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目的:确立慢病毒载体高效感染人口腔黏膜成纤维细胞的感染条件,为进一步应用基因工程技术研究人口腔黏膜成纤维细胞奠定基础。方法:采用组织块法培养原代人口腔黏膜成纤维细胞,免疫组化SP法鉴定细胞类型,将携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染纯化细胞,并设置不同感染条件,感染4 d后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果:成功分离纯化得到人口腔黏膜成纤维细胞,当慢病毒感染复数为30,polybrene浓度为8μg/mL,并加入感染增强液时,可达到较高的感染效率,满足后续实验需要。结论:慢病毒载体可高效感染人口腔黏膜成纤维细胞,携带的绿色荧光蛋白基因可在成纤维细胞内稳定表达。 相似文献
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原癌基因c-myc与多种肿瘤密切相关,最近发现c-myc是端粒酶的调节基因,且Mad和Sp1也参与了该调节。 相似文献
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原癌基因c-myc与多种肿瘤密切相关,最近发现c-myc是端粒酶的调节基因,且Mad和Spl也参与了该调节。 相似文献
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目的:以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因(hTRT)转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法:将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA 和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性。结果:获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8~9代。结论:转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因。 相似文献
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目的 探讨端粒酶逆转录酶(TERT)mRNA在口腔扁平苔藓(OLP)中的表达及临床意义。方法 采用原位杂交(ISH)的方法,检测了20例糜烂型扁平苔藓(erosive oral lichen planus,eOLP)、20例非糜烂型扁平苔藓(non-erosive oral lichen planus,neOLP)和12例正常口腔黏膜TERT mRNA的表达。结果 糜烂型OLP的TERT mRNA阳性率明显高于非糜烂型OLP的TERT mRNA阳性率(P<0.05)。糜烂型OLP与非糜烂型OLP染色强度相比有统计学意义(P<0.05)。结论 糜烂型OLP的上皮细胞可能比非糜烂型OLP的上皮细胞处于更高的增殖状态。 相似文献
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目的:通过过表达Golli?MBP基因尝试诱导口腔黏膜产生OLP病损,探讨Golli?MBP在OLP发病中的作用。方法:通过动物体内实验利用慢病毒载体系统包装诱导Golli?MBP过表达基因,将其注射于叙利亚金黄地鼠口腔黏膜下,肉眼观察黏膜改变,HE染色观察组织学改变,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测细胞增殖情况。结果:Golli?MBP未能诱导实验动物口腔黏膜产生肉眼可见的OLP病损变化,7天实验组上皮层细胞凋亡率与对照组无明显差异( P>0.05),14天实验组上皮层细胞凋亡率低于对照组(P<0.05)。7天及14天实验组上皮层细胞增殖率低于对照组(P<0.05)。结论:Golli?MBP 过表达能够抑制叙利亚金黄地鼠颊囊黏膜上皮细胞增殖和凋亡,但未能成功诱导其黏膜产生OLP病损。 相似文献
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目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应(PCR)调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。 相似文献
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16型人乳头状瘤病毒E6、E7诱导的人永生化口腔上皮细胞系的建立 总被引:8,自引:3,他引:8
目的:建立16型人乳头状瘤病毒(human papiloavirus,HPV16)E6,E7诱导的永生化口腔上皮细胞系,方法:正常口腔上皮细胞转染pLXSNHPV16E6,E7,G418筛选阳性细胞,连续培养建系;Western blot检测细胞HPV16E6,E7蛋白表达;生物学特性检测。集落实验;成瘤实验,结果:细胞连续培养达18个月余,命名为永生化口腔上皮细胞(human immortalized oral epithelial cell,HIOEC) ,HIOEC表达HPV16E6,E7蛋白,角蛋白阳性,透射电镜观察细胞有丰富的张力原纤维,细胞之间形成桥粒,克隆形成率0.77%,裸鼠未成瘤。结论:成功建立了HPV16E6,E7诱导的人永生化口腔上皮细胞系。 相似文献
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目的 通过腺病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的牙周膜细胞系,以构建腺病毒介导的高效、稳定的hTERT牙周膜细胞系。方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增hTERT基因编码序列,构建同源重组腺病毒质粒pAd-pshuttle-cmv-hTERT,收集腺病毒颗粒后感染人牙周膜细胞,实时荧光定量PCR检测hTERT及成骨相关基因碱性磷酸酶、核心结合因子2、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达水平,茜素红染色观察成骨分化能力,CCK-8检测细胞增殖能力。结果 成功构建了含hTERT基因的腺病毒颗粒并感染牙周膜细胞,感染细胞与正常牙周膜细胞形态相似;实时荧光定量PCR结果显示hTERT及成骨相关基因在感染细胞中高表达;茜素红染色显示牙周膜细胞系成骨能力强;CCK-8结果示牙周膜细胞系增殖能力强。结论 通过腺病毒法成功建立了过表达hTERT的人牙周膜细胞系,其具有较强的成骨分化能力,这为研究牙周膜再生机制提供了一个理想的细胞系。 相似文献
