小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

干细胞因子mRNA在原代白血病细胞的表达

目的：观察白血病原代细胞中干细胞因子（SCF）mRNA的表达情况并探讨其与预后的关系。方法：以巢式逆转录多聚酶链反应检测了49例（两种类型）白血病患者骨髓原代白血病细胞中SCF mRNA的表达情况。结果：在19例急性淋巴细胞白血病（ALL）中,SCF mRNA5例阳性,14例阴性,30例急性髓性白血病（AML）中,24例M1-M4亚型者表达SCF mRNA,4例M5及2例M6为阴性。两组间有显著差异（P＜0．05）。在29例SCF阳性者中,8例（27．6％）属难治性白血病,在20例CSF阴性者中,12例（60．0％）为难治性白血病（P＜0．05）。结论：AML组的SCF表达率显著高于ALL,SCF阴性提示患者预后较差,其确切机制有待进一步研究。     

干细胞因子与粒细胞集落刺激因子联合用于外周血干细胞移植动员的研究

粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony-stimulat-ing factor,G-CSF)和干细胞因子(stem cell factor,SCF)是人类血细胞生成过程中的两个重要的细胞因子,G-CSF早已用于外周血干细胞移植(peripheral blood stemcells transplantation,PBSCT)时外周血干细胞(PBSC)的动员并且取得确切的效果.近年来SCF与G-CSF协同用于PBSC动员的研究不断增多,现就此作一综述.     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达。方法采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达。结果构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×10³的融合蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础。     

外源性分化抑制因子Id2在C2C12细胞中的表达

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体,并观察外源性Id2基因C2C12细胞中的表达。方法：RT-PCR扩增出Id2全长cDNA,T4DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2cDNA进行连接,构建克隆载体,经限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGFP-C2真核表达载体,构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2,经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性;通过电穿孔转染法将外源性Id2基因导入C2C12成肌细胞中。分别于转染4、8、12、24、36、72h后通过荧光倒置显微镜下观察细胞整体情况,并计算转染效率。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向I（12cDNA片段,获得高转染率和高表达外源性Id2基因的C2C12细胞,转染8h时,转染效率约为（10．5±2．8）％;转染12h后,转染效率约为（20．9±3．1）％;转染24h后,转染效率最高,约为（60．8±3．2）％。结论：成功构建了同时携带有G418筛选位点和Id2基因的真核表达载体;并获得高表达外源性Id2基因的C2C12细胞。     

B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134—285AA)的cDNA片段，该片段以限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA^263→ATG^263)突变并导致了氨基酸(1263M)突变外，其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，SDS—PAGE表明：在33ku处有明显的融合蛋白表达，其表达水平高达总茵体蛋白的50％。点印迹证实融合蛋白能与anti—His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。     

细胞表面黏附分子在造血干细胞动员中的作用机制

目的　研究粒系集落刺激因子 (G CSF)进行干细胞动员时干细胞表面黏附分子的变化 ,从黏附分子角度说明G CSF的动员机制。方法　将重组人G CSF(惠尔血 )或生理盐水注射于小鼠皮下 ,每日两次 ,连续 7d ,收集G CSF使用前后骨髓和外周血单个核细胞 ,计数外周血Sca 1 干细胞数目和骨髓有核细胞数 ,同时分别检测细胞表面CD49d、CD44的表达和干细胞与骨髓基质蛋白黏附能力的变化。结果　重组人G CSF对小鼠有和人类相似的动员作用 ,使用G CSF 7d后外周血Sca 1 细胞数增高近 2倍 ,骨髓有核细胞数明显下降 ,同时骨髓和外周血单个核细胞表面CD49d表达以及细胞黏附能力都有所下降 ,而对照组无类似现象。结论　G CSF可能通过降低某些黏附分子的表达 ,削弱造血细胞与骨髓基质的黏附而产生动员效果     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

中国人膜结合型干细胞因子cDNA的克隆及初步表达

目的 获得干细胞因子的cDNA以利于进一步对干细胞因子的重组表达进行研究。方法 利用RT-PCR技术,从中国妇女早期妊娠的蜕膜和绒毛膜组织总RNA中扩增得到660bp的干细胞因子cDNA,克隆入质粒pGEM-4z载体构建了pGSM重组质闰,将已测定序列的cDNA亚克隆入pET-11c质粒,得到干细胞因子的重组表达质粒pESM。结果 证实所 获序列是外显子6缺失的膜结合型干细胞因子cDNA,且其分子量与预期的一致。结论 成功克隆了膜结合型干细胞因子的cDNA。     

糖皮质激素对支气管哮喘患者血清干细胞因子表达的影响

目的检测干细胞因子（stem cell factor,SCF）在哮喘患者糖皮质激素治疗前后血清中的含量,评价糖皮质激素对SCF在支气管哮喘中的影响及意义。方法选择2009年3月～2010年4月入住我院呼吸科的支气管哮喘急性发作期患者33例作为研究对象,使用糖皮质激素进行治疗,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其治疗前后的血清SCF水平,同时测定25例正常对照血清SCF水平。结果糖皮质激素治疗后患者血清中SCF的含量较对照组明显增高（P〈0.05）;治疗后患者血清中SCF的含量显著低于治疗前水平（P〈0.05）;治疗缓解后患者血清中SCF的含量与对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论糖皮质激素治疗可降低SCF的表达,SCF在哮喘发病及病情判断中可能起重要作用。     

原位逆转录PCR检测千细胞因子mRNA在白血病细胞的表达

目的探索应用原位逆转录PCR(RT-PCR)检测低拷贝的干细胞因子mRNA在白血病细胞表达的可行性.方法在普通的PE480型PCR仪进行原位RT-PCR,检测干细胞因子mRNA在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞的表达.结果直接法和间接法原位RT-PCR均可以检测到干细胞因子mRNA在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞表达,而常规的原位杂交则为阴性.结论(1)干细胞因子在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞均有表达,但是表达量较低,应用原位RT-PCR可进行检测;(2)在普通的PE480型PCR仪上可以进行原位PCR.     

