多房棘球绦虫重组抗原研究

应用基因工程技术检测多房棘球绦虫诊断抗原已成为多房棘球蚴病(泡型包虫病)研 究的热点。本文综述了多房棘球绦虫和幼虫抗原基因的克隆、表达、测序,与其它蠕虫基因的比较 及重组抗原用于血清检测的效果和应用前景。     

多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中的表达及其在免疫诊断中的初步应用

目的 实现多房棘球绦虫ELP蛋白在大肠埃希菌中的表达，制备高纯度、高特异性的重组抗原，为多房棘球绦虫感染的流行病学调查和临床诊断提供新的工具。方法 在建立了多房棘球绦虫elp基因克隆的基础上，应用亚克隆方法将目的基因插入原核非融合表达载体pQE30（＋）。经酶切鉴定，转化于大肠埃希菌，以IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。亲和层析纯化ELP蛋白，用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果 酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot分析证实，成功地构建了pQ-ELP原核非融合表达载体，该载体转化大肠埃希菌在IPTG诱导下能高效表达ELP蛋白。ELP重组抗原用于ELISA检测18份包虫病人血清均阳性，10份华支睾吸虫病、27份乙肝病毒感染者和10份健康人血清均为阴性。结论 多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中得到了高效非融合表达，初步实验结果显示该重组蛋白对包虫病具有较高的诊断价值。     

多房棘球绦虫elp基因在真核细胞COS7中的表达

目的 构建中国四川株多房棘球绦虫elp基因真核表达载体，为核酸疫苗研究奠定基础。方法 应用RTPCR方法从多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因的编码序列，定向克隆于pGEM-11zf( )。经酶切鉴定及测序后将目的基因亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1( )。重组真核表达载体pcD-ELP鉴定后，纯化无内毒素的重组质粒电穿孔方法转染哺乳动物细胞COS7。RT－PCR，dot-ELISA和免疫组化方法鉴定目的基因在COS7细胞中的表达。结果 琼脂糖凝胶电泳，酶切及序列分析证实多房棘球绦虫elp基因编码区已成功地克隆于真核表达载体pcDNA3.1（＋）。RT－PCR，dot-ELSA和免疫组化证实，重组质粒在哺乳动物细胞（COS7中能够表达多房棘球绦虫ELP抗原。结论 成功地构建了中国四川株多房棘球绦虫elp基因的真核表达载体，该载体在COS7哺乳动物细胞中能表达ELP抗原，为多房棘球绦虫elp基因疫苗研究奠定了基础。     

四川株多房棘球绦虫elp基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的　实现多房棘球绦虫elp基因在原核中的表达 ,为进一步研究多房棘球绦虫ELP抗原的诊断及免疫保护性提供前提条件。方法　应用RT -PCR方法从中国四川株多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因编码序列 ,克隆测序后亚克隆于含有硫氧环蛋白 (Trx)基因的高效原核表达载体pET32a(+)。经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ELP/Trx融合蛋白。SDS -PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP/Trx融合蛋白 ,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果　酶切鉴定显示本研究已将elp基因编码序列插入 pET32a(+)的多克隆位点 ,成功地构建了pETrx -ELP融合蛋白原核表达载体。SDS -PAGE及Westernblot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了ELP/Trx融合蛋白。检测 10份包虫病人血清均阳性 ,10份肝吸虫病、10份乙肝病人和 10份健康人血清均为阴性。结论　中国四川株多房棘球绦虫elp基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达 ,初步实验结果显示该融合蛋白对包虫病具有诊断价值。     

四川株多房棘球绦虫EM10(EMII/3)抗原基因的克隆及序列分析

目前,泡球蚴病尚无特效的防治药物,在许多地区仍严重威胁人畜健康。近年来,国外学者报道了多房棘球绦虫许多重要的抗原或多肽[1,2],其中EMII/3和EM10最受重视。我们对中国四川株多房棘球绦虫EMII/3和EM10抗原基因进行了克隆和序列分析,结果如下。     

多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法

目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.     