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槟榔碱对口腔角质形成细胞端粒酶逆转录酶表达的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:观察槟榔碱对人口腔角质形成细胞(KC)端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA及蛋白表达的影响,进一步探讨hTERT在口腔黏膜下纤维性变(OSF)癌变过程中的作用机制。方法:体外培养正常口腔黏膜的上皮细胞,将实验细胞分为0.03、0.06、0.09g/L槟榔碱组、空白对照组。采用Western印迹法和RT-PCR方法观察槟榔碱对KC hTERT mRNA及蛋白表达的影响。结果:槟榔碱能呈剂量依赖性增加KC hTERT mRNA及蛋白表达,0.03、0.06、0.09g/L槟榔碱组hTERT mRNA及蛋白表达均高于空白对照组(P〈0.05)。结论:槟榔碱对KChTERT mRNA与蛋白表达有明显诱导作用,且在一定范围内呈剂量依赖关系,槟榔碱诱导KChTERT过度表达可能在OSF癌变过程中起重要作用。 相似文献
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目的:探讨端粒酶逆转录酶(TERT)mRNA在口腔扁平苔藓(OLP)和口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达以及在OLP癌变过程中的作用。方法:应用mRNA原位杂交法对正常口腔黏膜12例,非糜烂型OLP20例,糜烂型OLP20例及OSCC20例,进行hTERTmRNA的检测。结果:正常口腔黏膜、非糜烂型OLP、糜烂型OLP及OSCC中hTERTmRNA阳性表达率分别为8.33%(1/12)、15%(3/20)、45%(9/20)、80%(16/20)。其中,除正常口腔黏膜与非糜烂型OLP中hTERT mRNA阳性率无显著性差异外,其余各组间均有显著性差异(P〈0.05)。而且,正常口腔黏膜与非糜烂型OLP的hTERT mRNA染色强度明显低于糜烂型OLP及OSCC(P〈0.05)。结论:hTERT mRNA可能在糜烂型OLP的癌变过程起着一定的作用。 相似文献
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目的观察中药苦参有效成分苦参碱对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的细胞周期及端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响。方法体外培养ACC-M细胞,用不同浓度的苦参碱对体外培养的ACC-M细胞进行干预,以流式细胞仪检测对照组和不同浓度(0.25、0.50、0.75、1.00 mg·mL-1)苦参碱作用不同时间后细胞周期的变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测苦参碱作用48 h后细胞hTERT mRNA的表达改变;流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达变化。结果苦参碱作用后明显抑制ACC-M细胞的增殖,使ACC-M细胞周期阻滞于G0/G1期,并与药物浓度和作用时间呈正相关;苦参碱作用后hTERT基因和蛋白表达明显下降。结论苦参碱对ACC-M细胞有明显细胞周期阻滞作用,同时显著下调hTERT基因表达。细胞周期阻滞作用可能与苦参碱下调hTERT基因表达有关。 相似文献
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目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点.方法:首先以EASYMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化1)H5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;最后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选最有效序列.应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析.结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源:PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组.hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜F可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白.hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹榆测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照B-aetin和GAPDH尤明显变化.经β-actin校正,得到各组hTERT蛋向相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%~76.84%.P<0.05),其中No.4敲减效能最高.结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5'-GCAAGTTGCAAAGCArrGGAA-3'敲减效能最优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶. 相似文献
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端粒酶在体外培养人表皮干细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:探讨人表皮干细胞在体外培养中的端粒酶活性。方法:体外培养人表皮干细胞,于第1、8、10代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析。结果:人表皮干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降。结论:人表皮干细胞在体外培养过程中,仍具有端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老。 相似文献