树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的：研究人外周血树突细胞（dendriticcell,DC）对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较.方法：采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系（SPC-A1）的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性.结果：CIK-ADC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,（P值分别为0.025和0.042）,提示CIK A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性.而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能.同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022.联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞.结论：DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性.     

抗原致敏DC诱导CIK细胞对肺腺癌细胞的杀伤作用

[目的]研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对肺腺癌原代细胞的杀伤作用，并与单独LAK、CIK细胞的杀伤效果进行比较。[方法]取健康人外周血单个核细胞（PBMNC），常规诱导出DC、CIK、LAK细胞；用肺癌A549细胞提取的肿瘤抗原冲击DC，倒置显微镜下观察DC形态，流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化；把CIK细胞、DC-CIK细胞、LAK细胞和DC-LAK细胞作为效应细胞，肺腺癌原代细胞作为靶细胞，共分为4组，在10：1、20：1、50：1的效靶比时，进行杀伤试验，使用LDH释放法测定杀伤活性。[结果]DC经肿瘤抗原冲击后在镜下呈典型成熟形态；流式细胞仪检测DC经肿瘤抗原冲击和未经肿瘤抗原冲击其表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达，前者明显高于后者，两者有显著性差异（P〈0．01）；DC—CIK细胞对肺腺癌原代细胞的杀伤活性高于DC—LAK细胞、CIK细胞和LAK细胞（P〈0．05），随着效靶比的升高，DC-CIK细胞对肺癌细胞的杀伤效应随之增强（P〈0．05）。[结论]肿瘤抗原致敏的DC可诱导特异性CIK细胞，DC-CIK细胞对肺腺癌原代细胞的杀伤作用明显高于DC—LAK、CIK、LAK细胞。     

经诱导健康人与肿瘤患者CIK和DC-CIK对肺癌细胞杀伤作用的比较研究

[目的]比较健康人与肿瘤患者来源的CIK和DC-CIK对肺癌细胞的杀伤作用的差异。[方法]分别将健康人和肺癌患者来源的单个核细胞在体外诱导成CIK和DC;分别用A549细胞和肺腺癌原代细胞的肿瘤抗原冲击DC,体外行DC-CIK共培养;流式细胞仪检测两种来源的DC表面CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达和CIK和DC-CIK中CD3^＋CD56^＋细胞比率差异;利用LDH释放法测定同来源CIK和DC-CIK在不同效靶比下对A549细胞和肺腺癌原代细胞的杀伤活性。[结果]两种来源的单个核细胞在体外均可诱导生成CIK和成熟的DC;健康人来源的DC表面CD40、CD80、CD86和HLA—DR的表达及CIK和DC—CIK中CD3^＋CD56^＋细胞比率均较肿瘤患者来源的高：CIK和DC-CIK杀伤作用对A549细胞和肺腺癌原代细胞均具有杀伤活性,且随效靶比的升高而增强;DC—CIK杀伤活性较同来源的CIK强：同条件下,健康人来源的CIK或DC-CIK的杀伤活性较肿瘤患者来源强。[结论]健康人来源的CIK和DC-CIK对肺癌细胞杀伤活性优于肿瘤患者自身来源的CIK和DC-CIK。     

共培养的树突细胞和CIK细胞对肺癌的体内外抑癌作用

背景与目的:细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller,CIK)细胞是高效的肿瘤杀伤细胞。树突细胞(dendriticcells,DCs)是体内最强的抗原递呈细胞,并且能够提高效应细胞的抗瘤活性。本实验将DCs和CIK细胞共培养观察DCs对CIK细胞的细胞表型、增殖活性及体内外的抗肺癌作用的影响。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导出DCs、CIK细胞后,将DCs和CIK细胞按1∶10比例共培养5天获得DC-CIK细胞。流式细胞仪测DC-CIK细胞表型变化,3H-TdR掺入法测定其体外的细胞毒活性,并用肺腺癌细胞株A549建立裸鼠模型观察DC-CIK体内的抗肿瘤效果。结果:在培养第14天,DC-CIK细胞与单独CIK细胞培养组相比,增殖速率提高[(17.0±1.8)倍vs.(10.9±2.0)倍,P<0.05],CD3 CD56 表达水平明显上调[(36.0±4.2)%vs.(25.7±2.9)%,P<0.05],同时对A549细胞的细胞毒活性明显增强(P<0.05)。裸鼠体内实验表明,接种肺癌细胞51天后DC-CIK组、CIK组的抑瘤率分别为62.9%、41.5%,与对照组相比DC-CIK组及CIK组均抑制裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01),且DC-CIK组与CIK组抑瘤效应差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DCs与CIK细胞共培养可使CIK细胞获得更高的增殖活性和更强的抑癌作用。     

