继发性脑损伤中的生物学作用。方法 :采用生物学特性接近于人的低等灵长类动物 -树鼠句 ,通过光化学反应诱导局部血栓性脑缺血 ,应用 [3Ｈ]-ＰＡＦ放射配体结合试验及酶比色法分别于实验后 4、2 4及 72ｈ检测缺血后中心区及半暗区ＰＡＦ受体亲和特点及ＭＡＯ活性的消长变化。结果与讨论 :脑缺血半暗区病理生理变…     

树鼩脑缺血时神经元线粒体渗透性转导孔开放对线粒体呼吸的影响

目的：揭示光化学诱导树鼩脑缺血后不同时间内，缺血神经元线粒体呼吸功能的变化，观察血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂银杏内酯B（GB）和免疫抑制剂环孢菌素A （CsA）对线粒体呼吸及神经元线粒体渗透性转导孔（MPT）开放的影响，探讨二者可能的神经保护机制及缺血时MPT开放与线粒体呼吸的相互关系。方法：建立光化学诱导树鼩脑缺血模型，分离缺血后4、24、72 h大脑皮层线粒体，用氧电极极谱法测定线粒体呼吸。于缺血6 h分别注射GB和CsA，24 h时观察相关指标。另取分离的线粒体，用CaCl₂诱导MPT开放，再分别加入CsA或GB，观察其对线粒体肿胀的影响。结果：缺血脑皮层神经元线粒体Ⅲ态呼吸速度、呼吸控制率（RCR）及磷氧比（P/O）逐渐下降，以缺血24 h的变化为著，与假手术组相比均有显著差异（P<0.01）。给予GB或CsA，Ⅲ态呼吸速度显著大于对照组（P<0.01），P/O比上升（P<0.05）。CaCl₂可诱导MPT开放，线粒体肿胀而透光率迅速下降，CsA有效阻滞了MPT开放，GB则不然。结论：光化学诱导树鼩局灶脑缺血后，缺血皮层线粒体呼吸明显障碍，GB或CsA可不同程度地改善缺血神经元线粒体代谢，可能与GB拮抗神经细胞膜上PAF受体活化，间接调节线粒体呼吸有关；而CsA主要通过抑制MPT开放而改善线粒体呼吸而具有神经保护作用。     

单胺类递质在光化学诱导树鼩血栓性脑缺血中心区及半暗区形成中的作用

目的和方法：光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血,用荧光分光光度法检测实验后４ 、２４ 及７２ ｈ 中心区及半暗区单胺类递质的变化,并用密度梯度法测定以上各区脑水份含量,以探讨单胺类递质代谢紊乱在缺血性脑损伤中的作用。结果：光化学反应后中心区与半暗区的多巴胺（ＤＡ） 、去甲肾上腺素（ＮＥ） 和５ － 羟色胺（５ － ＨＴ） 含量分别在４ 、２４ 及７２ ｈ 降至最低点（ 与假手术组相比Ｐ 均＜ ０－０１） ,然而５ － ＨＴ 的代谢产物—５ － 羟吲哚乙酸（５ － ＨＩＡＡ） 逐渐升高。中心区及半暗区脑水含量于实验后２４ ｈ 均达峰值（ Ｐ 均＜ ０－０１） 。结论：单胺类递质在光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血,尤其是半暗区形成中具重要作用;其病理生理改变,既是血栓性脑缺血的结果,又是继发性脑损伤、脑水肿以及迟发性神经元坏死（ ＤＮＤ） 的原因     

