KLF6在肝细胞癌中的表达缺失及其对肝癌细胞增殖的影响

目的 研究潜在抑癌基因KLF6在肝细胞癌的表达、变异及对肝癌细胞增殖的影响,探讨KLF6基因在肝细胞癌中的作用机制.方法 分别用荧光定量PCR、Western-Blot和DNA直接测序、荧光标记多态性微卫星分析,检测肝细胞癌中KLF6基因的表达及变异情况;构建野生型KLF6真核表达质粒pcDNA3.0/KLF6,转染肝癌细胞HepG2,观察转染后细胞生长情况.结果 KLF6基因在肝细胞癌的表达明显下调(P＜0.01).在21例肝癌组织中的突变率为29%.3个错义突变--Y97C、T145A和T147A均位于KLF6蛋白活性域的非保守氨基酸序列,而配对癌旁组织均未发现突变.其中,错义突变--T147A(base 423 A-G)破坏了脯氨酸蛋白激酶的磷酸化作用位点(XTPX*).微卫星分析KLF6在肝细胞癌表现出较高频率的杂合子缺失,缺失率为52%.在出现杂合子缺失的11例样本,KLF6基因均有明显的表达下调.其中,9例样本同时检测出突变.导人外源KLF6基因可明显抑制转染细胞HepG2生长(42.7%,P＜0.05).实验还发现,pcDNA3.0/KLF6转染HepG2细胞后,可诱导转染细胞凋亡.结论 KLF6基因可能为新的肝癌相关抑癌基因,在肝细胞癌病理演变过程中可能扮演重要角色.

Abstract：

Objective To investigate the expression and genetic alterations of KLF6 in hepatocellular carcinoma (HCC) and explore their functional mechanisms in the oncogenesis and development of HCC. Methods Real-time quantitative-PCR, direct sequencing and LOH approaches were used to detect KLF6 genetic abnormalities in HCC. The experiment had 2 groups, an experimental group and a control group. In the experimental group, the transfected plasmid pcDNA3.0 was recombined with KLF6 and tranfected into HCC HepG2 cells. MTT, flow cytometry and Western blotting were used to observe the effect of anti-oncogene wild type KLF6 on HepG2 cells by transgenic method for 48 h.Results Expression levels of KLF6 were significantly downregulated in HCCs(P＜0. 01), as detected by qRT-PCR. LOH occurred in 11 (52%) of the 21 tumors, and all the samples with LOH showed KLF6 down-regulation. The mutational frequency was 29%, and sequence changes located in activation domain of KLF6. Meanwhile, MTT assay showed a significant antiproliferative effect of the transfected wtKLF6 on HepG2 cells(42.7%, P＜0.05). Fluorescence-activated cell sorting analysis revealed that KLF6 induced apoptosis. Conclusion The deregulation of KLF6 together with genetic abnormalities of allelic imbalance and mutations may play an important role in HCC pathogenesis.     

微小RNA-938在肝细胞癌中的表达及对肝癌细胞增殖的影响

目的:探讨微小RNA-938(miR-938)在肝癌组织中的表达情况及其对肝癌细胞增殖的影响和调控机制。方法:收集2015年1月至2019年6月在南通大学第二附属医院就诊并手术切除的40例肝细胞癌患者肝癌组织和癌旁组织,其中男性25例,女性15例,平均年龄61.4岁。miR-938过表达组HepG2肝癌细胞转染miR-...     

细胞周期蛋白A与p16蛋白在肝细胞癌发生中的协同作用

目的 探讨细胞周期蛋白A(Cyelin A)与p16蛋白在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达、相互关系及其临床意义.方法 以Western blot检测35例肝细胞肝癌及相应的非癌组织中Cychn A与p16蛋白的表达;免疫组织化学检测Cyclin A的表达.结果 35例HCC中2l例(60.0%)有Cyclin A的过表达,22例(62.9%)出现p16蛋白表达缺失,Cyclin A蛋白过表达标本中19例(90.5%)存在p16蛋白表达缺失,无Cyclin A蛋白过表达的14例标本中3例(21.4%)出现p16蛋白表达缺失,两组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 肝细胞癌中存在Cyclin A蛋白过表达及p16蛋白表达缺失,两者引起肝细胞周期失控并可能相互加强促进.     