肝癌患者自体CD3AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较

目的 比较肝癌患者自体CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性,为临床是供依据。方法 以流式细胞仪检测细胞的杀伤活性。结果 原发性肝癌患者自体的CD3AK细胞的NK活性和LAK活性均高于LAK细胞。结论 CD3AK细胞效果稳定,抗瘤效应明显高于LAK细胞,CD3AK细胞可望作为一种新的生物治疗手段用于肿瘤治疗。     

抗原致敏树突状细胞诱导CIK对肺癌细胞杀伤作用的研究

[目的]研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对肺癌细胞株A549和肺腺癌原代细胞的杀伤作用。[方法]取健康人外周血单个核细胞,常规诱导出DC、CIK、LAK细胞。用肺癌A549细胞提取的肿瘤抗原冲击DC,倒置显微镜下观察DC形态。流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化。LDH释放法测定杀伤活性。[结果]DC经肿瘤抗原冲击后在镜下呈典型成熟形态,其表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达明显较未经肿瘤抗原冲击的DC高。DC＋CIK细胞对A549和肺腺癌原代细胞的杀伤活性高于CIK细胞、LAK细胞和DC＋LAK细胞（P〈0.05）,随着效靶比的升高,其杀伤效应随之增强（P〈0.05）。[结论]肿瘤抗原致敏的DC可诱导特异性CIK细胞,DC＋CIK细胞对A549和肺腺癌原代细胞的杀伤作用明显高于DC＋LAK、CIK、LAK细胞。     

DC与CIK共培养后对白血病细胞杀伤活性的研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源树突状细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性、表型的变化,及其对K562、HL-60白血病细胞细胞毒作用的影响。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(MNC),置于37℃,5%CO2培养箱培养2 h,收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK细胞,贴壁细胞诱导分化出成熟DC,将成熟DC和CIK细胞按1 5的比例混合培养3天,用MTT法检测DC-CIK共培养细胞杀伤K562和HL-60白血病细胞株的活性。结果DC-CIK共培养后增殖速度明显快于单纯CIK细胞组(P<0.05);培养第14天,CIK中CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的比率分别为58.6%±7.3和26.5%±6.2,DC-CIK的CD3+CD8+、CD3+CD56+的比率分别为72.5%±4.2和38.4%±6.1,表达差异显著(P<0.05);在2.5∶1~20∶1的效靶比范围内,DC-CIK对K562、HL-60细胞的杀伤活性较单纯CIK细胞组的杀伤活性要高(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞是增殖活性和细胞毒活性均高于CIK细胞的免疫活性细胞。     

抗原致敏DC联合CIK细胞对肺癌细胞杀伤作用的研究

[ 目的]研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对肺腺癌原代细胞的杀伤作用，及肺癌细胞杀伤作用中细胞因子水平。[方法]取健康人外周血单个核细胞（PBMNC），常规诱导出DC、CIK、LAK细胞；用肺癌A549细胞提取的肿瘤抗原冲击DC，倒置显微镜下观察DC形态，流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化：把CIK细胞、DC-CIK细胞、LAK细胞和DC-LAK细胞作为效应细胞，肺腺癌原代细胞作为靶细胞，共分为4组，在10：1、20：1、50：1的效靶比时，进行杀伤试验，使用LDH释放法测定杀伤活性；ELISA法检测杀伤试验中细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌水平。[结果]DC经肿瘤抗原冲击后在镜下呈典型成熟形态；DC—CIK细胞对肺腺癌原代细胞的杀伤活性高于CIK细胞、LAK细胞和DC—LAK细胞（P〈0．05），随着效靶比的升高，DC—CIK细胞对肺癌细胞的杀伤效应随之增强（P〈0．05）；细胞杀伤试验中DC—CIK细胞组中IFN-γ、IL-12的分泌量明显高于其它3组（P〈0．05）：而IL2的分泌量以DC-LAK细胞组为最高，DC—LAK和LAK细胞组明显高于其他2组（P〈0．05）。[结论]肿瘤抗原致敏的DC可诱导特异性CIK细胞，显著提高CIK细胞对肺腺癌原代细胞的杀伤作用，其杀伤作用可能与IFN-γ、IL12的分泌量有关。     

