HLA-B无效等位基因B*5408N的核苷酸序列分析

本研究探讨HLA新的等位基因HLA-B＊5408N的分子基础。采用商用抽提试剂盒抽提样本DNA,利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第2-4外显子,对PCR扩增产物直接进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果表明：先证者样本测序得到两个等位基因,其中一个等位基因为HLA-B＊1527,另一个经blast验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank（DQ295998,DQ295999,DQ296000）。与最接近的HLA-B＊5401等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第553位G→T,这导致第161位氨基酸Glu（GAG）→终止密码（TAG）,蛋白质的翻译提前终止。血清学方法未能检出HLA-B54抗原。结论：该等位基因为HLA-B无效表达等位基因,已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B＊5408N。     

新的HLA-B*4061等位基因的核苷酸序列分析

本研究探讨HLA新的等位基因HLA-B＊4061的分子基础。采用盐析法抽提样本DNA，利用PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第1-8外显子，PCR产物直接经TOPO克隆到质粒载体中得到单链，对所得克隆进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析。应用PCR-SSP方法证实测序所发现的突变。结果表明：先证者样本克隆测序得到2个等位基因，其中1个等位基因为B＋4601，另1个经blast验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ089628，DQ089629，DQ089630）。与最接近的B＊400101等位基因序列相比，新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同，即第272位C→A，导致第67位氨基酸Ser→Tyr。结论：HLA-B＊4061等位基因为新的HLA-B等位基因，已荣获世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名。     

HLA-B新等位基因B~*4608的核苷酸序列分析

目的分析1个HLA-B位点有异常反应格局样本的核苷酸序列。方法采用DNA快速抽提试剂盒抽提样本基因组DNA,PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第1-8外显子,PCR产物直接经TOPO TA克隆到质粒载体中以获得单链,对克隆所得产物进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因,其中1个等位基因为B*5502,另1个经Blast验证为新等位基因,其序列已递交Genbank(DQ177521,DQ177522,DQ177523)。与最接近的B*4601等位基因序列相比,新等位基因在第3外显子上有2个核苷酸不同,即第538位T→C和第539位G→T,并由此导致1个氨基酸改变:第156位色氨酸→亮氨酸。结论该新HLA-B等位基因已WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4608。     

一例HLA-A新等位基因A*2459的测序分析

本研究探讨HLA新等位基因HLA-A*2459的分子机制。样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒,利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLA-A基因的第2-4外显子,PCR产物直接进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果显示:先证者样本中存在2个HLA-A等位基因,其中1个等位基因为HLA-A*1101,另1个经Blast验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ313255,DQ313256,DQ313257)。与最接近的HLA-A*24020101等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第527位T→C;这导致氨基酸第152位Val→Ala。结论:该等位基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*2459。     

首例HLA-B新等位基因HLA-B＊15：124的核苷酸序列分析

本研究探讨人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）新等位基因HLA-B＊15：124的核苷酸序列及其分子机制。采用商用试剂盒抽提标本基因组DNA,利用HLA-B组特异性引物PCR扩增先证者HLA-B基因的第2,3和4外显子,经酶法纯化扩增产物后进行第2,3和4外显子双向测序分析。结果表明：先证者标本组特异性引物扩增测序得到2个等位基因,其中1个等位基因为B＊40：03,另1个为新发现的等位基因,与最接近的B＊15：52等位基因序列相比,新的等位基因在第3外显子上有2个核苷酸不同,第499位A→T和第512位G→T,这导致氨基酸第143位Thr→Ser和第147位Trp→Leu。结论：新的等位基因在第3外显子上有2个核苷酸不同。该等位基因序列已递交GenBank（EF187276）,并作为1个首次发现的HLA-B位点的等位基因,已经被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B＊15：124。     

HLA-A新等位基因HLA-A~* 110106的核苷酸序列分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A* 110106的分子机制。方法采用商用DNA试剂盒抽提样本基因组DNA,利用HLA-A组特异性引物PCR扩增先证者HLA-A基因的第2、3外显子,经酶法纯化扩增产物后,用第2、3外显子双向测序引物进行测序分析。结果先证者有2个HLA-A等位基因,其中1个为HLA-A*0203,另1个HLA-A等位基因经HLA b last验证为新的等位基因,新的等位基因序列已递交Genbank(EF092416)。与最接近的HLA-A*110101等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第387位G→C,但未引起氨基酸的改变。结论该等位基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*110106。     

