慢病毒载体感染人口腔黏膜成纤维细胞稳定表达绿色荧光蛋白的研究

目的：确立慢病毒载体高效感染人口腔黏膜成纤维细胞的感染条件,为进一步应用基因工程技术研究人口腔黏膜成纤维细胞奠定基础。方法：采用组织块法培养原代人口腔黏膜成纤维细胞,免疫组化SP法鉴定细胞类型,将携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体以不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）感染纯化细胞,并设置不同感染条件,感染4 d后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果：成功分离纯化得到人口腔黏膜成纤维细胞,当慢病毒感染复数为30,polybrene浓度为8μg/mL,并加入感染增强液时,可达到较高的感染效率,满足后续实验需要。结论：慢病毒载体可高效感染人口腔黏膜成纤维细胞,携带的绿色荧光蛋白基因可在成纤维细胞内稳定表达。     

c-myc与口腔肿瘤和人端粒酶逆转录酶的关系

原癌基因c-myc与多种肿瘤密切相关,最近发现c-myc是端粒酶的调节基因,且Mad和Sp1也参与了该调节。     

c-myc与口腔肿瘤和人端粒酶逆转录酶的关系

原癌基因c-myc与多种肿瘤密切相关，最近发现c-myc是端粒酶的调节基因，且Mad和Spl也参与了该调节。     

反转录病毒介导端粒酶基因对人口腔黏膜角化细胞寿命的影响

目的:以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因(hTRT)转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法:将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA 和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性。结果:获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8~9代。结论:转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因。     

端粒酶逆转录酶mRNA在口腔扁平苔藓中的表达

目的 探讨端粒酶逆转录酶(TERT)mRNA在口腔扁平苔藓(OLP)中的表达及临床意义。方法 采用原位杂交(ISH)的方法,检测了20例糜烂型扁平苔藓(erosive oral lichen planus,eOLP)、20例非糜烂型扁平苔藓(non-erosive oral lichen planus,neOLP)和12例正常口腔黏膜TERT mRNA的表达。结果 糜烂型OLP的TERT mRNA阳性率明显高于非糜烂型OLP的TERT mRNA阳性率(P<0.05)。糜烂型OLP与非糜烂型OLP染色强度相比有统计学意义(P<0.05)。结论 糜烂型OLP的上皮细胞可能比非糜烂型OLP的上皮细胞处于更高的增殖状态。     

慢病毒载体介导Golli-MBP基因过表达的体内实验初探

目的：通过过表达Golli?MBP基因尝试诱导口腔黏膜产生OLP病损,探讨Golli?MBP在OLP发病中的作用。方法：通过动物体内实验利用慢病毒载体系统包装诱导Golli?MBP过表达基因,将其注射于叙利亚金黄地鼠口腔黏膜下,肉眼观察黏膜改变,HE染色观察组织学改变,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测细胞增殖情况。结果：Golli?MBP未能诱导实验动物口腔黏膜产生肉眼可见的OLP病损变化,7天实验组上皮层细胞凋亡率与对照组无明显差异（ P＞0．05）,14天实验组上皮层细胞凋亡率低于对照组（P＜0．05）。7天及14天实验组上皮层细胞增殖率低于对照组（P＜0．05）。结论：Golli?MBP 过表达能够抑制叙利亚金黄地鼠颊囊黏膜上皮细胞增殖和凋亡,但未能成功诱导其黏膜产生OLP病损。     

microRNA-223过表达与抑制表达 慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应（PCR）调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。     

16型人乳头状瘤病毒E6、E7诱导的人永生化口腔上皮细胞系的建立

目的：建立16型人乳头状瘤病毒（human papiloavirus,HPV16)E6,E7诱导的永生化口腔上皮细胞系，方法：正常口腔上皮细胞转染pLXSNHPV16E6,E7,G418筛选阳性细胞，连续培养建系；Western blot检测细胞HPV16E6，E7蛋白表达；生物学特性检测。集落实验；成瘤实验，结果：细胞连续培养达18个月余，命名为永生化口腔上皮细胞（human immortalized oral epithelial cell,HIOEC) ,HIOEC表达HPV16E6，E7蛋白，角蛋白阳性，透射电镜观察细胞有丰富的张力原纤维，细胞之间形成桥粒，克隆形成率0．77％，裸鼠未成瘤。结论：成功建立了HPV16E6，E7诱导的人永生化口腔上皮细胞系。     