CIK、DC-CIK细胞对神经母细胞瘤细胞杀伤作用的研究

目的：研究细胞因子诱导的杀伤细胞（ CIK）与树突状细胞（ DC）共培养后对神经母细胞瘤（ neuro-blastoma,NB）细胞株的杀伤作用。方法：取健康人和肿瘤患者外周血单个核细胞（ PBMC）,加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,用流式细胞术测定诱导培养前后DC和CIK细胞的表型,MTT法测定不同组CIK细胞对NB细胞株的杀伤活性。结果：流式细胞仪检测健康人PBMC培养后CD3＋CD56＋淋巴细胞百分比以及对NB细胞株的杀伤活性均显著高于肿瘤患者（ P〈0.05）。此外,与单纯CIK细胞相比,DC-CIK细胞具有更强的杀伤NB细胞株的活性（ P〈0.05）。结论：DC-CIK细胞是一种细胞毒作用高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。健康人和肿瘤患者的PBMC经诱导培养获得的CIK细胞有显著差别,为临床进一步提高CIK细胞的治疗效果提供了实验依据。     

mRNA转染树突细胞协同CIK细胞体内抗肿瘤作用的研究

目的:研究人肺腺癌细胞系SPC-Al mRNA基因转染的树突状细胞(dendritic cells, DCs)和细胞因子诱导活化杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)体内协同抗瘤活性.方法:按常规方法分离健康人外周血单个核细胞,并分别诱导培养为DC和CIK细胞.将人肺腺癌细胞mRNA转染DC细胞,并将转染后成熟DC与CIK细胞混合培养,流式细胞仪检测混合培养前后的CIK细胞表型变化,并通过建立人肺腺癌细胞移植模型研究其体内的协同抗肿瘤活性.结果:混合培养后的CIK细胞表面CD3 CD8 及CD3 CD56 表达显著升高,P<0.01;共孵育后的mRNA-DC-CIK细胞组与其余各组相比,体内肿瘤抑制效率明显增大.结论:利用该方法来负载DC瘤苗具有可行性,为临床上解决DC瘤苗因肿瘤抗原的来源困难问题及提高CIK细胞的特异性抗肿瘤活性提供实验依据,为肺癌的治疗开辟一种新的有效的免疫治疗策略.     