树鼩2型糖尿病加剧缺血性脑损伤的可能机制

目的 建立树鼩2型糖尿病（T2DM）合并脑缺血模型,探讨代谢异常加剧缺血性脑损伤的可能机制。 方法 将36只健康成年树鼩随机分为4组,即对照组、脑缺血组、T2DM组及T2DM +脑缺血组(每组n=9)。采用高脂饲养联合链脲佐菌素（STZ）注射建立实验性糖尿病模型,通过光化学反应诱导树鼩局部血栓形成,以临床症状最突出的缺血后24 h作为观察的时间点,通过血清生化指标的检测了解机体代谢状态,采用2,3,5-氯化三苯基甲氮唑（TTC）、HE染色及透射电子显微镜观察超微结构对缺血性脑损伤进行评价。 结果 树鼩T2DM和T2DM合并脑缺血组树鼩的体重有所降低［(120.29±13.82) g］,但差异无统计学意义,而血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白固醇（LDL-C）及甘油三酯（TG）明显升高,分别为（26.75±10.60）mmol/L、（7.40±3.26) mmol/L、（2.93±0.70）mmol/L、（1.93±0.63）mmol/L（P<0.05）和（32.29±6.08）mmol/L（7.80±3.41) mmol/L、（3.06±0.95）mmol/L和（1.73±0.29）mmol/L,（P<0.01）; 血清C-反应蛋白（CRP）水平明显升高［（1.43±0.53）mg/L,P<0.01］。糖尿病树鼩合并脑缺血时上述指标的改变更为明显,神经元受损及脑梗死面积明显增加［（19.56±1.25）%,P<0.01］。 结论 T2DM树鼩代谢异常可加剧缺血性脑损伤,其机制可能与高血糖及CRP协同作用引起的炎症反应有关。     

树鼩血栓性脑缺血时单胺氧化酶活性的变化及银杏内酯B作用机制探讨

目的 :揭示血栓性脑缺血时缺血区和血清单胺氧化酶 (MAO)活性变化及对血小板活化因子 (PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)作用机理的探讨。方法 :建立光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血模型 ,用酶比色法测量缺血后4、2 4及 72h中心区、半暗区、对侧区及血清的MAO活性 ,并用双缩脲法测定上述各区的蛋白含量。结果 :脑缺血后不同时间缺血中心区MAO活性显著低于假手术组 [(15 4 1± 1 6 3)× 10 3 U/g蛋白 ]或对侧区 [(15 4 7± 1 6 8)× 10 3 U/g蛋白 ],以 72h最为明显 [(2 19± 1 96 )× 10 3 U/g蛋白 ,P <0 0 1];此时缺血半暗区和血清MAO活性 [分别为 (2 5 30± 2 0 1)× 10 3 U/g蛋白和 (2 10 0 4± 2 6 6 7)× 10 3 U/L]明显高于假手术组 (P <0 0 1)。光化学反应后 6h舌下静脉一次注射PAF受体拮抗剂GB(5mg·kg-1)后 2 4h时 ,半暗区MAO活性明显低于缺血组 ,而中心区则高于缺血组 (P <0 0 1)。MAO活性变化与相应区域蛋白含量改变一致 (r=0 81,P <0 0 5 )。结论 :脑缺血后中心区、半暗区MAO活性改变是相应区域单胺类递质消长变化的主要原因 ,MAO活性变化与神经元蛋白质合成能力的改变有关 ;GB的脑保护作用与其拮抗PAF受体和调节MAO活性而促进递质平衡有关。     

JAK2-STAT3信号通路在树鼩脑缺血后适应中的作用机制

 目的：观察JAK2-STAT3信号转导通路在树鼩缺血后适应（ischemic postconditioning,IPoC）神经保护中的调控作用,探讨阻断JAK2-STAT3通路后脑损伤加重的机制。方法：通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次（每次5 min）实施IPoC。于IPoC前10 min侧脑室注射AG490（JAK2抑制剂）后,采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE染色和电镜观察脑皮层神经元形态改变及超微结构变化,应用Western blot检测IPoC及AG490处理后皮层t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的变化。结果：缺血24 h,皮层神经元固缩,线粒体肿胀,嵴溶解;脑梗死面积占半脑面积的（24.78±3.30）%;此时皮层神经元STAT3磷酸化水平明显增高（P<0.01）。IPoC后皮层神经元损伤减轻,线粒体肿胀改善,脑梗死面积占半脑面积的百分比减小为（17.67±1.83）%（P<0.01）,STAT3磷酸化水平进一步增高（P<0.01）。然而,给予AG490处理后,皮层神经元损伤加重,脑梗死面积再次增大为（23.85±2.77）%（P<0.05）,STAT3磷酸化水平则明显降低（P<0.05）。结论：IPoC可能通过调控STAT3的磷酸化而减轻树鼩缺血性脑损伤,抑制JAK2-STAT3信号通路可抵消IPoC的保护效应而加重脑损伤。     

益气活血方和补肾生髓方对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带Notch-1和Jagged1表达的影响

