高致病性禽流感研究进展

禽流感（Avian influenza,AI or bird flu）是禽流行性感冒的简称,它是指由禽流感病毒引起的一种动物传染病,常发生在禽,有时也发生在低等哺乳类动物,至今在人仅有偶发病例。禽流感病毒（Avian influenza Virus，AIV），根据其对鸡致病性的不同分为高致病性、中致病性和低，非致病性的，而不是对人而言。高致病性的为H5和H7亚型病毒中一些毒株，中致病性的主要指H9N2和H6N8亚型毒株。其他的毒株均为低，非致病性的。     

高致病性禽流感病毒血凝素基因定点突变及其原核表达

目的改构高致病性禽流感病毒血凝素基因,建立有效的原核表达体系。方法利用位点特异PCR突变技术同义突变HA1基因中的稀有密码子,将改构的HA1基因克隆到pGEX-4T-1载体中建立4T-1-HA1-m 重组表达质粒,然后转入E·coliBL21DE3中并用IPTG诱导表达HA1-GST融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白,Western印迹分析表达产物的免疫活性。结果改构的HA1基因能够在大肠埃希菌中有效表达,表达产物能与H5N1亚型高致病性禽流感病毒免疫鼠血清特异性结合。结论提示高致病性禽流感病毒血凝素基因经位点特异PCR突变技术改构后,可以在大肠埃希菌中表达出有免疫活性的血凝素蛋白。     

高致病性人禽流感H5N1疫苗滴鼻免疫应答效果的初步研究

目的 通过高致病性人禽流感H5N1全病毒-MF59佐剂疫苗滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价该疫苗所诱导的系统免疫与黏膜免疫应答效果.方法 以不同剂量抗原按比例与MF59佐剂配伍制成粘膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠,二免2周采血检测血清IgG、IgM效价及血清中HAI(HA inhibitor)的中和抗体效价,同时收集鼻、肺灌洗液,检测其lgG和slgA抗体效价.结果 H5NI+MF59组血清抗体效价较H5NI组有显著升高(P＜0.01);在各剂量组中,随着剂量的增加抗体效价呈上升趋势.12μg腭后抗体效价呈下降趋势,以HSNI+MF59(12μg)组效价最高;肺鼻灌洗液中,均可检测到特异性分泌型IrA、IsG,其中特异性分泌型IgA效价略高于IgG;抗体亚型的分布以IgG1、IgG2b为主.结论 灭活高致病性禽流感全病毒H5N1在佐剂MF59作用下可诱导机体产生体液免疫应答,同时还可以在黏膜局部产生特异性分泌型IgA、IsG,为高致病人禽流感病毒I-15N1黏膜疫苗的研制奠定了基础.     

高致病性禽流感的流行及其预防控制

禽流行性感冒（简称禽流感，Avian influenza，AI）也称禽流感综合征，是由A型流感病毒（Avian influenza vires，AIV）引起的急性、高度致死性、烈性传染病。该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。AIV依据其外膜血凝素（Hemagglutinin，H）和神经氨酸酶（Neuraminidase，N）抗原性的不同，目前至少可分为15个H亚型（H1～H15）和9个N亚型（N1-N9）。由H5和H7亚型毒株（以H5N1和H7N7为代表）所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HeM），其发病率和病死率都很高，危害极大。     

高致病性人禽流感H5N1透皮疫苗促渗剂的初步筛选

目的 初步筛选用于高致病性人禽流感H5N1透皮疫苗的较有效的促渗剂.方法 选用乙醇、丙二醇、二甲基亚砜、维甲酸、油酸作为促渗剂,将其应用于BALB/c小鼠,再用灭活的高致病性人禽流感H5N1透皮疫苗免疫小鼠,通过评价透皮免疫应答的效果对促渗剂进行初步筛选.结果 二甲基亚砜、维甲酸组和油酸组血清IgG抗体效价明显高于其他促渗剂组(P＜0.05).结论 在高致病性人禽流感H5N1透皮疫苗的小鼠模型中,二甲基亚砜、维甲酸和油酸是较好的促渗剂.     

