原发性肝癌内HBV DNA及HBAg的分布与意义

采用原位分子杂交和免疫组化及双标记技术,对44例原发性肝细胞肝癌及痛旁肝组织进行了乙型肝炎病毒DNA及其表达产物x抗原、核心抗原检测。癌组织中HBV DNA、HBxAg、HBcAg检出率分别为70.5％、65.9％及20.5％;癌旁肝组织依次为76.5％、76.5％及29.4％。HBV DNA及HBxAg主要位于肝细胞浆中,在HBcAg阳性组中的检出率高于HBcAg阴性组(P<0.05)。9例枯否氏细胞浆有HBxAg检出。HBVDNA在癌及癌旁组织中的检出有“伴随现象”。HBcAg多位于核内,部分为核浆型,且总是伴随HBV DNA和(或)HBxAe检出,无一例单独检出HBcAg者。此外,HBxAg可由肝内游离型HBV DNA所表达;肝内核型或浆型HBcAg均可反映HBV的复制。因此,肝内HBxAg的检测可作为HBV感染的灵敏指标之一,进一步证实HBV感染与HCC的发生有密切关系。     

原发型肝癌的肝内HBVDNA整合状况

应用~(32)P标记的克隆HBVDNA片段探针对30例原发型肝癌病人的肝内组织进行了DNA电泳转移Southern杂交。结果检出HBVDNA整合者21例(70％),其中癌组织整合者18例(60％),癌外组织整合者16例(53％),双份组织均整合者13例(43％)。杂交带分析发现,不同例和同例肝内不同组织的HBVDNA整合模式都不相同,提示整合具随机性并可能发生整合和/或侧翼序列的基因重排。由于探针含HBV基因组中1.4～2.8kb的DNA顺序,故结果实际反映S基因及其下游增强子的整合状况。基因重排和增强子插入整合并活化细胞原癌基因的致癌机理在本文也进行了初步探讨。     

肝癌患者血清乙肝病毒e抗原与肝细胞HBV cccDNA水平的相关性

目的 探讨肝细胞癌(HCC)感染乙型肝炎病毒(HBV)患者乙肝病毒e抗原(HBeAg)与患者癌及癌旁组织内HBV DNA、cccDNA水平的关系.方法 收集2012~2015年解放军第105医院96例接受肝癌切除术HBV相关HCC患者血清及其癌和癌旁组织,用荧光探针法检测HBV DNA和cccDNA水平,化学发光法检测血清HBeAg水平,比较不同感染阶段HCC患者[HBeAg(+)/HBeAb(-)组、HBeAg(﹢)/HBeAb(﹢)组及HBeAg(-)/HBeAb(﹢)组]血清及组织HBV DNA水平及cccDNA的差异,分析HBeAg与肝细胞HBV DNA及cccDNA的关系,并使用血清学指标构建HBV DNA及cccDNA回归模型.结果 HBeAg(+)/HBeAb(-)组血清HBV DNA[(5.5 ±1.1)log10U/mL]、癌旁组织HBV DNA[(7.0 ±1.5)log10U/106cells]及cccDNA[(5.4 ±1.3)log10U/106cells]水平高于HBeAg(-)/HBeAb(+)组[(4.5 ±1.0)log10U/mL、(5.7 ±1.0)log10U/106cells、(4.2 ±0.9)log10U/106cells],差异均有统计学意义(P<0.05).肝癌患者HBeAg与癌旁组织HBV DNA(r=0.476,P<0.05)和cccDNA(r=0.549,P<0.05)存在相关性.不同TNM分期HCC患者HBeAg与癌旁组织内HBV DNA及cccDNA均相关(P<0.05).使用血清学指标构建的回归模型预测癌旁组织HBV DNA及cccDNA的变化R2值分别为0.549及0.542(P<0.05).结论 肝癌患者血清HBeAg与癌旁组织中HBV DNA及cccDNA存在相关性,且不受分期影响,血清学指标回归模型可用于肝癌患者组织HBV DNA及cccDNA的辅助监测.     