目的:探讨益气活血方和补肾生髓方对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带Notch-1和Jagged1蛋白表达的影响。方法:线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。随机分为假手术组、模型组、益气活血方防治组和补肾生髓方防治组。脑缺血2h,分别再灌注1周、2周、3周,采用免疫组化SABC法检测Notch-1和Jagged1蛋白表达的阳性总面积和平均吸光度。结果:在缺血侧额顶叶皮质缺血半暗带,再灌注各时点,模型组Notch-1和Jag-ged1蛋白表达的阳性总面积和平均吸光度显著高于假手术组(P0.05或P0.01),2种中药复方组再灌注各时点Notch-1和Jagged1蛋白表达的阳性总面积和(或)平均吸光度显著低于模型组(P0.05或P0.01)。结论:2种复方能通过降低缺血半暗带Notch-1、Jagged1蛋白表达,抑制Notch信号转导通路。     

缺血后适应对树鼩脑缺血信号转导及转录激活因子3过磷酸化的调控作用

目的观察信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化在树鼩脑缺血后适应(PC)神经保护中的作用,并探讨其可能机制。方法将50只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血4 h组、脑缺血24 h组、后适应4 h组和后适应24 h组(每组n=5),其中10只动物做HE染色(n=5)及电子显微镜观察(n=5)。本实验通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施缺血PC。采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE和电子显微镜观察脑皮质和海马组织学改变及其超微结构变化,应用Western blotting检测皮层总STAT3(t-STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达变化。结果脑缺血后皮层血管内皮细胞肿胀,皮层及海马神经元损伤,线粒体肿胀、嵴溶解,以缺血24 h损伤最为明显,脑梗死面积达到(24.78±2.06)%。而皮层p-STAT3蛋白表达随缺血时间延长呈增高趋势,缺血4 h p-STAT3蛋白表达明显增高(0.24±0.1,P<0.01),缺血24 h p-STAT3蛋白表达则持续增高(0.32±0.1,P<0.01)。缺血PC处理后皮层血管内皮细胞水肿好转,皮层及海马神经元损伤减轻,脑梗死面积减小为(17.67±1.90)%(P<0.01)。与缺血组相比,缺血PC 4 h p-STAT3蛋白表达进一步升高(0.41±0.09,P<0.01),缺血PC 24 h p-STAT3蛋白表达增高更加显著(0.70±0.11,P<0.01)。结论树鼩脑缺血可导致STAT3磷酸化代偿性增强,缺血PC的脑保护作用可能与其促进STAT3过磷酸化有关。     

高血糖和脑缺血对树鼩皮层不同区域VEGF表达的影响

目的：研究高血糖及局灶性脑缺血条件下,树鼩皮层不同区域VEGF表达的变化,探讨脑缺血、高血糖与VEGF之间的相互关系。方法：用链脲佐菌素复制树鼩高血糖模型,并建立光化学诱导皮层局灶性脑缺血,观察缺血4 h、24 h及72 h的病理形态学改变并计数海马神经元密度,用免疫组化法测定上述时间树鼩缺血中心区、半暗带、对侧皮层VEGF表达的动态变化。结果：形态学观察显示,光化学反应后4 h照射区皮层可见梗塞灶;24 h病损达高峰;72 h伴随胶质细胞增生等修复性反应。相应时点高血糖加缺血组的损伤大于缺血组,以缺血后24 h(P<0.01)和72 h(P<0.05)尤为显著。免疫组化染色表明,缺血后4 h皮层缺血半暗区可见VEGF表达增加, 24 h达高峰,72 h减弱;单纯高血糖也使VEGF表达上调;高血糖加缺血组VEGF表达强于单纯高血糖组(P<0.05),但高血糖加缺血组与缺血组的同期值比较,无显著差异。结论：(1)在低等灵长类动物树鼩体内注射链脲佐菌素,并结合血栓性局部脑缺血方法学的应用能成功复制出实验性高血糖及脑缺血模型;(2)实验证明高血糖对局灶性脑缺血有恶化加重作用;(3)脑缺血及高血糖均可分别作为独立因素诱导VEGF的表达;但缺血与高血糖相加对VEGF表达未显示出叠加效应。     

Retinal [I]iodomelatonin binding sites in the tree shrew (Tupaiidae)

The characteristics of melatonin-binding sites labelled by [¹²⁵I]iodomelatonin in membrane preparations from the tree shrew retina were determined. Specific binding of [¹²⁵I]iodomelatonin to the membrane preparations of tree shrew retina was rapid, stable, saturable, and reversible. Among the indoles tested only 6-chloromelatonin, melatonin and N-acetylserotonin had significant affinities to the [¹²⁵I]iodomelatonin binding site. Scatchard analysis of the membrane preparations revealed a dissociation constant (K_d) of 51.0 ± 16 pM and total number of binding sites (B_max) of 1.97 ± 0.6 fmol/mg protein.     