Sonichedgehog在肝细胞癌中的表达及其预后价值

目的 探讨Sonic hedgehog(SHH)在肝细胞癌(HCC)和癌周肝组织中的表达及其临床意义.方法 检测145例HCC和癌周肝组织SHH的表达,了解其表达与患者根治性切除术后预后的关系.检测4种肝癌细胞株以及正常肝细胞株SHH mRNA的含量.结果 SHH主要表达于肝细胞和肝癌细胞的胞质,肝癌与癌周肝组织表达差异无统计学意义(P＞0.05).癌和癌周高表达的患者总体生存率显著高于低表达患者(P＜0.05).肝癌细胞株SHH表达量显著高于正常肝细胞株(P＜0.01).结论 SHH在HCC和癌周肝组织中高表达,其表达可用于区分患者预后,SHH可能参与HCC的发生和发展.     

MIF和Cyclin D1在肝细胞癌中的表达

目的 探讨巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及两者在肝癌发病机制及细胞周期调控中的关系.方法 应用定量PCR及Westem blot技术检测MIF和Cyclin D1在肝癌组织和癌旁组织的表达.化学合成MIF siRNA,将PLC细胞和HepG2细胞分成对照组、MIF siRNA 50 nmol/L干预组、MIF siRNA 1130 nmol/L干预组,脂质体法转染肝癌细胞PLC和HepG2,定量PCR技术和Western blot检测MIF siRNA干扰后MIF和Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达变化.结果 MIF和Cyclin D1蛋白在肝癌组织中的相对表达量为0.825±0.13和0.843±0.104;MIF和Cyclin D1 mRNA在肝癌组织中的相对表达量为癌旁组织的(7.31±1.85)倍和(4.27±1.05)倍,与癌旁组织相比,差异均具有统计学意义(FMIF=15.5,P<0.01;fCyclin D1=87.5,P<0.01).应用小RNA干扰技术转染PLC和HepG2肝癌细胞后MIF mRNA分别下调71.2%±7.2%、87.4%±2.9%、74.3%±8.9%、88.4%±4.6%(FPLC=315.5,P<0.01;FHHepG2=201.2,P<0.01);MIF蛋白分别下调为0.33±0.03、0.11±0.02、0.81±0.08、0.36±0.02,并呈剂量依赖关系(FPLC=43.9,P<0.01;FHepG2:133.4,P<0.01).伴随MIF mRNA和蛋白的表达F调Cyclin D1 mRNA分别下调68.2%±3%、78.1%±1.4%、65.8%±4.7%、77.3%±2.6%(FPLC=1569,P<0.01;FHepG2=480.4,P<0.01);Cyclin D1蛋白下调0.28±0.06、0.15±0.03、0.44±0.04、0.13±0.02,亦呈剂量依赖关系,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),两干预组相比差异有统计学意义(FPLC=35.5,P<0.01;FHepG2=114.7,P<0.01).结论 MIF和Cyclin D1在肝细胞癌中过表达,MIF可能在转录水平调控Cyclin D1的表达,并促使肿瘤细胞通过细胞周期检测点,继续增值和分化,导致肿瘤的形成.     

microRNA-497 在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨microRNA-497(miR-497)在肝细胞癌组织中的表达及其意义.方法:收集40例肝细胞癌及对应癌旁组织标本,用qRT-PCR方法检测标本中miR-497的表达;人肝癌SMMC-7721细胞经miR-497模拟物转染后,用MTT和流式细胞术检测其增殖能力与凋亡水平的变化,并用qRT-PCR和Western blot检测miR-497潜在靶点Bcl-w的mRNA与蛋白的表达.结果:miR-497在肝癌组织中的表达水平明显低于其癌旁组织[(1.181±0.779)vs.(14.599±5.266),P＜0.05];转染miR-497模拟物的SMMC-7721细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡增加,Bcl-w的mRNA与蛋白表达均明显降低(与未转染的SMMC-7721细胞比较,均P＜0.05).结论:肝癌组织中miR-497表达下调,该下调可能导致靶基因Bcl-w表达升高,从而促进肿瘤的发生与发展.     

