脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织

目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。     

体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

组织工程技术体外重建角膜上皮层的实验研究

目的 利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织，为眼表重建提供良好的移植材料及方法。方法 以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，分别种植兔角膜缘组织块及原代培养扩增的角膜缘上皮细胞，体外培养重建角膜上皮层，并进行形态、组织学、超微结构观察及免疫细胞化学检测。结果 角膜缘上皮细胞在羊膜上粘附生长并增殖，体外培养10天左右即形成3～4层上皮细胞，复合角膜上皮组织由羊膜基底膜和复层上皮细胞组成，细胞表达特异性角蛋白CK3，与生理状态下的角膜上皮组织相近。结论 以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞可体外重建组织工程化角膜上皮组织，作为眼表重建移植材料良好的来源。     

组织工程化角膜基质的构建与移植实验

目的　探讨以可降解高分子材料聚羟基乙醇(PLGA)为支架体外构建组织工程化角膜基质的可行性。 方法　将培养的角膜基质细胞接种于具微孔的可降解高分子材料PLGA内,构建成组织工程化细胞 PLGA复合物,将该复合物移植到兔眼角膜基质层间。分别于移植后 1、2周, 1、2、3、4个月取材,光学显微镜、电镜观察细胞与PLGA材料的结合情况。裂隙灯显微镜和组织切片检查组织工程化角膜基质的透明性、可降解性以及生物反应性。 结果　角膜基质细胞能与PLGA高分子材料较好地结合,移植到兔眼角膜层间的组织工程化角膜基质 7d后呈半透明, 2周见新生血管从角膜缘向植片方向生长, 1个月开始材料降解, 3 ~4个月时大部分材料降解,且新生血管减少,但是移植物呈半透明状。结论　PLGA虽然具有组织相容性好、无毒、无免疫性和可降解的特性,但不适合作为构建要求具有很好透明性的角膜组织的支架材料。     

培养兔自体角膜缘干细胞移植的实验研究

目的 观察以羊膜为载体的兔角膜缘于细胞膜片移植治疗兔角膜缘于细胞缺损的效果。方法 制造兔角膜缘干细胞缺损的动物模型,以右眼为实验眼,从兔左眼取角膜缘组织,将兔角膜缘干细胞消化下来,接种于铺有羊膜的无菌六孔培养板中,待细胞形成多层角膜上皮细胞后,对兔角膜缘干细胞缺损动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行裂隙灯及病理学检查。结果 临床和组织病理学染色证实：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增生、分化为多层角膜上皮细胞;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少或消失。结论 应用角膜缘干细胞羊膜移植术可恢复其角膜上皮结构的完整性,减少角膜新生血管的形成,维持角膜缘的细胞屏障功能。     

异种角膜脱细胞基质为供体进行角膜前板层移植的初步研究

目的探讨以异种猪角膜脱细胞基质为供体植片,分析兔角膜进行前板层移植后的生物相容性：设计实验研究。研究对象新西兰白兔。方法应用1％TritonX-100及冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,切取1／3厚度前板层作为供体角膜植片,对兔眼角膜前板层切除后进行移植,同时以新鲜猪角膜板层为供体对兔进行前板层移植作对照。通过术后角膜透明度、组织结构观察,评价猪角膜脱细胞基质的生物相容性及植片转归的情况。主要指标角膜透明度和组织学HE染色。结果制备的猪角膜脱细胞基质植片作前板层移植到兔眼后,未见明显的新生血管、炎症反应、角膜坏死等排斥现象,观察期内植片较透明;脱细胞基质表面上皮化良好,植片基质板层与植床逐渐融合,植片内有宿主细胞迁入生长,板层结构与正常角膜相似。结论猪角膜脱细胞基质具有良好的生物相容性、安全性和低抗原性,有望成为角膜板层移植的供体材料。     

Support of acellular porcine corneal stroma for growth of corneal epithelium and stromal cell in vitro

AIM: To determine whether acellular porcine cornea stroma (APCS) could support the growth of the rabbit corneal cells in vitro . METHODS: APCS was prepared. The rabbit's corneal epithelium and stromal cells were cultured and seeded on APCS in vitro . The observation of phase contrast photograph and histological examination were performed. RESULTS: Histological examination showed the epithelium grew on the scaffold of APCS in 2-3 layers at 10th day. The stromal cells adhered to the surface of the scaffold after 24 hours and invaded into the interlaminar of the material at 5th day. CONCLUSION: These results indicate that APCS can support the growth and proliferation of the corneal epithelium and stromal cells in vitro .     