Down-regulated Na+/K+-ATPase activity in ischemic penumbra after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats

This study was aimed to examine whether the Na⁺/K⁺ adenosine triphosphatase (Na⁺/K⁺-ATPase) activity in ischemic penumbra is associated with the pathogenesis of ischemia/reperfusion-induced brain injury. An experimental model of cerebral ischemia/reperfusion was made by transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) in rats and the changes of Na⁺/K⁺-ATPase activity in the ischemic penumbra was examined by Enzyme Assay Kit. Extensive infarction was observed in the frontal and parietal cortical and subcortical areas at 6 h, 24 h, 48 h, 3 d and 7 d after tMCAO. Enzyme Assay analyses revealed the activity of Na⁺/K⁺-ATPase was decreased in the ischemic penumbra of model rats after focal cerebral ischemia/reperfusion compared with sham-operated rats, and reduced to its minimum at 48 h, while the infarct volume was enlarged gradually. In addition, accompanied by increased brain water content, apoptosis-related bcl-2 and Bax proteins, apoptotic index and neurologic deficits Longa scores, but fluctuated the ratio of bcl-2/Bax. Correlation analysis showed that the infarct volume, apoptotic index, neurologic deficits Longa scores and brain water content were negatively related with Na⁺/K⁺-ATPase activity, while the ratio of bcl-2/Bax was positively related with Na⁺/K⁺-ATPase activity. Our results suggest that down-regulated Na⁺/K⁺-ATPase activity in ischemic penumbra might be involved in the pathogenesis of cerebral ischemia/reperfusion injury presumably through the imbalance ratio of bcl-2/Bax and neuronal apoptosis, and identify novel target for neuroprotective therapeutic intervention in cerebral ischemic disease.     

Sex differences in GABAA receptor binding in rat brain measured by an improved in vitro binding assay

Summary The distribution of GABA_A receptor sites was studied in female and male rat brain by an improved in vitro binding assay using ³H-muscimol and carefully washed membrane fractions. The binding studies revealed a single class of binding sites exhibiting the properties of GABA_A receptors. The specific binding of ³H-muscimol was measured in four brain areas: the preoptic brain area, mediobasal hypothalamus, corticomedial amygdala and cerebral cortex. The equilibrium dissociation constants (K _D) ranged from 11.2 to 23.3 nM in diestrous females and from 13.1 to 50.4 nM in males, the maximal number of binding sites (B _max) from 3290 to 10240 fmol/mg protein in females and from 5495 to 17449 fmol/mg protein in males. In the preoptic area and mediobasal hypothalamus both, K _D and B _max, were significantly higher in males than in females. The sex differences in the binding of muscimol observed in vitro indicated sexually dimorphic GABAergic neurotransmission that is probably related to the control of gonadotropin secretion and/or sexual behavior.Supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grant Hi 399/1.     

心通胶囊对心肌缺血大鼠心室肌亚硝酸盐和cGMP含量的影响

目的:探讨心通胶囊对实验性大鼠心肌缺血的预防效果及其与一氧化氮形成的相关机制。方法:应用垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血模型,以心电图上ST段的抬高作为心肌缺血的指标。测定大鼠心肌缺血心室肌组织一氧化氮(NO)代谢产物(NO₂^-/NO₃^-)和cGMP含量。结果:急性心肌缺血组大鼠的心室肌组织NO₂^-/NO₃^-和cGMP含量分别为(486±59)nmol/gprotein和(0.38±0.08)nmol/gprotein,明显低于正常对照组大鼠的NO₂^-/NO₃^-和cGMP含量,有显著差异(P＜0.01);急性心肌缺血前使用心通胶囊组的心室肌组织NO₂^-/NO₃^-和cGMP含量为(845±105)nmol/gprotein和(0.51±0.10)nmol/gprotein明显高于缺血组(P＜0.01)。与正常组比较,缺血组的心电图ST段抬高明显抬高(P＜0.05);心肌缺血前使用心通胶囊,可使心肌缺血得以改善。结论:心通胶囊提高急性心肌缺血大鼠心室肌组织的NO含量,进而使cGMP含量升高,达到改善心肌缺血的作用。