碳水化合物反应元件结合蛋白在肝癌中表达与作用

目的:探讨碳水化合物反应元件结合蛋白(Ch REBP)在肝癌(HCC)中的表达与生物学作用。方法:分别用q RT-PCR、免疫组化、Western blot法检测73例HCC组织与癌旁组织以及多种HCC细胞系与正常肝细胞系中Ch REBP的m RNA与蛋白表达;观察si RNA干扰Ch REBP表达后,HCC细胞周期、凋亡以及增殖的变化。结果:Ch REBP的m RNA与蛋白表达在HCC组织中表达均明显高于癌旁组织、在所有HCC细胞系中均明显高于正常肝细胞系(均P0.05)。干扰Ch REBP表达后,HCC细胞发生明显G1-S期阻滞、细胞增殖明显降低(均P0.05),但细胞凋亡未发生明显变化(P0.05)。结论:Ch REBP在HCC中表达升高,且可能通过调控细胞周期促进HCC细胞的增殖,从而在HCC的发展中起了重要的作用。     

经肝动脉化疗栓塞对肝细胞癌细胞增殖的影响

目的 :研究经肝动脉化疗栓塞对肝细胞癌细胞增殖的影响。方法 :采用免疫组织化学方法检测6 5例肝细胞癌病人手术后的存档石蜡切片组织中增殖细胞核抗原表达情况 ,并比较术前行与未行经肝动脉化疗栓塞术两组间有无差异。结果 :术前经肝动脉化疗栓塞组的增殖细胞核抗原标记指数显著低于未拴塞组 [(35 .83± 12 .2 3) %VS (5 9.92± 2 3.5 7) % ,P <0 .0 5 ]。结论 :经肝动脉化疗栓塞能够抑制肝细胞癌的细胞增殖 ,这可能是其发挥作用的重要机制之一。     

细胞周期调探因子在前列腺增生组织中的表达及其与生长因子.细胞增殖之间

本研究旨在探讨前列腺增生（ＢＰＨ）组织中细胞周期蛋白依赖性激酶ｃｄｋ２和ｃｄｋ４及细胞周期蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ１和ｃｙｃｌｉｎＥ的表达及其与多肽生长因子、细胞增殖之间的关系，现报道如下。     

胶质细胞成熟因子β在肝细胞癌中的表达及其临床意义

背景与目的:胶质细胞成熟因子β(GMFB)是一种17 kDa、高度保守的脑蛋白,近年来研究发现,GMFB在多种恶性肿瘤中表达上调且与患者的不良预后密切相关。然而,GMFB在肝细胞癌(HCC)中的表达及其作用的研究尚不够深入。本研究通过检测GMFB在HCC组织中的表达,分析其与患者临床病理特征、预后以及Ki-67表达的关系,探讨GMFB在HCC中的临床意义。方法:用qRT-PCR和Western bolt方法检测36对新鲜冷冻HCC组织及其癌旁组织中GMFB的mRNA和蛋白的表达。用免疫组化法分别检测91例HCC组织及其癌旁组织石蜡组织标本中GMFB和Ki-67蛋白的表达,用统计学方法分析GMFB与HCC患者临床病理因素、术后生存时间的关系以及与Ki-67表达的相关性。结果:qRT-PCR和Western bolt结果显示,HCC组织中GMFB mRNA与蛋白的相对表达量较癌旁组织均明显升高(均P0.001)。免疫组化结果显示,GMFB和Ki-67在HCC组织中的阳性表达率均较癌旁组织明显升高(均P0.001);GMFB的表达与HCC微血管侵犯(P=0.045)、Edmondson分级(P=0.032)、BCLC分期(P=0.012)明显有关;在HCC组织中,GMFB和Ki-67的表达呈正相关(r_s=0.265,P=0.011)。Kaplan-Meier生存分析显示,GMFB阳性表达患者的无病生存时间(DFS)及总生存时间(OS)均明显短于GMFB阴性表达患者(DFS:4.52个月vs.10.48个月,P=0.001;OS:27.67个月vs.39.75个月,P=0.007);Cox多因素回归模型分析显示,GMFB与Ki-67的表达上调是影响HCC患者DFS(HR=0.441,95% CI=0.242～0.801,P=0.007;HR=1.818,95% CI=1.012～3.269,P=0.046)与OS(HR=0.504,95% CI=0.287～0.886,P=0.017;HR=1.787,95% CI=1.083～2.935,P=0.023)的独立危险因素。结论:GMFB在HCC中呈现高表达,且与HCC进展及患者的不良预后密切相关,GMFB的表达与Ki-67的表达呈正相关,故推测其可能通过对肿瘤细胞增殖活性的调控发挥作用。     