生物素标记HBV DNA探针在肝石蜡切片上作原位杂交技术的研究——各型肝病时HBV DNA的定位及形态

报告用生物素标记HBV DNA探针原位杂交技术,现察75例慢性肝病者肝石蜡切片上HBV DNA定位及形态。共检出HBV DNA阳性者25/75例(33.33％)。其中:CPH2/7例、CAH10/21例、肝硬化0/3例、SS4/11例、无症状HBsAg携带者4/21例和HCC5/12例。HBVDNA在肝切片上呈棕黄色粗颗粒状,主要分布于肝细胞浆内,个别核内亦可见少数浅染棕黄色颗粒。阳性肝细胞分布有三种形式:Ⅰ型(弥漫型):25例中有4例(16％),Ⅱ型(局灶型):20例(80％),Ⅲ型(散在型):仅1例(4％)。颗粒在胞浆内亦有a型(密集)和b型(稀疏)之分。各型乙型肝炎HBV DNA在肝切片上定位与分布不完全相同,可能表示不同的病毒感染状态和复制的活跃程度。HCC只在癌旁肝组织内查见HBV DNA。     

慢性乙肝患者流产绒毛检出整合型HBV DNA

应用Southern plot,对24例慢性乙肝患者(夫妇中至少有1个是乙肝患者)的流产绒毛、胎肝、胎儿内生殖系统组织进行HBVDNA检测和研究。22例流产绒毛中检出整合型合并游离型HBV DNA 1例,阳性率4.5％,2例胎肝DNA中检测出1例整合型合并游离型HBV DNA。以上结果除以分子生物学角度证实HBV宫内感染外,还高度提示:HBV存在经生殖细胞垂直传递子代的可能。     

NBA DNA整合入肝细胞基因的模式

利用克隆DNA衍生的特异性探针,在肝细胞癌组织中发现了乙肝病毒DNA序列,在一些与癌组织毗邻的肝组织中,也存在着染色体外(extra-chromosomal)和整合病毒DNA。非肿瘤组织中整合DNA的发现,提示整合发生在癌组织形成前。在HBsAg携带者与肝细胞癌高发区,至少有80％的HBsAg阳性患者的肿瘤组织中有整合HBV DNA序列。HBA在致癌过程中所起的作用及其分子基础尚待查清。第一种基制,病毒基因的导入破坏了正常细胞基因表达规则。一些小DNA病毒,如乳多空病毒与腺病毒,有一种基因在受染细胞中控制着病毒DNA复制和/或转录,在非溶解性感染(non-lytic infection)中,     

原发型肝癌的HBV感染及肝内的HBVDNA

应用~(32)P标记的3.2kb克隆HBVDNA探针对36例原发型肝癌患者的血清和肝组织作HBVDNA斑点杂交,结果:血清、肝癌组织、癌近邻肝组织和癌远邻肝组织的阳性率分别为56％、91％88％和80％,皆高于国内外一些同类研究,说明其HBV感染率比一般认为的还要常见,尽管肝内良恶组织的HBV DNA阳性率未见显著差别。此外,尚对HBV6项血清标记作了检测,结果HBsAg和PHSA·Re的阳性率均较高,分别为83％和75％,说明多数病例的HBV感染仍然处于病毒活动复制阶段。由于血清HBsAb阳性者,肝内HBV DNA全阳性,提示HCC阶段的“保护性抗体”并不能清除病毒感染。     