HLA新等位基因HLA—A＊1127认定

目的发现和认定HLA新等位基因HLA—A＊1127。方法应用PCR—SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,采用分子克隆和PCR产物直接测序方法得到核苷酸序列,通过软件分析基因序列及其与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现1个样品的HLA—A位点结果异常。其序列与已知所有HLA—A等位基因序列不一致,与同源性最高的等位基因A＊1104的差异是在第三外显子区域的570位碱基发生G→C的替换,并导致了相应的166密码子由GAG→GAC,编码的氨基酸由谷氨酸（Glu）变成天冬氨酸（Asp）;571位碱基发生T→G的替换,并导致相应的167密码子由TGG→GGG,编码的氨基酸由色氨酸（Trp）变成甘氨酸（Gly）。结论该等位基因为HLA新的等位基因,被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA—A＊1127。     

α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因742C>T突变导致A2亚型

本研究探讨2例ABO亚型A2B的分子机制。利用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原,用标准A、B、O细胞检测先证者血清中的ABO抗体,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增先证者ABO基因的第5至7外显子序列,其PCR产物经酶切后直接测序分析。同时,PCR产物经TOPO TA克隆到质粒载体中获得单链,对所得克隆进行ABO基因第6、7外显子双向测序分析。结果表明,先证者红细胞有A、B抗原,同时其血清中存在抗A1抗体。直接测序分析发现,第261位无缺失,第297位A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、742C/T、796C/A、803G/C、930G/A杂合。克隆测序得到B101和1个新的A等位基因。与A102相比,新A等位基因仅在第742位C→T突变,导致第248位精氨酸变成色氨酸,新等位基因已被正式命名为A213。结论 :α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因第742位C→T突变导致产生A2表型,表型个体血清中可含有抗A1抗体。     

新等位基因HLA-B^＊5812的认定

应用流式反向PCR-SSO和PCR-SSP基因分型技术发现可能的HLA新等位基因,对PCR产物进行HLA基因分型、DNA序列分析及克隆测序。发现一个样本的HLA-B位点结果异常,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列均不一致,与同源性最高的等位基因B*5801的差异在于第2外显子区域中的第69位碱基发生了G→T的替换,即"GCA→TCA",结果改变了第24位密码子编码的氨基酸,即"丙氨酸→丝氨酸"。判断该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,已于2006年4月被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*5812。     

中国汉族血友病B家系五种新的FⅨ基因突变的研究

目的探讨中国汉族无关血友病B家系先证者的凝血因子Ⅸ基因的突变和发病的分子机制。方法对19例中国汉族无关血友病B家系先证者，静脉采集各家系先证者外周血，表型诊断确诊后，用PCR对FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果19例血友病B家系先证者均检测到相应的基因序列的改变。结论19例中国汉族无亲缘关系的血友病B家系先证者FⅨ基因在编码外显子的核苷酸部位均发现有基因突变，其中发现五种新的突变，即6444T→A（Cys23Stop）；10497G→C（Cys82Ser）；31101G→T（Arg327Ile）；31102InsertT；30984T→G（Ile288Ser）为国际上首次报道。     

HLA新等位基因A*3018的序列分析和确认

为了识别和确认中国汉族人群中的HLA新等位基因,使用PCR-SSP、FLOW-SSO以及PCR-SBT等HLA分型技术,发现样本A位点的杂合结果A*240201,300101在外显子2有3个位置与数据库不相符。用组特异性引物分别扩增A*24及A*30基因,对外显子2、3、4进行双向测序,发现1个与A*300101序列相近的新等位基因。分析该等位基因与A*300101序列的差异。用EB病毒感染外周血B淋巴细胞,建立该等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系。结果表明:该基因与A*300101相比在外显子2有3个碱基的改变,碱基121A→C、123T→C导致密码子17AGT->CGC,17S(丝氨酸)→R(精氨酸);碱基126A→G导致密码子18GGA→GGG,18G(甘氨酸)→G(甘氨酸),该氨基酸是同义突变。成功建立了该等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系,该基因序列已提交GenBank,编号为DQ872509。结论:该等位基因为新的HLA-A等位基因,已于2006年8月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*3018(上报编号HWS10004039)。     