细胞分裂周期蛋白6在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的:探讨细胞分裂周期蛋白6(CDC6)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其临床意义。方法:分别用q RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测85例手术切除的HCC及对应癌旁组织标本中CDC6 m RNA及蛋白的表达,分析CDC6的表达与HCC患者临床病理因素及预后关系。结果:HCC组织中CDC6的m RNA与蛋白表达水平均高于对应癌旁组织,q RT-PCR结果定量分析显示差异有统计学意义(P0.05);CDC6表达与肿瘤大小、临床分期、分化程度及卫星结节有关(均P0.05);CDC6高表达的患者无瘤生存时间和总生存时间均低于CDC6低表达患者(均P0.05);单因素与多因素分析显示,CDC6是影响HCC患者无瘤生存率(HR=1.089,95%CI=0.986~1.186,P=0.033)及总生存率(HR=2.441,95%CI=1.128~3.652,P=0.012)的独立危险因子。结论:CDC6在HCC组织中高表达并与恶性临床病理特征及不良预后密切相关,CDC6可能参与HCC发生及进展,并可作为判断肿瘤复发及预后评价的重要指标。     

G蛋白信号调节蛋白2在肝癌组织中的表达及其对细胞增殖和糖酵解的影响

背景与目的:癌基因和肿瘤抑制因子失调是肝癌发生和发展的关键因素.既往研究表明G蛋白信号调节蛋白2 (GPSM2)在肺癌中起抑癌作用,而在乳腺癌和胰腺癌中发挥癌基因作用.然而,GPSM2在肝癌中的表达及其生物学功能尚未见报道.本研究旨在探讨GPSM2在肝癌组织中的表达及其对细胞增殖和糖酵解的影响.方法:用qRT-PCR和...     

长链非编码RNA MALAT1在肝癌组织中的表达及其在肝癌细胞增殖与侵袭转移中的作用

目的:探讨长链非编码RNA MALAT1在肝癌组织中的表达及意义。方法:用qRT-PCR检测85例肝癌组织及其配对癌旁组织中MALAT1的表达,分析MALAT1的表达与肝癌患者临床病理因素的关系;在肝癌SMMC-7721细胞中分别过表达与敲除基因MALAT1后,通过CCK-8与Transwell实验检测肝癌细胞增殖与侵袭转移能力的改变。结果:MALAT1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P0.01);MALAT1在肝癌组织中的表达与肿瘤大小、肝癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移明显有关(均P0.05)。肝癌SMMC-7721细胞过表达MALAT1后增殖、侵袭与转移能力明显增强,而敲低MALAT1后增殖、侵袭与转移能力明显减弱(均P0.05)。结论:MALAT1在肝癌组织中表达上调,MALAT1可促进肝癌细胞增殖、侵袭与转移,故可能与肝癌的发生发展密切相关。     

消炎痛对人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、克隆形成率、形态学、生长曲线、流式细胞术分析(FCM).结果 消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量.效应关系.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞增殖抑制率依次升高,克隆形成率依次降低(P均<0.01),镜下可见明显的形态学改变.其中,0.5 mmol/L消炎痛组24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为50.6%、47.1%、43.4%;集落形成率为(0.00±0.00)%.0.1、0.2、0.5 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别为110.1、199.3、-614.2 h,与对照组(58.6 h)比较,0.1、0.2 mmol/L消炎痛处理组细胞倍增时间分别延长了2.17倍和3.40倍,而0.5mmol/L消炎痛处理组第6天的细胞均数[(3.4±0.4)×104个]少于初始细胞数(4×104个)结果细胞倍增时间为负值而无法计算.FCM显示,G1期细胞比例随消炎痛浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随消炎痛浓度增加而降低(P均<0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现.     

过表达Tg737基因对肝癌细胞周期和凋亡的影响

目的:探讨Tg737基因过表达对人肝癌细胞株细胞周期和凋亡的影响及可能的机制。方法:将肝癌HepG2和MHCC97-H细胞分别用脂质体法转染pcDNA3.1-Tg737质粒(Tg737过表达组)或pcDNA3.1空载体(空载体组),或单纯脂质体孵育(脂质体组),以各自未处理的细胞为空白对照。48h后分别用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡,Hoechst33342染料法检测细胞核形态,Westernblot法检测cyclinA、Bax、Bcl-2表达。结果:与各自的空白对照组比较,Tg737过表达组HepG2和MHCC97-H细胞的S期细胞数量与细胞凋亡率均明显增加(均P0.05),且细胞核均出现明显凋亡形态学改变,同时伴随cyclinA、Bax的表达上调和Bcl-2的下调(均P0.05);空载体组、脂质体组HepG2和MHCC97-H细胞镜下未见明显的凋亡形态学变化,且上述指标差异均无统计学意义(均P0.05)。结论:Tg737基因过表达可以抑制肝癌细胞周期进程、促进其凋亡,机制可能与Tg737参与调节cyclinA、Bax、Bcl-2有关的信号通路有关。     

