细胞骨架蛋白肌球蛋白轻链与癌蛋白TRE17相互作用的鉴定

目的:探讨MLC2与TRE17之间的相互作用。方法:构建了MLC2原核表达质粒,在用pGEX蛋白表达系统表达和纯化GST-MLC2和GST蛋白后,用GST Pulldwon方法进一步观察MLC2与TRE17之间的相互作用。结果:限制性内切酶分析和DNA序列测定表明MLC2 cDNA完整ORF以正确的阅读框架插入pGEX-6P-1载体;IPTG诱导表达的GST-MLC2和GST蛋白纯度在90%以上;GST Pulldown分析表明癌蛋白TRE17(447)结合GST-MLC2融合蛋白,而不是对照GST蛋白。结论:MLC2是TRE17的特异性结合蛋白。     

人GST-OPGL融合蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆人骨保护素配体(OPGL)编码区基因,构建融合表达载体,在大肠杆菌中表达,并制备抗体。方法:采用RT-PCR法得到人骨保护素配体(OPGL)编码区cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-3,转化大肠杆菌感受态细胞JM 109,0.1mMβ-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,行SDS-PAGE电泳。将此融合蛋白免疫新西兰兔,W estern b lot鉴定。结果:获得人骨保护素配体编码区cDNA,构建原核表达载体pGEX-OPGL,转化菌株可表达人GST-OPGL蛋白,蛋白分子量约为43KD,蛋白表达量约为菌体总蛋白的21%。W estern b lot检测表明获得了免疫活性强的兔抗人的多克隆抗体。结论:获得人骨保护素配体编码区cDNA,在大肠杆菌中表达了人GST-OPGL融合蛋白,并获得了高效多抗。     

组蛋白脱乙酰化酶4N-末端和C-末端片段的原核表达及纯化

目的 在大肠杆菌中分别表达组蛋白脱乙酰化酶4(HDAC4)N-末端(1-1950bp)和C-末端(1708-3255 bp)片段与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并进行纯化.方法 应用PCR方法扩增HDAC4 N-末端和C-末端片段,将目的基因插入GST融合载体pGEX-6P-1中,重组载体在酶切鉴定和序列测定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达GST-HDAC4-N'和GST-HDAC4-C'蛋白.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达产物后,用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化目的蛋白.结果 经测序、酶切鉴定证明成功构建了融合蛋白表达质粒,表达出的融合蛋白经SDS-PAGE分析其相对分子量约为110500和93080.Western blotting分析证实融合蛋白可以被HDAC4特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-6P-1/HDAC4-N'和pGEX-6P-1/HDAC4-C'),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可以进一步用于HDAC4与其他蛋白质相瓦作用的研究.     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

人肌球蛋白调节性轻链的原核表达及纯化

目的:构建pGEX-MLC2重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化谷胱甘肽硫转移酶(GST)-MLC2融合蛋白,以用于MLC2抗体的制备。方法:从人乳腺癌MCF-7细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得人MLC2cDNA全长开放读码框架(open reading frame,ORF),并将其重组于原核蛋白表达质粒pGEX-6P-1中,经限制性内切酶和DNA测序鉴定,将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC2融合蛋白后,进行Western blotting分析,鉴定GST-MLC2蛋白;通过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳鉴定该融合蛋白的纯度。结果:人乳腺癌MCF-7细胞MLC2的RT-PCR产物为535 bp,符合预期;重组质粒pGEX-MLC2经BamHI和EcoRI双酶切出现特征性的525 bp片段;DNA测序证实MLC2全长ORF序列正确无误。IPTG诱导表达的GST-MLC2融合蛋白分子质量约为46.6 kDa,纯化后其蛋白纯度约95%,经Western blotting分析表明诱导表达的蛋白是GST-MLC2融合蛋白。结论:人MLC2蛋白原核表达质粒的构建、GST-MLC2融合蛋白的表达和纯化,为MLC2抗体的制备及MLC2功能的深入研究奠定了基础。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的: 构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1. 方法: 应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析. 结果: 成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1, 表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力. 结论: 成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