腺病毒介导的人端粒酶反转录酶牙周膜细胞系的建立

目的 通过腺病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶（hTERT）基因的牙周膜细胞系,以构建腺病毒介导的高效、稳定的hTERT牙周膜细胞系。方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增hTERT基因编码序列,构建同源重组腺病毒质粒pAd-pshuttle-cmv-hTERT,收集腺病毒颗粒后感染人牙周膜细胞,实时荧光定量PCR检测hTERT及成骨相关基因碱性磷酸酶、核心结合因子2、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达水平,茜素红染色观察成骨分化能力,CCK-8检测细胞增殖能力。结果 成功构建了含hTERT基因的腺病毒颗粒并感染牙周膜细胞,感染细胞与正常牙周膜细胞形态相似;实时荧光定量PCR结果显示hTERT及成骨相关基因在感染细胞中高表达;茜素红染色显示牙周膜细胞系成骨能力强;CCK-8结果示牙周膜细胞系增殖能力强。结论 通过腺病毒法成功建立了过表达hTERT的人牙周膜细胞系,其具有较强的成骨分化能力,这为研究牙周膜再生机制提供了一个理想的细胞系。     

槟榔碱对口腔角质形成细胞端粒酶逆转录酶表达的影响

目的：观察槟榔碱对人口腔角质形成细胞（KC）端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA及蛋白表达的影响，进一步探讨hTERT在口腔黏膜下纤维性变（OSF）癌变过程中的作用机制。方法：体外培养正常口腔黏膜的上皮细胞，将实验细胞分为0．03、0．06、0．09g／L槟榔碱组、空白对照组。采用Western印迹法和RT-PCR方法观察槟榔碱对KC hTERT mRNA及蛋白表达的影响。结果：槟榔碱能呈剂量依赖性增加KC hTERT mRNA及蛋白表达，0．03、0．06、0．09g／L槟榔碱组hTERT mRNA及蛋白表达均高于空白对照组（P〈0．05）。结论：槟榔碱对KChTERT mRNA与蛋白表达有明显诱导作用，且在一定范围内呈剂量依赖关系，槟榔碱诱导KChTERT过度表达可能在OSF癌变过程中起重要作用。     

端粒酶逆转录酶mRNA在OLP和OSCC中的表达

目的：探讨端粒酶逆转录酶（TERT）mRNA在口腔扁平苔藓（OLP）和口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达以及在OLP癌变过程中的作用。方法：应用mRNA原位杂交法对正常口腔黏膜12例,非糜烂型OLP20例,糜烂型OLP20例及OSCC20例,进行hTERTmRNA的检测。结果：正常口腔黏膜、非糜烂型OLP、糜烂型OLP及OSCC中hTERTmRNA阳性表达率分别为8.33％（1／12）、15％（3／20）、45％（9／20）、80％（16／20）。其中,除正常口腔黏膜与非糜烂型OLP中hTERT mRNA阳性率无显著性差异外,其余各组间均有显著性差异（P〈0.05）。而且,正常口腔黏膜与非糜烂型OLP的hTERT mRNA染色强度明显低于糜烂型OLP及OSCC（P〈0.05）。结论：hTERT mRNA可能在糜烂型OLP的癌变过程起着一定的作用。     

苦参碱对腺样囊性癌细胞周期阻滞和端粒酶催化亚基表达的影响

目的观察中药苦参有效成分苦参碱对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的细胞周期及端粒酶催化亚基（hTERT）表达的影响。方法体外培养ACC-M细胞,用不同浓度的苦参碱对体外培养的ACC-M细胞进行干预,以流式细胞仪检测对照组和不同浓度（0.25、0.50、0.75、1.00 mg·mL-1）苦参碱作用不同时间后细胞周期的变化;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测苦参碱作用48 h后细胞hTERT mRNA的表达改变;流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达变化。结果苦参碱作用后明显抑制ACC-M细胞的增殖,使ACC-M细胞周期阻滞于G0/G1期,并与药物浓度和作用时间呈正相关;苦参碱作用后hTERT基因和蛋白表达明显下降。结论苦参碱对ACC-M细胞有明显细胞周期阻滞作用,同时显著下调hTERT基因表达。细胞周期阻滞作用可能与苦参碱下调hTERT基因表达有关。     

靶向人端粒酶反转录酶RNA干扰载体质粒的构建与筛选

目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点.方法:首先以EASYMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化1)H5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;最后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选最有效序列.应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析.结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源:PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组.hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜F可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白.hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹榆测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照B-aetin和GAPDH尤明显变化.经β-actin校正,得到各组hTERT蛋向相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%～76.84%.P＜0.05),其中No.4敲减效能最高.结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5'-GCAAGTTGCAAAGCArrGGAA-3'敲减效能最优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶.     

端粒酶在体外培养人表皮干细胞中的表达

目的:探讨人表皮干细胞在体外培养中的端粒酶活性。方法:体外培养人表皮干细胞,于第1、8、10代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析。结果:人表皮干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降。结论:人表皮干细胞在体外培养过程中,仍具有端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老。