Sonic Hedgehog 信号通路在肝癌细胞增殖中的作用

目的：探讨Sonic Hedgehog（SHH）信号通路在肝癌细胞增殖中的作用及抑制该通路的活性对肝癌细胞对化疗药物敏感性的影响。 方法：分别用不同浓度重组SHH N-末端肽（rSHH-N）、SHH中和抗体（anti-SHH）、SHH通路抑制剂cyclopamine作用人肝癌SMMC-7721细胞不同时间,用MTT法检测细胞增殖状态。比较 5-氟尿嘧啶（5-FU）、anti-SHH、cyclopamine、anti-SHH+5-FU、cyclopamine+5-FU对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的差异。 结果：rSHH-N作用后,SMMC-7721细胞增殖明显增加,而anti-SHH和cyclopamine作用后,SMMC-7721细胞增殖明显降低,且均呈时间和浓度依赖性（均P<0.05）;anti-SHH或cyclopamine联合5-FU对SMMC-7721细胞增殖抑制作用明显强于各药单用（均P<0.05）。 结论：SHH信号通路在肝癌生长中起重要作用,阻断SHH信号通路能抑制肝癌细胞增殖且能增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性。     

上调miR-449a表达对肝癌细胞生长和侵袭能力的影响

目的:探讨miR-449a在肝癌(HCC)细胞中的表达及其对HCC细胞生物学行为的影响。方法:用qRT-PCR检测miR-449a在正常肝细胞L02和4种HCC细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402)的表达。用脂质体法将miR-449a模拟物或阴性对照序列转染HCC细胞后,分别用CCK-8法、流式细胞术、Transwell小室实验检测细胞增殖、细胞周期、侵袭能力的变化,并观察以上两种不同转染的HCC细胞在裸鼠体内的成瘤情况。结果:miR-449a在4种HCC细胞株的表达水平均明显低于L02细胞(均P0.05),其中在Bel-7402细胞表达的水平最低。与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞增殖活性明显降低、G_1/S期阻滞明显增加、穿室细胞数明显减少(均P0.05);与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞在裸鼠体内成瘤后的移植瘤质量与体积均明显减小(0.748 g vs.1.234 g;33.667 mm~3 vs.1 400.500 mm~3,均P0.05)。结论:HCC细胞中miR-449a表达降低,上调miR-449a表达可以抑制HCC细胞在体内外的生长。     

miR-221在甲状腺乳头状癌中的表达及其生物学功能

背景与目的:microRNA(miRNA)异常表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关,部分miRNA表达与甲状腺乳头状癌(PTC)侵袭性临床病理特征具有明确的相关性。本研究探讨miR-221在PTC中的表达情况及其对PTC细胞生物学行为的影响。方法:通过qPCR技术检测51对PTC癌组织及癌旁组织手术标本中miR-221的表达情况,并通过实时荧光定量RT-PCR检测甲状腺乳头状癌K1细胞miR-221的表达,将PTC K1细胞分别转染miRNA随机序列(阴性对照组)和miR-221抑制物(miR-221抑制物组)后,以无处理的K1细胞为空白对照,分别用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期、细胞凋亡率,Transwell小室检测细胞侵袭力。结果:miR-221在PTC癌组织中的相对表达量均明显高于癌旁组织的相对表达量(P0.05)。与空白对照组比较,miR-221抑制物组K1细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率明显增加,G_0/G_1期细胞比例明显升高,而G_2/M期细胞的比例明显降低,细胞侵袭能力明显降低,差异均有统计学意义(均P0.05)。阴性对照组与空白对照组间以上指标差异均无统计学意义(均P0.05)。结论:miR-221在PTC中的表达升高,且可能通过调节细胞周期与凋亡而影响PTC细胞的增殖与侵袭能力。miR-221有作为PTC早期诊断与治疗的生物标志物的潜在价值。