去细胞神经支架联合VEGF修复周围神经缺损的实验研究

目的观察去细胞神经支架联合血管内皮生长因子（VEGF）在促进周围神经损伤修复中的作用。方法购买雄性Wistar大鼠60只,先取15只成年Wistar大鼠作为神经供体,制备去细胞神经支架,将制备好的神经支架剪取长度约为1 cm的去细胞神经基膜管。根据实验要求,将余Wistar大鼠随机分为三组,每组大鼠均15只。实验组（A组）为去细胞神经支架移植＋局部注射VEGF组;对照组Ⅰ（B组）为去细胞神经支架移植组;对照组Ⅱ（C组）为自体神经移植组。术后喂养1个月,并每日观察大鼠步态、患足溃疡恢复情况。术后1个月取移植段坐骨神经组织行HE染色、免疫组化染色观察再生神经S-100及轴突数量,髓鞘、神经纤维数等生长情况。结果术后1个月,三组大鼠的足部溃疡、步态均有不同程度的恢复,其中实验组恢复率接近于自体神经移植组,明显优于单纯去细胞神经支架移植组;A组的再生神经轴突数为（125.34±5.67）,B组再生神经轴突数为（62.32±3.71）,C组再生神经轴突数为（132.55±7.48）,A组与C组比较差异无统计学意义（P〉0.05）,A组与B组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论去细胞神经支架联合VEGF在促进周围神经损伤修复过程中可能具有一定的作用。     

大鼠去细胞神经支架制备方法的改良

目的:探讨去除大鼠周围神经中的细胞和髓鞘以取得去细胞神经支架的方法.方法:取15只SD大鼠的坐骨神经30条,随机分为3组(每组10条).分别为正常神经组(A组),TritonX-200处理的化学去细胞组(B组),TritonX-200联合sulfobetaine-16(SB-16)、sulfobetaine-10(SB-10)去细胞组(C组).在光镜和电镜下观察各组神经组织的组织学结构.采用免疫组织化学SP法检测各组神经组织中S-100蛋白和层黏连蛋白(Laminin)的表达.结果:制备出的去细胞神经呈淡乳白色圆柱状外观.略透亮,其延展性较化学处理前略增加.B、C组神经经去细胞处理后,均去除了Schwann细胞、神经髓鞘和轴突,C组更好地保存了由Schwann细胞基底膜管以及外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构.结论:TritonX-200联合SB-16、SB-10改良化学方法处理可获得达到要求的去细胞神经支架.     

大鼠脂肪干细胞与不同去细胞神经支架的体外相容性比较

目的:观察大鼠脂肪干细胞与2种不同去细胞神经支架的体外相容性,为周围神经组织工程寻求合适的种子细胞载体.方法:将大鼠脂肪干细胞与传统去细胞神经支架和改良法去细胞神经支架体外复合培养,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在2种支架上的生长、黏附情况,测定细胞活性及细胞吸附率,并与空白对照组比较.结果:脂肪干细胞可在2种去细胞神经支架上生长、黏附,在改良法去细胞神经支架上的细胞吸附率优于传统去细胞神经支架.结论:脂肪干细胞与2种去细胞神经支架均有较好的体外组织相容性,改良法去细胞神经支架可作为更有效的周围神经组织工程细胞载体.     

去细胞异种神经支架对大鼠足底创面触觉功能重建的影响及机制研究

目的:探究去细胞异种神经支架对大鼠足底创面触觉功能重建的影响及机制。方法:将大鼠足底创面模型(n=48)随机平分为模型组、干细胞组、神经支架组三组。模型组不进行治疗,干细胞组将肌源性干细胞(浓度为10~7个/ml)细胞悬液注射到创伤部位,神经支架组在干细胞组治疗的基础上以注射植入后的细胞异种神经支架进行桥接。结果:干细胞组、神经支架组治疗第7天与第14天的机械痛阈高于模型组(均P<0.05),神经支架组高于干细胞组(P<0.05)。干细胞组、神经支架组治疗第7天与第14天的足底神经指数与运动神经传导速度高于模型组(均P<0.05),神经支架组高于干细胞组(P<0.05)。干细胞组、神经支架组治疗第14天与第21天的有髓神经纤维数量高于模型组(均P<0.05),神经支架组高于干细胞组(P<0.05)。干细胞组、神经支架组治疗第14天与第21天的细胞角蛋白-20(CK-20)与代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)蛋白相对表达水平低于模型组(均P<0.05),神经支架组低于干细胞组(P<0.05)。结论:去细胞异种神经支架在大鼠足底创面的应用能抑...     