肿瘤射频消融裂解物负载的DC—CIK细胞体外抗肿瘤活性实验研究

目的研究负载射频消融肿瘤原位裂解物的树突状细胞（Dc）联合细胞因子诱导杀伤活性细胞（CIK）体外抗肿瘤活性。方法制备BALB／C小鼠脾脏来源的CIK细胞及骨髓来源的Dc。建立射频消融灭活小鼠皮下结肠癌的实验模型,将其原位裂解的肿瘤组织反复冻融后取上清,lowry蛋白定量法定量,以终浓度5μg／ml载培养第5天的Dc（即Ag-Dc）,2d后再与培养第7天的CIK细胞共培养48h,流式细胞术分析其表面共刺激分子的表达,细胞增殖与毒性检测试剂盒（CCK-8试剂盒）检测其体外杀伤活性。结果DC表面分子表达共刺激分子CD86＋ CD11c＋、MHCⅡ＋ CD11c＋、MHCⅡ＋ CD80＋双阳性细胞百分含量分别为9．50％、42．4％、53．4％;Ag-DC表面分子表达共刺激分子双阳性细胞百分含量明显提高,分别为19．2％、74．2％、61．1％。CIK细胞培养第1天,CD3＋ NK1．1＋双阳性的百分含量为1．45％,第7天CD3＋ NK1．1＋双阳性表达明显提高为36．9％。Ag—DC—CIK细胞对结肠癌细胞C26的杀伤活性明显高于DC-CIK、CIK细胞,且相同效靶比下前者的杀伤活性明显高于后者。效靶比为5：1时,Ag-DC-CIK细胞杀伤率为（74．9±3．5）％,DC-CIK细胞杀伤率为（71．2±2．1）％,CIK细胞杀伤率为（68．7±2．9）％,差异有统计学意义（F=7．007,P=0．007）;效靶比为10：1时,Ag—DC-CIK细胞杀伤率为（82．3±4．5）％,DC-CIK细胞杀伤率为（77．1±5．1）％,CIK细胞杀伤率为（72．7±2．8）％,差异有统计学意义（F=7．727,P=0．005）;效靶比为20：1时,Ag-DC-CIK细胞杀伤率为（83．2±1．9）％,DC-CIK细胞杀伤率为（77．2±4．2）％,CIK细胞杀伤率为（73．0±2．6）％,差异有统计学意义（F=16．594,P=0．000）。结论负载肿瘤射频消融原位裂解产物的DC联合CIK细胞可以提高体外细胞毒活性,为肿瘤综合治疗提供新策略。     

DC-CIK细胞的生物学活性及抗淋巴瘤细胞的作用

Objective: To investigate the proliferation capabilities, immunophenotype changes, level of secreted cytokines and activities against lymphoma cells under the condition that cytokine-induced killer (CIK) cells co-cultured with dendritic cells (DC) in vitro. Methods: DC and CIK cells were induced from peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers. They were co-cultured meanwhile CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapan-blue staining, killing activities were detected by MTT assay, immunophenotype changes were analyzed by flow cytometry, the IL-12 and INF-γ levels of the cultured supernatants were detected by ELISA kits. Results: The proliferation capabilities of DC-CIK cells were significantly higher than that of CIK cells (P < 0.05). Under the same condition, the ratio of double positive cells such as CD3 CD8 , CD3 CD56 in CIK cells was significantly enhanced by co-cultured with DC cells (P < 0.05). The level of IL-12 and INF-γ secreted in supernatants was increased noticeably by co-cultured DC-CIK cells on day 3 compared to CIK cells which were cultured alone (P < 0.01 and P < 0.05). Within the effector-target ratio range between 5:1 to 40:1, the activi-ties against lymphoma cells of DC-CIK cells were much higher than that of CIK cells (P < 0.05), and this effect was showed a positive correlation with the effector-target ratio. Conclusion: The proliferation capabilities, the level of secreted cytokines and the activities against lymphoma cells of DC-CIK cells were significantly higher than those of CIK cells. The research might provides theoretical and experimental basis for clinical immunotherapy of DC-CIK cells.     

DC与CIK共培养对骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨树突状细胞(dendritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)共培养对人骨肉瘤细胞的杀伤效应.方法 从健康志愿者中分离外周血单个核细胞,制备DC和CIK,并以5:1比例混合培养.采用CCK-8法和流式细胞术检测DC-CIK共培养...     

负载人结肠癌Lovo细胞总RNA抗原树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞在体外特异性杀伤的影响

目的 探讨人结肠癌Lovo细胞总RNA抗原致敏的树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在体外特异性杀伤的影响.方法 利用Ficoll密度梯度离心法提取脐血单核细胞,分别诱导CIK和DC细胞,并用流式细胞仪检测其免疫表型.采用Trizol提取结肠癌Lovo细胞总RNA作为肿瘤细胞抗原,转染脐血来源的DC.实验分为3组:转染Lovo DC共培养CIK组、未转染DC共培养CIK组和单纯CIK组.靶细胞为Lovo细胞,在效靶比为50∶1和20∶1的条件下以噻唑蓝法分别检测CIK的体外杀伤活性.结果 在效靶比为20∶1时,负载Lovo RNA抗原的DC能诱导出CIK对Lovo细胞最强的细胞毒杀伤力为(76.49±4.21)%,DC+CIK组次之为(53.84±2.15)%,CIK组细胞毒性最低为(32.20±3.07)%,且两组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肿瘤细胞总RNA提取方法简单,易于临床实施,其作为抗原致敏DC能强化CIK的特异性杀伤,将有很好的临床应用前景.     