不同移植手术治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究

目的探讨以人羊膜为载体培养的角膜缘干细胞，自体及异体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法制作兔眼角膜缘干细胞完全缺损3个月的模型。实验动物随机分为自体移植组和异体移植组，前者取对侧眼角膜缘组织，后者取异体兔眼角膜缘组织，均以去除上皮细胞的羊膜基底膜为载体，培养12d后行角膜缘干细胞羊膜移植术。术后观察3个月，以角膜上皮染色、角膜浑浊和新生血管3项指标进行临床疗效评定，通过病理检查评估术后角膜上皮修复情况，印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型。结果体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上粘附生长并增生，体外培养12d可形成复层。自体移植组和部分异体移植组术后角膜上皮逐渐愈合，透明度提高，基质细胞浸润减轻，新生血管减退或消失。印迹细胞学检查显示：移植前角膜上皮细胞PAS阳性，而移植后转为阴性；组织病理学显示：移植前角膜上皮大部分缺损，移植后呈现角膜上皮结构。部分异体移植组术后出现了免疫排斥反应。结论兔自体角膜缘干细胞羊膜移植术可重建眼表；免疫排斥反应仍是异体角膜缘干细胞羊膜移植术失败的主要原因。     

以异种角膜脱细胞基质为载体构建角膜上皮-载体-内皮复合物的实验研究

目的探讨以异种角膜脱细胞基质为载体,体外构建生物角膜的可能性和方法。方法应用去垢剂1％TritonX-100冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,在其上皮面和内皮面分别接种兔角膜上皮细胞和内皮细胞,体外培养2周。将复合物制成组织切片,在光镜下观察组织形态（HE染色）,采用免疫组织化学方法检测角膜上皮特异性细胞角蛋白3（CK3）,使用锥虫蓝联合茜素红染色观察内皮细胞,在扫描电镜下观察上皮面和内皮面的超微结构。结果体外培养生物角膜获得上皮、无细胞基质和内皮三层复合结构。4或5层复层上皮中以扁平细胞为主,胞质内特异性CK3表达阳性;内皮层为一连续的单层扁平细胞,细胞活性良好,锥虫蓝联合茜素红染色显示组织呈典型的蜂巢样镶嵌结构。扫描电镜下观察,在载体的上皮面细胞呈复层样生长,形态近似扁平与梭形之间;内皮面为多边形单层细胞,表面具有微绒毛结构。结论构建的生物角膜为上皮一脱细胞基质载体一内皮复合物,初具角膜的雏形结构。异种角膜脱细胞基质提供了良好的细胞生长界面,有望成为体外构建角膜的载体材料。     

羊膜培养兔角膜缘上皮细胞及自体移植--角膜缘干细胞缺损的治疗

目的　探讨以人羊膜为载体培养兔角膜缘上皮细胞及其自体移植治疗全角膜缘干细胞缺损。方法　在8只兔右眼用正庚醇脱上皮和角膜缘环切的方法构建全角膜缘干细胞缺损模型2月。其中6只兔为实验组,活体取左眼角膜缘浅层小块,置羊膜上常规和气_液培养42天后进行自体移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损;2只兔为对照组,直接用解冻无细胞人羊膜移植治疗右眼角膜缘干细胞缺损。进行细胞和术眼活体观察、组织学观察和电镜观察。结果　角膜缘上皮细胞在羊膜上生长良好,形成复层,细胞间的联结结构存在,细胞与羊膜组织粘附牢固。实验组移植手术后角膜迅速上皮化,恢复角膜表面光滑和透明,组织学观察和电镜观察呈现生理角膜上皮层的结构特点。但眼睑闭合不全可导致手术失败。对照组术后出现角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。结论　以羊膜为载体培养角膜缘上皮细胞后自体移植可有效地治疗角膜缘干细胞缺损导致的角膜病变。     

Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns

PURPOSE: To evaluate the efficacy of autologous corneal epithelial sheet implantation in restoring transparency of rabbit corneas severely injured by alkaline and the effect of photocoagulation in arresting corneal neovessel ingrowth. SETTING: Ophthalmology Department, School of Biomedical Sciences, Universidad Austral, Buenos Aires, Argentina. METHODS: Limbal stem-cell deficiency (LSCD) was induced in 14 rabbits by alkali burns. A limbal cell biopsy was done in the contralateral eye, and the cells were cultured on a fibroblast feeder layer grown on autologous clotted platelet-poor plasma or commercial fibrin for 21 days. Anterior keratectomy was followed by suturing corneal cell sheets over the stroma. If regrowth of vessels occurred, argon laser photocoagulation was applied to them. Rabbits were killed at 30, 60, 90, 180, and 360 days and the corneas processed for histopathology and inmunohistochemistry. RESULTS: A small (2.5 mm(2)) limbal biopsy achieved stem-cell replication in vitro. Corneal clarity and epithelial defects evolved with a trend toward improvement. There was a significant reduction in corneal neovascularization. Histology showed a multilayered stratified epithelium including several epithelial-like cells with clear cytoplasm in the deepest part. There were no signs of intraepithelial mucin cells on the implanted corneas. Immunohistochemical results showed expression of cytokeratins 3 and 12 in the central corneal epithelium and an absence of cytokeratin 19. CONCLUSIONS: Autologous limbal epithelial cell transplantation improved the corneal surface in eyes with LSCD. Photocoagulation of neovessel ingrowth was effective over the 1-year follow-up. Results may facilitate the application of this technique in patients.     

鸵鸟去细胞异种角膜基质载体异位移植对BALB/c小鼠外周血T细胞亚群的影响

背景 鸵鸟去细胞角膜基质具有与人角膜基质相似的天然结构,有望成为直接应用或构建生物角膜理想的载体材料之一. 目的 用鸵鸟角膜制备去细胞基质载体,研究其免疫原性,为产业化开发早日用于临床提供实验基础.方法 收集新鲜鸵鸟和猪眼球各20个,采用低温冷冻联合酶消化及干燥剂脱水法制备鸵鸟及猪去细胞角膜基质载体,用Co^60照射法进行消毒.按随机数字表法将雄性BALB/c小鼠45只随机分为伪手术组、猪去细胞角膜基质组和鸵鸟去细胞角膜基质组,伪手术组小鼠仅制作囊袋,不植入异种角膜基质片,其余两组分别取干燥脱水法制备的猪、鸵鸟去细胞角膜基质载体（复水后每片湿质量为10 mg）异位植入BALB/c小鼠背部皮下,术后观察伤口愈合情况,并分别于术后7、14、28 d获取BALB/c小鼠外周血,进行免疫荧光标记及流式细胞仪分析,比较两种异种角膜基质对小鼠CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋表型的动态影响.结果 猪、鸵鸟去细胞角膜基质载体小鼠植入处皮肤无红肿及渗出,伤口愈合良好.术后7、14和28 d,伪手术组、猪去细胞角膜基质组和鸵鸟去细胞角膜基质组外周血中CD4^＋细胞百分率的差异均无统计学意义（F=0.74,P=0.50;F=0.39,P=0.05;F=3.46,P=0.58）;外周血中CD8^＋细胞百分率的差异均无统计学意义（F=1.75,P=0.21;F=1.14,P=0.35;F=0.78,P=0.48）;外周血中CD25^＋细胞百分率差异亦均无统计学意义（F=0.52,P=0.61;F=3.53,P=0.62;F=2.42,P=0.13）.结论 鸵鸟去细胞角膜基质载体的免疫原性低,具有重要的开发价值.