多房棘球绦虫elp基因在真核细胞COS7中的表达

目的　构建中国四川株多房棘球绦虫 elp基因真核表达载体 ,为核酸疫苗研究奠定基础。　方法　应用 RT-PCR方法从多房棘球绦虫续绦期幼虫 RNA获得 elp基因的编码序列 ,定向克隆于 p GEM- 11zf( +)。经酶切鉴定及测序后将目的基因亚克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。重组真核表达载体 pc D- EL P鉴定后 ,纯化无内毒素的重组质粒 ,电穿孔方法转染哺乳动物细胞 COS7。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化方法鉴定目的基因在 COS7细胞中的表达。　结果　琼脂糖凝胶电泳、酶切及序列分析证实多房棘球绦虫 elp基因编码区已成功地克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化证实 ,重组质粒在哺乳动物细胞 COS7中能够表达多房棘球绦虫 EL P抗原。　结论　成功地构建了中国四川株多房棘球绦虫 elp基因的真核表达载体 ,该载体在 COS7哺乳动物细胞中能表达 EL P抗原 ,为多房棘球绦虫 elp基因疫苗研究奠定了基础。     

青海省多房棘球绦虫分子种系发生研究

目的　对青海省多房棘球绦虫分离株Cox1、Nad1基因进行扩增和测序，并构建系统进化树及分子钟，为推测其进化关系及起源提供参考依据。方法　收集2017年青海省人民医院收治的22份肝多房棘球蚴病患者术后标本，对多房棘球蚴线粒体DNA Cox1、Nad1基因进行PCR扩增和测序，并与GenBank数据库中的棘球属绦虫Cox1基因和Nad1基因序列进行比对，观察种内变异情况并构建进化树和分子钟。结果　所有多房棘球绦虫标本与GenBank数据库中检索的多房棘球绦虫亚洲株Cox1、Nad1基因序列同源性均达99%以上，共获得6种不同基因型，其中有2个分离株在GenBank数据库中未找到同源性100%的基因序列。系统进化树显示，收集的多房棘球绦虫标本与多房棘球绦虫亚洲株聚类效果明显；分子钟推测青海地区多房棘球绦虫起源于9.4万年前。结论　本研究发现青海省多房棘球绦虫存在6种不同基因型，其中首次发现2种基因型。青海地区多房棘球绦虫优势株为亚洲株，起源时间约在9.4万年前。     

多房棘球绦虫EmⅡ/3抗原研究进展

本文综述了多房棘球绦虫EmⅡ／3基因及表达蛋白EmⅡ／3的抗原性和免疫性，为多房棘球蚴病的疫苗研究和免疫诊断研究提供参考。     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

多房棘球绦虫原头节抗原的等电聚焦分析

[目的 ]了解多房棘球绦虫 (E.m.)原头节粗抗原的组成成分。 [方法 ]多房棘球绦虫原头节粗抗原经等电聚焦法分离、制备得到等电点各不相同的组分 ,各组分再通过 SDS- PAGE电泳、考马斯亮蓝染色、凝胶分析仪分析其主要蛋白条带。 [结果 ]所分离的 2 0份组分 p I值范围为 4.0～ 8.5 ,主要蛋白条带有 72 / 73、 6 2 / 6 3、 42 / 44、35 / 36、 34及 2 1/ 2 2 k Da。 [结论 ]建立了多房棘球绦虫原头节粗抗原的分离方法并取得预期的分离结果     

多房棘球蚴病诊断抗原研究进展

多房棘球绦虫特异性和保护性抗原的研究是多房棘球蚴病免疫和诊断的基础。由于天然抗原来源有限,应用受到限制,重组抗原的研制则可解决质量控制和抗原来源的问题。本文就近年来国内外对多房棘球蚴病诊断抗原尤其是重组抗原的研究进展进行了综述。     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因研究进展

本文介绍了多房棘球绦虫Em14-3-3蛋白，并对Em14-3-3抗原编码基因的研究进展进行了综述。     

鼠伤寒沙门氏菌疫苗株产生的重组多房棘球绦虫抗原诱导小鼠和犬的体液和细胞免疫应答

作者用DNA重组技术将多房棘球绦虫特异性抗原的基因片段转入减毒活鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC株中复制表达,以研制能诱发中间宿主和终宿主保护性免疫应答的多价疫苗。将携带多房棘球绦虫基因片段(产生种特异性抗原Ⅱ/3—10)的重组pVM II/3-10质粒,转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC株虫,作为重组疫苗;将不含插入基因的pUR278质粒转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC     