福建三株柔嫩艾美耳球虫的分离、鉴定及致病性的初步研究

采用单卵囊分离技术,从福建省莆田市、福清市和连江县等三地鸡场的病鸡盲肠内容物样品中,分离获得3株柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella,代号分别为PT0705、FQ0709和LJ0711.为比较这3株柔嫩艾美耳球虫的致病性,分别用1×104、5×104和10×104个孢子化卵囊的剂量感染14日龄和21日龄健康无球虫雏鸡,通过临床表现、死亡率、增重、病变计分等指标进行统计和分析,确定PT0705为毒性最强虫株.     

人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理学观察

目的 观察人感染高致病性禽流感病毒H5N1后各主要脏器的病理改变.方法 按传染病尸体解剖要求对2例死亡病例系统解剖,并获得心、肝、脾、肺和肾等主要脏器,对1例重症患者行肺大泡切除术,组织常规HE和免疫组织化学染色,光学显微镜下观察.结果 2例肺组织主要呈弥漫性肺泡损伤改变.早期呈渗出性改变,肺泡上皮坏死脱落,肺泡腔内见大量均匀粉染渗出液伴广泛透明膜形成.中晚期主要呈增生性和纤维化性改变,肺泡上皮和支气管上皮增生,肺泡腔内渗出物和肺间质纤维化.1例在慢性支气管扩张症基础上伴弥漫性肺泡损伤和肺间质纤维化.免疫器官改变:全身淋巴组织萎缩伴活跃的噬血现象.其他脏器病变:1例心脏有间质性心肌炎;1例肾脏有急性肾小管坏死;1例有脑水肿伴脑实质内神经细胞嗜酸性变,轴突肿胀,粗细不均.脑室旁见灶状坏死.1例孕妇胎盘内多灶状滋养叶细胞坏死伴营养不良性钙化,有急性坏死性蜕膜炎.胚胎肺脏有肺水肿和肺炎改变.结论 人感染高致病性禽流感病毒H5N1后首先出现呼吸系统症状,广泛弥漫性肺泡损伤致低氧血症是病理学基础,患者最终因多器官功能衰竭致呼吸、循环衰竭死亡.     

人感染高致病性禽流感病毒H5N1尸体解剖病理分析

目的探讨人感染禽流感死亡病例尸体解剖组织的病理学特征。方法尸体解剖1例人感染H5NI高致病性禽流感病毒死亡病例,对其心、肺、肝、脾、肾和大脑等组织进行光镜观察,对肺组织进行了组织化学和免疫组织化学表型以及电镜观察。结果人感染禽流感的主要病变为双肺弥漫性肺泡损伤,透明膜形成,以及多灶性出血。肺泡腔内充满淡红粉染物（即水肿液）和不等量的各种炎细胞,炎细胞以淋巴细胞、单核细胞、浆细胞和少许中性粒细胞以及吞噬细胞为主。肺泡壁血管广泛性扩张淤血,部分肺泡壁透明膜形成。免疫组织化学染色显示：炎细胞主要以T淋巴细胞和单核细胞为主。结论人感染禽流感病理形态学改变以肺部最明显,主要为双肺弥漫性肺泡损伤,急性弥漫性渗出性病变,渗出的细胞以T淋巴细胞和单核细胞为主。肺部广泛性实变、肺水肿、肺出血导致呼吸窘迫是本病的主要死因。     

柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察

运用单卵囊分离技术,从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得l株纯种球虫,鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323,并对其致病性进行了研究。（1）该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形,卵囊壁光滑、褐色,无卵膜孔,有极粒,无内、外残体。孢子囊呈长卵圆形,有斯氏体。卵囊大小范围为（16．80～28．80）μm×（14．40～25．20）μm,平均大小为（21．54±0．24）μm×（17．85±0．24）μm,形状指数为1．21±0．05。子孢子,大小范围为（10．20～12．75）μm×（4．40—7．25）μm,平均大小为（11．54±0．24）μm×（6．27±0．43）μm。潜隐期为141h,最短孢子化时间为19h;（2）63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组,分别口服感染此新鲜卵囊1×10^3、5×10^3、1×10^4、2×10^4、5×10^4、1．0×10^5个,并设立不感染对照组。结果表明：所有感染组增重均低于对照组（P〈O．05）,各感染组间随着感染剂量的增加,增重和增重率显著降低,血便率和盲肠病变记分增加（P〈0．05）;（3）将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊,以1．5×10^4个／只的剂量感染11日龄雏鸡,每组10只。结果表明：保存1个月和4个月活力较高,保存10个月活力开始下降,保存13、17个月活力下降较大。     