CIK的体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究

目的:从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs),测定其表型及T细胞刺激活性.方法:采用Mini-MACS分离技术,从正常人骨髓、脐血分离CD34~ 造血干细胞,体外以重组hGM-CSF,hTNF-α,hIL-3诱导培养2周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内IL-12的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增DCs的T细胞刺激活性.结果:从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度(>90%)的CD34~ 造血干细胞,经重组hGM-CSF,hTNF-α的共同诱导培养,扩增得到大量DCs,加人hIL-3可以进一步增加DCs产量;FACS检测表明,扩增的DCs表达HLA-DR,CD40,CD54,CD80,CD86分子,细胞内有hIL-12的P35,P40亚基的表达;与外周血单核细胞培养生成的DCs相比,由CD34~ 干细胞扩增的DCs具有更强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人CD34~ 干细胞体外经诱导培养,可以生成大量功能成熟的DCs,从而为进一步开展DCs的基础及临床研究打下了基础.     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对大肠癌细胞株LOVO体外杀伤作用的研究

目的研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对大肠癌细胞株LOVO的杀伤及诱导凋亡作用。方法 从健康供者外周血中提取出单个核细胞, 用不同的细胞因子诱导出DC及CIK细胞, 待DC成熟后将DC与CIK混合培养。细胞计数法测定细胞的增殖、MTT法测定细胞杀伤活性、透射电镜观察肿瘤细胞的凋亡、Western Blot法检测效应细胞表面FasL表达。结果 DC细胞对CIK细胞具有很强的促增殖作用, 且DC-CIK细胞共培养组在各效靶比的杀伤活性均明显高于单独CIK细胞培养组(P＜0.01)。DC可以促进CIK诱导肿瘤细胞发生凋亡, 且DC-CIK、CIK细胞均大量表达FasL。结论 DC细胞可以显著提高CIK细胞的增殖活性和细胞毒活性, 其共培养的作用机制之一可能是通过Fas/FasL途径而实现。     

Study of Multi-directional Derivation of Cord Blood Mononuclear Cells and Observation of Killing Activity to MGC-803 Gastric Cancer Cell Strain In Vitro

Objective： To study multi-directional derivation of cord blood mononuclear cells to CD3AK, LAK and CIK cells as well as changes of killing activity to gastric cancer cell strain in vitro. Methods： CD3mAb and IL-2 were used to induce CD3AK cells, and IL-2 was used to induce LAK cells; IFN-γ was used in the beginning, then IL-1, CD3mAb and IL-2 were used to induce CIK cells after 24 h for observing amplification and analyzing their relationship. The phenotypes of the cultured CIK cells were analyzed by flow cytometry. Subsequently, by using MGC-803 gastric cancer cell strain as target cells, the killing activity of CD3AK, LAK and CIK cells was evaluated by using MTT method. Results： The amplification activity of CD3AK and CIK cells was all far higher than LAK cells （P〈0.05）. The amplification activity had no obvious difference between CIK cells and CD3AK cells at prophase, but that was far higher in CIK cells than CD3AK cells at about 20^th day （P〈0.05）. The flow cytometry revealed that the amount of CD3^＋ CD56^＋ cells, major effector cells after CIK cells being cultured was significantly increased （P〈0.05）, moreover, the amount of CD8^＋ cells was significantly increased as well （P〈0.05）. The killing activities of CD3AK and CIK cells to the MGC-803 gastric cancer cell strain were all significantly higher than LAK cells, while the killing activity of CIK cells was stronger than CD3AK cells （P〈0.05）. Conclusion： CIK cells have stronger amplification activity and killing activity, and can be taken as more effective killing cells applied to the tumor adoptive immunotherapy.