原发性肝细胞癌癌组织中p33ING1b与p53基因的表达

目的研究p33ING1b与p53蛋白在原发性肝细胞癌中表达的相关性及ING1b基因在原发性肝细胞癌中的突变率.方法应用免疫组织化学SP方法检测了57例原发性肝细胞癌癌组织、51例癌旁肝组织及12例正常肝组织中p33ING1b和p53蛋白的表达,并分析了原发性肝细胞癌癌组织中乙肝病毒(HBV)的感染率;应用聚合酶链式反应(PCR)联合单链构象多态性(SSCP)方法检测了28例配对癌及癌旁肝组织中ING1b基因两个外显子的突变情况,对有异常泳动条带的DNA片段分别克隆测序.结果在57例原发性肝细胞癌癌组织中,p33ING1b、p53蛋白的阳性率分别为42.1%和57.9%,p33ING1b、p53表达均呈阳性者有19例(33.3%),且两者在癌组织中阳性分布区域相同;p33ING1b蛋白表达与p53蛋白表达在癌组织中呈显著正相关(r=0.783, P<0.01);配对癌旁肝组织及正常肝组织中p53蛋白表达均为阴性,p33ING1b蛋白在13例癌旁肝组织及2例正常肝组织中呈弱阳性表达;在57例原发性肝癌组织中有35例(61.4%)HBV X蛋白呈阳性,其病理类型均为肝细胞肝癌,在51例癌旁肝组织中检出HBV X蛋白阳性者39例(76.47%),癌组织中HBV感染与p33ING1b、p53蛋白表达均有关(P<0.01);PCR-SSCP结果表明,ING1b基因在原发性肝细胞癌中突变率较低为7.1%(2/28).结论 p33ING1b、p53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达呈显著正相关,p33ING1b的存在可能还有其他不依赖p53蛋白的途径;HBV感染与p33ING1b、p53蛋白表达均有关;基因突变不是p33ING1b丧失抑癌功能的主要因素.     

生物素标记HBVDNA探针原位杂交碱性磷酸酶过氧化物酶显色检测肝内HBVDNA

本研究应用国产生物素标记HBVDNA探针,于福尔马林固定,石蜡包埋肝组织切片上,建立了碱性磷酸酶过氧化物酶显色的原位杂交技术,在此过程中发现,蛋白酶的消化是杂交能否成功的关键因素,酸、三乙醇酐、洋地黄的预处理,能促进探针参入,降低非特异背景,减低蛋白酶作用浓度或作用时间,因而提高实验稳定性、特异性。并用这一技术检测了34例肝活检和4例尸检肝组织,结果:尸肝组织均检出了HBV—DNA,其中2例核型见于肝硬化,肝癌旁组织,而2例浆型HBV—DNA见于慢活肝,亚重肝。34例肝活检组织中,只检出12例浆型HBV—DNA,其中CAH—CPH无症状携带者中检出率分别为42.9％,38.8％,33.3％,均明显高于肝硬化组织(16.7％)(P<0.05)。由此可见浆型HBV—DNA分布同病变轻重程度的关系可能并不密切,不同分布型的HBV—DNA可能只反映HBV的复制状态。     

食管癌及癌旁组织中人乳头状瘤病毒DNA的存在状态

作者以人乳头状瘤病毒(HPV)16DNA为探针,采用斑点杂交及Southern分子杂交技术检测24例食管癌及其相应癌旁组织中的HPV16DNA。结果:在食管癌组织中,HPV 16DNA斑点及Southern杂交的阳性率为50％(12/24),癌旁组织为37％(9/24);经Bam H I酶切的食管癌及癌旁组织中,杂交后出现7.2kb的HPV16DNA特异性阳性区带;经Pst I酶切杂交后出现2.7kb、2.3kb、1.75kb、1.18kb四条HPV16DNA阳性区带;未经酶切者来发现阳性杂交带出现。提示人乳头状瘤病毒基因组确实存在于食管癌及癌旁组织DNA中,且多以整合状态存在。     

异质性胞核核糖核蛋白K在肝癌组织及不同密度肝癌细胞中的表达

目的:观察异质性胞核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP K)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及在不同密度肝癌细胞(PLC/PRF/5)中的亚细胞定位.方法:免疫组化染色观察肝细胞癌组织中hnRNP K的表达;Western印迹检测肝癌组织(n=30)及对应癌旁组织hnRNP K蛋白表达差异;应用细胞免疫组化和Western印迹法比较不同密度肝癌细胞hnRNP K蛋白的亚细胞定位及表达.结果:肝细胞癌组织hnRNP K蛋白主要表达于细胞核.hnRNP K蛋白表达在30例的肝癌组织中有21例高于其对应的癌旁组织;20例HBV阳性肝癌组织有16例高于其对应的癌旁组织,而10例HBV阴性肝癌组织仅有5例表达高于癌旁组织.细胞免疫组化结果表明,hnRNP K主要表达于PLC细胞核中,并且随密度(汇合率为30%、50%、90%)的上升,其表达量逐渐上升.Western印迹结果表明,不同密度(汇合率为30%、50%、70%、90%)肝癌细胞的细胞质中,hnRNP K的表达量无统计学差异;而在细胞核中,随着细胞密度的增大,hnRNP K的表达量逐渐升高.结论:肝癌组织细胞核hnRNP K表达上调,且随着肝癌细胞密度的增加,其表达会逐渐增强,HBV感染可能会促进其表达.     