中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的实验室诊断

目的 对2005年10月湖南省湘潭市湘潭县发生的一名不明原因肺炎病例进行实验室检测,以确定导致该病例的主要病因.方法 采集病例呼吸道标本以及血清标本,对呼吸道标本利用分子鉴别诊断技术以及RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸;通过血凝抑制试验以及微量中和试验检测血清中的特异性抗体.结果 该病例所有的呼吸道标本H5N1病毒特异性核酸及病毒分离均为阴性.红细胞凝集抑制及微量中和实验显示,恢复期血清较急性期血清H5N1特异性抗体阳转并且有4倍以上增高.结论 通过实验室检测结果分析,该病例为中国大陆第一例人感染高致病性禽流感病毒（H5N1）实验室确诊病例.     

中国人疱疹病毒6型（HHV—6）的分离与鉴定

４例婴儿玫瑰疹病人外周血淋巴细胞与脐血淋巴细胞共培养，３例病人标本见有细胞病，其中１株病毒经多次传代和冻存后，仍能产生ＣＰＥ。该病毒株感染细胞的超薄切片在电镜下可见疱疹病毒性颗粒，感染细胞涂片与抗ＨＨＶ－６单抗产生明显荧光，用该病毒株制备的单抗与ＨＨＶ－６ Ｚ２９株荧光试验呈阳性，表明分离的病毒为ＨＨＶ－６。     

北京地区病毒性脑炎患者病原体的分离和初步鉴定

１９９１年夏秋季，我们从４１例北京儿童医院临床诊断为病毒性脑炎（非乙脑）患者的７５份急性期血和／或脑脊液中分离到３３株病毒。对其中１２株进行电镜观察，电镜下均见大小相同的球形病毒颗粒，毒粒的直径约为４４．７８±１．３５ｕｍ，无囊膜，具双层蛋白外壳，视野内多见空心颗粒。超薄切片显示病毒在感染细胞的胞浆内发生，直径约为４７．６±２．３ｕｍ。正常细胞中未见病毒颗粒。对其中３株病毒进行理化性状分析，多次试验均显示该病毒抵抗５＇－碘脱氧尿苷，抵抗乙醚，耐酸，能在地鼠肾ＢＨＫ－２１和白纹伊蚊Ｃ６／３６细胞上增殖并出现细胞病变。该病毒与本室制备的披膜病毒科甲组、乙脑病毒和布尼亚病毒科的组特异性免疫腹水均不反应。脑内接种３日龄乳小白鼠可引起不规律的发病和死亡。上述结果表明，该病毒是一类４５ｕｍ左右、无囊膜、耐酸的ＲＮＡ病毒。     

禽流感与人类健康

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起的一种从呼吸系统到全身性败血症等多种症状的传染性疾病综合征。禽流感病毒在分类地位上与人的流感病毒一样。属于正粘病毒科，A型流感病毒属，单股负链分节段的RNA病毒。根据表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异可分为不同的亚型。到目前为止，已经鉴定了16种H亚型（H1-H16）和9种N亚型（N1-Ng）。禽流感病毒根据其对鸡致病性的强弱可分为高致病性和低致病性两种。高致病性禽流感病毒可引起鸡群高达100％的死亡率，故被世界动物卫生组织（OIE）列为A类疾病。低致病性禽流感病毒可引起温和的呼吸道疾病，但在混合感染或环境因素的作用下可引起严重的疾病。近年来H5N1和H9N2等亚型的禽流感病毒感染人的事件，表明家禽是禽流感人畜传播潜在的中间宿主。这也使得世界各国对禽流感的关注程度大大提高。因此，开展对禽流感病毒的研究，从分子水平掌握禽流感病毒的流行规律和致病机理，不仅在病毒学、兽医学等学科上有重要的学术意义，而且在公共卫生等方面也具有重大的社会意义。     

中国人感染H5N1亚型高致病性禽流感病例病毒分离培养探讨

目的 分析中国大陆人感染H5N1高致病性禽流感病例标本采集和病毒分离培养之间的关系.方法 对2005年10月至2009年3月中国大陆人感染H5N1高致病性禽流感病例标本进行病毒分离培养.结果 标本采集时间主要集中在发病后的0～14 d,其中0～7 d采样的标本阳性率分布相对集中,病毒分离的效果要更加显著;标本采集类型主要为呼吸道标本,其中下呼吸道标本的病毒分离阳性率分布较集中,病毒分离效果也更明显.结论 人禽流感病例标本采集时间及标本的采集类型对病毒分离有一定的影响,应在发病的急性期侧重于采集下呼吸道标本,这样利于提高病毒分离的阳性率.     