SCF/c-kit过度激活在肠易激综合征内脏敏化中的作用

目的研究SCF/c-kit通路过度激活在肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)内脏敏化中的作用。方法用旋毛虫感染大鼠致肠易激综合征模型30只,随机分为3组:IBS组、IBS结肠扩张组和IBS给予甲磺酸伊马替尼(imatinib mesy-late,STI-571)干预加结肠扩张组。另外选择20只正常大鼠,随机分为正常组和正常结肠扩张组。采用免疫荧光组织化学和电生理学的方法观察各组大鼠肠道ICC活化及其腹直肌肌电和骶髓后连合核(dorsal commissural nucleus,DCN)放电频率的变化。结果 IBS结肠扩张组的肠道Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)活化程度、腹直肌肌电变化及DCN放电频率比正常组、正常结肠扩张组、IBS组和IBS结肠扩张并给予STI-571组均显著增强。结论 SCF/c-kit的过度激活导致的ICC发生变化可能是IBS的内脏敏化发生的最为重要的基础。     

鼠bcl-XL基因在CHO细胞中的表达

目的：构建携带鼠bcl-XL基因的真核表达载体，并将其在CHO细胞中表达。方法：用反转录PCR获取鼠bcl-XL全长cDNA序列，将其克隆进pEGFP重组融合表达质粒，脂质体法转染CHO细胞，荧光检测目的蛋白表达。结果：成功获得了鼠bcl-XL cDNA，构建了编码鼠bcl-XL的真核融合表达载体pEGFP-bcl-XL，转染CHO细胞后观察到融合蛋白表达。结论：鼠bcl-XL基因的克隆及融合表达，为进一步在高密度、大规模细胞培养中利用bcl-XL具有重要意义。     

Gene cloning of murine α-fetoprotein gene and construction of its eukaryotic expression vector and expression in CHO cells

Summary To clone the murine α-fetoprotein (AFP) gene, construct the eukaryotic expression vector of AFP and express in CHO cells, total RNA were extracted from Hepa 1–6 cells, and then the murine α-fetoprotein gene was amplified by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1. The recombinant of vector was identified by restriction enzyme analysis and sequencing. After transient transfection of CHO cells with the vector, Western blotting was used to detect the expression of AFP. It is concluded that the 1.8 kb murine α-fetoprotein gene was successfully cloned and its eukaryotic expression vector was successfully constructed. YI Jilin, male, born in 1953, Professor     

脑缺血再灌注损伤后神经细胞干细胞因子mRNA表达

目的:观察神经细胞干细胞因子(SCF)mRNA在大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间,不同部位的表达情况。方法:成年SD大鼠,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO模型),随机分为缺血1.5h、再灌注2h至14d组和假手术组。原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织不同部位的SCFmRNA表达情况。结果:脑缺血再灌注后,SCFmRNA的表达在皮质区及纹状体区均明显高于假手术组,于7d达高峰,14d下降。结论:脑缺血再灌注后SCFmRNA表达在脑内不同部位、不同时间具备同样的规律,可能具有促进内源性神经干细胞的增殖作用。     

PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究

目的 克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础.方法 采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs.采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性.结果 经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致.成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达.bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性.结论 成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达.bMSCs转染PDGF-A后仍具于细胞特性.     

脂肪源间充质干细胞对小鼠急性肾损伤后干细胞因子及其受体表达的影响

目的研究脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)对急性肾损伤(AKI)的治疗作用,并探讨ADMSCs治疗小鼠AKI可能的机制。方法 30只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组,每组10只。应用腹腔注射顺铂建立AKI模型,治疗组于注射顺铂12 h后尾静脉注射ADMSCs悬液,模型组于注射顺铂12 h后尾静脉注射等量生理盐水。注射顺铂7 d后处死小鼠,通过测定血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平及观察小鼠肾组织形态学改变判断肾损伤情况;免疫组织化学法检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、干细胞因子受体(c-KIT)及干细胞因子(SCF)表达情况。结果与模型组比较,治疗组BUN、Scr和NGAL水平显著下降(P<0.01),肾小管坏死(ATN)评分显著降低(P<0.01),c-KIT、SCF表达显著增加(P<0.01);与正常对照组比较,模型组c-KIT、SCF表达亦显著增加(P<0.01)。结论在AKI小鼠模型中,外源性ADMSCs可能通过旁分泌SCF、c-KIT,并激活SCF/c-KIT信号通路来促进肾小管细胞的修复,继而达到保护受损肾脏的作用。     

原位逆转录PCR检测干细胞因子mRNA在白血病细胞的表达

目的：探索应用原位逆转录PCR（RT－PCR）检测低拷贝的干细胞因子mRNA在白血病细胞表达的可行性。方法：在普通的PE480型PCR仪进行原位RT－PCR，检测干细胞因子mRNA在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞的表达。结果：直接法和间接法原位RT－PCR法可以检测到干细胞因子mRNA在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞表达，而常规的原位杂交则为阴性。结论：（1）干细胞因子在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞均有表达，但是表达量较低，应用原位RT－PCR可进行检测；（2）在普通的PE480型PCR仪上可以进行原位PCR。