原发性肝癌HBV存在状态,HBxAg表达和癌基因ets-2、IGF-Ⅱ、c-myc、N-ras表达的实验研究

我们与上海肿瘤所合作,用DNA分子杂交和免疫印迹等方法,研究了12对肝癌/癌旁组织癌基因表达、HBxAg表达和HBV DNA的存在状态及相互关系。结果表明,癌和癌旁组织,至少有一种以上的癌基因表达,有的癌组织可表达3～4种癌基因。IGF-Ⅱ表达为胚胎型的转录     

重型慢性活动性肝炎患者急性加重的病因探讨

为探讨慢性活动性肝炎患者急性加重的病因,对15例患者进行肝细胞内HBV DNA(乙肝病毒脱氧核糖核酸)原位杂交研究,同时检查血清与肝内HBV标志及肝内HDAg。发现:①60.0％(9/15)患者存在HBV活动性复制或HBV复制重新激活,观察到表达浆膜型HBcAg肝细胞多紧紧毗邻肝细胞坏死灶;②20.0％(3/15)患者肝内HBsAg或(和)HBVDNA阳性,虽无HBcAg表达,但见到浆膜型HBsAg表达或含HBV DNA肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切的表现:③13.3％(2/15)患者有HDV二重感染;④1例患者缺乏HBV感染标志。表明慢性活动型肝炎急性加重主要与HBV活动性复制、HBV复制重新激活或HBV感染持续存在有关,其次是HDV二重感染,少数病例可能存在HAV或HCV的重叠感染。     

乙型肝炎合并肝癌病人的心理分析及护理

肝细胞癌(HCC)的发病与多种因素有关,其中HBV感染是最重要的原因.我国HCC患者中HBsAg检出率约80%,HBsAg阴性的HCC患者也多能在肝组织中检出HBVDNA.HBV感染者发生HCC与HBV DNA易整合入肝细胞DNA有关.     

抗HBe阳性慢性肝炎患者的HBV感染状态研究

本文结合肝内HBsAg与HBcAg的表达情况对15例抗-HBe阳性慢性肝炎患者进行了肝细胞内HBV DNA原位杂交分析。发现其HBV感染状态可分为3种类型;①HBV活动复制型(4例,26.7％),肝内HBV DNA、HBsAg、HBcAg三者或HBsAg、HBcAg阳性;②HBV不完全复制或表达型(8例,53.3％),肝内HBV DNA、HBsAg阳性;③HBV非复制型(3例,20.0％),肝内HBV DNA及HBV标志均阴性。提示:在血清HBeAg向抗-HBe转换的病例中,HBV感染状态不尽相同,部分患者仍存在HBV活动性复制,少数病例的HBV复制已停止,半数病例处于由活动性复制相向非复制相过渡阶段。     

肝细胞浆内HBV DNA与HBV感染状态关系的探讨

在原位杂交研究的基础上,本文对慢性乙肝患者胞浆型HBV DNA及肝内其它乙肝指标进行综合分析。发现胞浆型HBV DNA可分3种类型:①肝内同时有核衣壳蛋白(HBcAg)与包膜蛋白(HBsAg)表达,此与HBV复制的产物表达特征一致;②肝内仅有HBsAg表达,此与HBVDNA和宿主基因组整合后的表达特点相似;③肝内HBsAg、HBcAg表达均缺如,可能代表一种HBV非复制状态。由此表明在HBV非复制期,出现胞浆HBV DNA杂交信号可能系DNA RNA杂交体所致。     