人外周血树突状细胞的分离与鉴定

应用细胞分层剂密度梯度离心辅以细胞贴壁和花环沉降法，分离和纯化人外周血树突状细胞，通过Ｅｔ花环形成细胞测定，荧光染色镜检和ＦＡＣＳ分析表明，分离的细胞纯度可达４０％￣６０％，残留的其他细胞多为ＮＫ细胞，单核细胞和Ｔ细胞，ＦＡＣＳ分析还显示：所分离的细胞表面ＭＨＣⅡ类抗原的阳性率达９７．３４％，扫描电镜观察可见独特的细胞形态，将此类细胞加入体外淋巴细胞增殖反应体系则呈现明显促进作用，提示：分离的细胞     

广东省2例城市型人感染高致病性禽流感（H5N1）病例的流行病学调查

目的通过对2例城市人禽流感病例的流行病学调查、分析，探讨无直接病死禽暴露情况下的可能感染来源，为进一步防控禽流感提供科学依据。方法采用现场流行病学、血清学调查的方法；荧光定量PCR、ELISA、RT—PCR和应急监测等方法进行调查、诊断。结果2例感染高致病性禽流感病毒（H5NI）确诊病例未发现有明确病死禽接触史，但发病前到过甚至多次到过农贸市场；密切接触者中没有发生不明原因肺炎病例，未发现人一人传播证据。结论2例人感染高致病性禽流感病例均属城市型感染个案，非人传人病例，感染来源可能与农贸市场环境有关。     

人感染高致病性禽流感病毒H5N1核酸检测方法的建立及应用

目的 建立人感染高致病性禽流感病毒H5N1的核酸检测方法,用于人感染高致病性禽流感病毒疑似病例临床标本的检测.方法 针对甲型流感病毒保守基因M设计RT-PCR和real-time PCR引物检测是否为甲型流感病毒,同时针对H5N1禽流感病毒设计针对H5和N1基因的特异性RT-PCR和real-time PCR引物作亚型检测,建立禽流感H5N1病毒RT-PCR和real-time PCR检测方法.结果 本研究建立的RT-PCR和real-time PCR方法可以特异性地检测H5N1病毒,并且与人流感病毒H1、H3没有交叉反应.RT-PCR检测方法灵敏度可到1TCID50,real-time PCR灵敏度可达0.01TCID50.利用上述方法检测人感染高致病性禽流感病毒H5N1疑似病例临床标本,从42例不明原因肺炎病例中检测出阳性标本13例.结论 本研究建立的RT-PCR和real-time PCR方法可以用于人感染高致病性禽流感病毒H5N1临床标本的实验室检测.     

人CD4+CD25+ Treg细胞的分离和鉴定

本实验通过分离正常人外周血CD^ CD25^ Treg细胞，并进行功能分析和性质鉴定，为进一步研究CD4^ CD25^ Treg细胞在病原体慢性感染中的意义奠定基础。     

广东省严重急性呼吸综合征病毒的分离和鉴定

目的 分离和鉴定引起广东省非典型肺炎的病原体。方法 收集非典型肺炎患者的各种临床标本，用狗肾传代细胞(MDCK)进行病原体分离，并运用血清学和分子生物学方法进行鉴定。结果 用MDCK细胞从非典型性肺炎患者标本中分离到病毒，用SARS病毒聚合酶基因的特异引物，通过巢式聚合酶链反应(nest RT-PCR)，扩增出一个279nt的片段，序列分析结果显示，该序列和目前已知的冠状病毒有39％-65％同源性，和来源于不同地区分离的SARS冠状病毒株(中国北京、香港、台湾和德国、意大利等)在同一个位置(第12个碱基)仅有一个碱基不同，由a→t。间接免疫荧光抗体检测显示，该病毒能够和非典型肺炎患者的恢复期血清呈特异的抗体反应。结论 这种新的冠状病毒是引起广东省非典型肺炎的病原，且能够用MDCK细胞进行分离。