DNA序列分析鉴定HLA新等位基因B~*0740

目的确认一个中国人群中的新HLA等位基因。方法应用单倍型特异性分离(haplotype-specific ex-traction,HSE)技术和DNA序列分析技术鉴定HLA-B~*的新等位基因。结果被检标本HLA-B位点有一个等位基因的核苷酸序列与任何已知的HLA等位基因均不同,与同源性最高的B~*0705相比,在exon3区域中的605位碱基由A>T,引起编码178位的氨基酸由赖氨酸(K)变成甲硫氨酸(M)。血清学分型表明新等位基因的免疫学表型仍为HLA-B7。家系分析提示,HLA-B~*0740基因来源于其母亲。结论该等位基因序列为HLA-B位点的一个新等位基因,于2005年2月由WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B~*0740。     

基因组序列分析HLA新等位基因B*3818内含子和外显子同时突变

目的 分析HLA新等位基因B*3818的基因组序列.方法 克隆测序方法 对PCRSBT中发现的1个未知HLA-B等位基因的基因组序列进行双向全长测序,并采用微量淋巴细胞毒方法 鉴定该等位基因编码分子的抗原特异性,通过群体调查和家系分析了解该等位基因的群体分布频率和单倍型组成情况.结果 新等位基因HLA-B*3818(序列注册号为FJ561482)与B*380201在第4外显子和第5内含子同时存在1个核苷酸的差异.第4外显子的第660位碱基由C变为A,导致第196个密码子由GAC变为GAA,相应氨基酸由天门冬氨酸变为谷氨酸,与IMGT/HLA中的HLA-B等位基因的序列进行对比,该突变为新的单核苷酸多态性位点.第5内含子的第2133位碱基由A变为C,除此之外,B*3818的内含子序列与B*380101、B*380201和B*3814相同.该新HLA等位基因的血清学特异性为B38,其在中国汉族人群中的分布频率小于0.000 5,家系调查结果 表明携带该新等位基因的单倍型为A*030101-CW*010201-B*3818-DRB1-1312-DQB1*060101.结论 新等位基因HLA-B*3818的内含子和外显子同时存在变异,研究新等位基因的基因组序列可为HLA基因相关研究和应用提供更多的序列信息.     

DNA测序鉴定HLA新等位基因B~* 35:03:07

本研究旨在分析鉴定中国人群HLA-B位点一个新等位基因。应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)技术检测到一个与HLA-B*35:03:01相关的未知基因,应用DNA序列分析技术鉴定并分析该基因与同源性最高的HLA等位基因的序列差异。结果表明,先证者HLA-B位点有1个等位基因的核苷酸序列与所有已知基因序列均不相同,与同源性最高的HLA-B*35:03:01相比,第3外显子387位碱基由C→G,并导致相应的105位密码子编码的氨基酸由CCC变为CCG,编码的氨基酸没有改变,仍为苯丙氨酸。结论:被测样本含有HLA-B新等位基因,WHO HLA因子命名委员会将其正式命名为HLA-B*35:03:07。     

在中国汉族人中发现新不表达等位基因HLA-A~*0253N

目的　鉴定在中国浙江一个汉族家庭中发现的新的HLA新不表达等位基因。方法　对 1个无γ球蛋白血症患儿及其母作HLA血清学分型与基因分型 ,针对二者结果有差异 (血清学不能检出其中的 1个抗原 ,而DNA基因分型结果为HLA 0 2XX) ,进行基因克隆和基因组DNA全长测序 ,分析该HLA 0 2XX和HLA A 0 2 0 11基因序列差异。结果　该基因与HLA A 0 2 0 11的差异 ,仅在外显子 2区域的 32 4C >G的单个碱基的替换 ,导致了密码子 10 8由酪氨酸变为终止密码子。家系调查表明 ,在被检测的 2 2个家庭成员中 ,患儿及其母亲、外祖父、姐姐和舅舅携带有该基因。而在 718名具有A 0 2基因的随机造血干细胞供者中 ,未发现带有该基因的个体。结论　该基因是 1个HLA A不表达等位基因 ,世界卫生组织 (WHO)基因命名委员会于 2 0 0 1年 9月将其正式命名为HLA A 0 2 5 3N ,其单倍型为A 0 2 5 3N ,B 370 1,DRB1 10 0 1。