青海省多房棘球绦虫分子种系发生研究

目的　对青海省多房棘球绦虫分离株Cox1、Nad1基因进行扩增和测序,并构建系统进化树及分子钟,为推测其进化关系及起源提供参考依据。方法　收集2017年青海省人民医院收治的22份肝多房棘球蚴病患者术后标本,对多房棘球蚴线粒体DNA Cox1、Nad1基因进行PCR扩增和测序,并与GenBank数据库中的棘球属绦虫Cox1基因和Nad1基因序列进行比对,观察种内变异情况并构建进化树和分子钟。结果　所有多房棘球绦虫标本与GenBank数据库中检索的多房棘球绦虫亚洲株Cox1、Nad1基因序列同源性均达99%以上,共获得6种不同基因型,其中有2个分离株在GenBank数据库中未找到同源性100%的基因序列。系统进化树显示,收集的多房棘球绦虫标本与多房棘球绦虫亚洲株聚类效果明显;分子钟推测青海地区多房棘球绦虫起源于9.4万年前。结论　本研究发现青海省多房棘球绦虫存在6种不同基因型,其中首次发现2种基因型。青海地区多房棘球绦虫优势株为亚洲株,起源时间约在9.4万年前。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

目的　基于重组酶介导的等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay, RAA）建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法　分别以多房棘球绦虫（GenBank登录号：NC_000928）、细粒棘球绦虫（GenBank登录号：NC_044548）和石渠棘球绦虫（GenBank登录号：NC_009460）线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DNA和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果　所建立的多重RAA检测方法可在39 ℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论　成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。     

用细粒棘球绦虫囊液抗原B和多房棘球绦虫原头节抗原(EM18)组分作血清学诊断鉴别单房和多房棘球绦虫病

单房和多房棘球绦虫的鉴别诊断对流行病学研究和治疗具有重要的意义。血清学诊断是一种高敏感性和相对特异的诊断方法。但以前在血清学试验中所用的细粒棘球绦虫囊液粗抗原(HCF)和多房棘球绦虫原头节粗抗原存在属内和属间交叉反应,因而限制     

血吸虫、绦虫抗原的研究进展

血吸虫、绦虫是重要的寄生蠕虫，呈全球性分布。此类寄生虫宿主繁多，分布广泛，且抗原成分复杂，交叉反应多，给诊断、预防带来了很大的困难。随着免疫学的发展及基因重组技术和噬菌体肽呈现技术的出现，人们期望通过血清学诊断和研制疫苗解决寄生蠕虫病的诊断和预防问题，并取得了很大的进展。蠕虫抗原按其来源或制备途径分为：天然抗原、基因重组抗原、噬菌体肽库技术模拟抗原。现对血吸虫和绦虫抗原的研究进展综述如下。     

多房棘球绦虫RNA结合蛋白28的鉴定

目的 通过扩增多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)RNA结合蛋白28(RBP28)基因并构建重组表达质粒,诱导表达并纯化重组RBP28蛋白,探索多房棘球绦虫RBP28的分子特征。方法 根据WormBase数据库RBP28基因序列设计特异性引物;RT-PCR扩增RBP28基因并构建重组表达质粒,诱导表达并纯化重组RBP28蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;用Western blot检测多克隆抗体特异性,并通过免疫荧光观察RBP28在多房棘球蚴及其细胞中的分布;利用免疫共沉淀技术,获得与RBP28互作的蛋白沉淀产物后,对二者进行蛋白银染和质谱鉴定。结果 RBP28编码基因大小约为1 245 bp;重组RBP28相对分子质量约为M_r 50 000;Western blot结果表明,多克隆抗体能够特异性识别重组蛋白RBP28及多房棘球蚴全蛋白中的天然RBP28蛋白,但与猪带绦虫、泡状带绦虫和细粒棘球绦虫无明显的抗原交叉反应;免疫荧光定位表明,RBP28主要分布在多房棘球蚴的生发层,在多房棘球蚴细胞则主要分布于细胞质中;对银染和质谱鉴定结果比较分析,获得了7种可能与RBP28相互作用的蛋白质。结论 本研究确定了RBP28蛋白编码基因的大小、分子量及其多克隆抗体的特异性。通过免疫荧光定位,发现RBP28主要分布在多房棘球蚴的生发层,并利用质谱鉴定获得了7种与RBP28有互相作用的蛋白质,为研究多房棘球绦虫病的致病机制奠定了基础。