乳糖酶在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的克隆并分析乳酸菌LacZ基因,构建其原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,并纯化得到纯度较高的目的蛋白。方法采用PCR方法从乳酸菌中扩增出LacZ基因,测序和序列分析。将其克隆至克隆载体pGM-Tvector中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定,最后通过纯化得到单一的目的蛋白。结果 PCR扩增获得3024bp的LacZ基因,测序得知序列与GeneBank报道的序列一致,序列分析表明,该序列开放读码框有3024bp,推测肽链具有1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4.9。构建了重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ,IPTG诱导其高效表达出融合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定出所表达蛋白的分子量为140KD,与融合蛋白的分子量一致。最后利用Glutathione Sepharose 4B对表达产物进行纯化,得到单一的目的蛋白。结论成功地构建了乳酸菌LacZ基因的原核表达质粒,通过序列分析并诱导表达,最后纯化得到单一的目的蛋白,为进一步生产低乳糖奶奠定基础。     

活性SET7/9融合蛋白的表达与纯化

目的:表达与纯化活性GST-SET7/9融合蛋白(SET7/9融合蛋白).方法:以含人SET7/9基因结构域全长cDNA的pCMV-SET7/9质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增获得目的基因片段,将测序正确的目的基因片段经EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,插入载体pGEX-6P-3中,构得质粒经转染和异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,纯化后采用组蛋白甲基化转移酶(HMT)测定法鉴定蛋白活性.结果:构成pGEX-SET7/9重组质粒,表达分子质量约为77 kD的融合蛋白,纯化后测得CPM值明显高于对照组.结论:pGEX-SET7/9可表达高活性的SET7/9融合蛋白.     

重组大鼠TSHα亚基在大肠杆菌中表达的实验研究

目的：通过构建重组大鼠TSHα链原核表达系统及表达产物的纯化工作,获得重组GST-—rrTSHα融合蛋白,以备作为免疫原制备抗大鼠TSHα链的抗体。方法：提取大鼠垂体组织总RNA,RT—PCR扩增大鼠TSHa链编码序列,构建pGEX-3X／TSHα融合表达质粒转化人大肠杆菌中进行诱导表达。亲和层析纯化重组蛋白并以SDS—PAGE及Western Blot进行鉴定。结果：DNA序列分析表明重组pGEX-3X／TSHα质粒含有读码框正确的髑H仅链编码序列,纯化产物的SDS—PAGE及Western Blot结果表明所获得的目的蛋白与预期分子量相符且可与抗GST抗体发生免疫识别。结论：成功获得重组GST—rrTSHα融合蛋白,为下一步的抗体制备奠定了基础。     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

高GC hTwist表达载体构建及其表达条件优化

 目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法 以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx 加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实：我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定了基础。     

肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90％以上。     

大鼠锌指蛋白ZFP580的原核表达与分离纯化

【目的】构建ZFP580基因的原核表达质粒,转化大肠杆菌,诱导表达并分离纯化大鼠锌指蛋白ZFP580。【方法】根据ZFP580 cDNA序列的开放阅读框设计引物,利用PCR技术扩增ZFP580的开放阅读框cDNA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,Nco I、Xho I双酶切电泳筛选、鉴定并测序。将构建的重组质粒pET30a-ZFP580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。【结果】成功扩增ZFP580基因并构建了表达质粒pET30a-ZFP580,测序结果表明与GeneBank公布的序列一致。含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa。【结论】成功表达并纯化了大鼠ZFP580蛋白,为进一步研究锌指蛋白ZFP580的功能奠定了基础。     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因,并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接成全长cDNA,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上,经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后,选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA,其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD,且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

小鼠DNAJB13与HK1 的相互作用

目的探讨小鼠DNAJB13与HK1是否具有相互作用。方法应用双酶切连接方法构建pGEX-4T-1/Dnajb13原核表达载 体,测序验证;重组质粒转化感受态细胞DH5α,用IPTG诱导融合蛋白GST-DNAJB13表达,采用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和 Western blotting分析蛋白和鉴定;提取小鼠睾丸蛋白,采用GST pull down检测DNAJB13与HK1是否具有相互作用。结果成 功构建pGEX-4T-1-Dnajb13重组质粒,测序结果与标准序列一致;转化重组质粒的大肠杆菌在37 ℃,IPTG浓度1 mmol/L诱导 下高效表达融合蛋白;GST pull down检测结果阳性,显示DNAJB13与HK1存在相互作用。结论在小鼠睾丸中,DNAJB13与 HK1存在相互作用,可能参与精子形成和精子运动。