肝细胞癌组织中中期因子表达及其与乙型肝炎病毒感染的关系

目的　探讨肝细胞癌 (HCC)组织中中期因子 (midkine ,MK)的表达及其与乙肝病毒(HBV)感染的关系。方法　采用原位杂交及免疫组织化学方法检测 6 2例HCC、癌旁肝组织及 10例正常肝组织中MKmRNA、MK蛋白表达及HBVDNA水平。结果　 6 2例HCC组织中MKmRNA、MK蛋白表达阳性率分别为 74 2 %、75 8% ,明显高于无表达的癌旁肝组织及正常肝组织 (均P <0 0 1)。肝癌组织HBVDNA核型阳性率 (6 2 9% ,39/ 6 2 )明显高于癌旁肝组织 (6 5 % ,4 / 6 2 ) (P <0 0 1)。肝癌组织MKmRNA、MK蛋白表达与HBVDNA核型存在密切相关。结论　MKmRNA及其蛋白在HCC组织中呈过度表达 ,并可能与HBVDNA核型存在有密切联系     

肝肠钙黏连蛋白在肝癌中的表达及临床意义

目的 探讨肝细胞肝癌中肝肠钙黏连蛋白( LI-cadherin)的mRNA和蛋白表达水平及其临床意义。方法 应用逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)及免疫组织化学方法检测LI-cadherin的mRNA及蛋白在56例肝癌组织、44例癌旁肝组织和9例正常肝组织中的表达水平,并分析其与临床病理学特征之间的关系。结果 肝癌组织和癌旁肝组织中均有Ll-cadherin mRNA的表达,正常肝组织中均未枪测到LI-cadherin mRNA的表达。LI-cadherin mRNA在肝癌组织中的表达显著高于在癌旁肝组织中的表达(0.653±0.147 vs 0.534±0.138),且两者之间的差异有统计学意义(P＜0.01)。LI-cadherin蛋白在肝癌组织中其阳性表达率为64.29％( 36/56),在癌旁组织中其阳性表达率为22.73％(10/44),在正常肝组织中没有发现其表达。LI-cadherin蛋白的过表达与肝癌细胞的分化程度、淋巴结转移及门静脉癌栓的形成等临床病理因素有关(P＜0.05)。结论 LI-cadherin在肝癌细胞的发生、发展过程中发挥重要作用。LI-cadherin蛋白的过表达与肝癌细胞的淋巴结转移和门静脉癌栓有关,提示其在肝癌的侵袭和转移中发挥重要的作用。     

慢性HBV感染患者精子中HBVDNA存在研究的初步报告

用Southern Blot方法,我们研究了13份慢性HBV感染患者(8份慢迁旰,5份慢活肝)和2份对照精液标本中HBV DNA存在状况。提取物一半用限制酶HindⅢ消化,各行琼脂电泳,转移到纤维膜上,然后用~(32)P—HBV—DNA探针分子杂交。在4份精子內检出HBV DNA,3份为游离形式,1份为整合形式。结果表明HBV DNA可以存在精于内,游离状态HBV DNA提示有传染性、整合序列HBV DNA的存在提示有通过生殖细胞遗传的可能。     

原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒基因整合的突变分析

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)整合序列中基本核心区突变与乙肝病毒相关肝癌发生的相关性。方法应用Alu-PCR和基于接头的LM-PCR方法扩增40对乙肝相关性肝癌组织和配对癌旁组织中整合的HBV序列,PCR产物纯化后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,测序结果使用Pub Med BLAST软件和Bio Edit软件进行分析。结果 65.0%的肝癌组织检测到整合HBV病毒序列(26/40),共检出37个不同的HBV整合序列。67.5%的癌旁组织中检测到整合HBV病毒(27/40),共检出68个不同的整合序列。平均每例肝癌组织中HBV整合序列检出数为1.42个,而癌旁组织为2.52个,癌组织低于癌旁组织。整合HBV序列发生A1762T/G1764A双突变在肝癌中的检出率高于癌旁组织,差异无统计学意义。结论 HBV感染相关肝癌组织及癌旁组织中都检测到整合HBV序列,再次表明整合是肝癌发生中的一个早期事件;而肝癌组织中整合HBV序列有更高的A1762T/G1764A突变检出率,从一个新的侧面表明这些突变在病毒的致癌过程中具有重要作用。