化学萃取的异种神经修复神经缺损的可行性研究

目的 探讨联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法,对异种神经移植段进行脱细胞处理,构建异种神经去细胞基质膜管,应用于修复周围神经缺损的可行性.方法 取新鲜兔坐骨神经,切成长10mm的神经段,用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)反复处理新鲜的兔神经段构建成异种神经去细胞基质膜管,修复大鼠坐骨神经缺损.结果 4个月后异种神经基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好,未见有神经瘤及粘连,HE染色显示异种神经基质膜管组桥接处再生神经结构连续性良好,移植段可见神经纤维及新生的血管.S-100免疫组织化学染色可见阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状.电镜超微结构观察可见再生的神经纤维较粗大,排列紧密,呈均匀一致圆型或椭圆型,髓鞘较厚,轴突结构完整.结论 联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法构建的异种神经去细胞基质膜管可以修复大鼠坐骨神经缺损.     

化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果

目的:改良去细胞异体神经的制备方法,研制出一种理想的自体神经移植替代物. 方法:将用Sondell法(Triton X-100、脱氧胆酸钠)和改良法[Triton X-200,sulfobetaine-10(SB-10),sulfobetaine-16(SB-16)]两种方法制备的去细胞异体神经用HE染色、髓鞘染色、免疫组化染色、扫描电镜检查等进行组织学评价. 然后将制备的神经桥接大鼠坐骨神经缺损,从坐骨神经指数、神经电生理、运动终板染色等方面评价神经移植后的再生效果. 结果:改良法制备的神经细胞及髓鞘去除彻底、结构保存完好;移植后神经再生良好,优于Sondell法制备的神经,达到了与自体神经移植相当的再生效果. 结论:综合运用萃取剂Triton X-200,SB-10和SB-16的改良化学萃取方法是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法,其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植.     

冻干去细胞异种神经和类许旺细胞共移植修复外周神经缺损的实验研究

目的 研究冻干化学去细胞异种神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 48只成年雌性DA大鼠分别用4种移植物桥接大鼠1.5cm坐骨神经缺损:冻干化学去细胞异种神经与类许旺细胞共移植组、冻干化学去细胞异种神经移植组、化学去细胞异种神经移植组、异种神经移植组.术后4周、24周通过大体观察、神经电生理、肌肉湿重及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果.结果 术后24周A组运动神经传导速度和肌肉湿重恢复率优于B、C、D组(P＜0.05);组织学检测发现,术后24周A组移植段再生神经纤维较多,以有髓神经纤维为主.结论 种植类许旺细胞的冻干化学去细胞异种神经能有效的修复大鼠周围神经缺损.     

改良萃取法制备脱细胞神经支架的去髓鞘效果评价

【目的】评价改良化学方法制备脱细胞神经支架的去髓鞘与脱细胞效果。【方法】12只成年SD大鼠(230～280g),取双侧坐骨神经,随机分为3组,每组8例,分别采用不同的处理方法。正常对照组:不作任何处理;Hudson组:采用Triton X-200、磺基三甲铵乙内酯-10(SB-10)、磺基三甲铵乙内酯-16(SB-16)处理;改良组:采用Triton X-200、SB-10、SB-16联合脱氧胆酸钠(SDC)及过氧乙酸(PAA)处理。处理后行HE染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜检查,观察脱细胞、去髓鞘程度及基底膜保存情况。【结果】形态学检查显示,与对照组相比,Hudson组中的细胞核结构完全消失,甲苯胺蓝染色为散在同心圆状的髓鞘结构,透射电镜下显示髓鞘板层成分保留,但有崩解断裂,轴突依然存在;改良组细胞核完全去除,与Hudson组不同的是,甲苯胺蓝染色显示为不规则多孔状结构,髓鞘成分消失,透射电镜下显示髓鞘及轴突成分彻底去除,基底膜管壁结构清晰并完整保留。【结论】改良萃取法制备脱细胞神经支架能够有效地去除细胞和髓鞘成分,同时基底膜管结构保留完整。     

机械振荡对脊髓去细胞支架形态学的影响

目的 探讨机械振荡对脊髓去细胞支架形态学的影响,建立大鼠脊髓去细胞支架的化学萃取方法,为脊髓损伤修复提供具有仿生结构的支架.方法 取成年大鼠脊髓15段.分成A组、B组和C组,每组5段,用TritonX-100和脱氧胆酸钠溶液进行化学处理.3组振荡频率分别为80、120和160 r/min.对萃取后的脊髓行石蜡切片、HE染色和扫描电镜观察,比较脊髓萃取后细胞清除情况和脊髓基质形态学变化.结果 A组去细胞脊髓内残留大量脱核神经细胞胞体及髓鞘结构.B组和C组脊髓萃取后细胞、轴突和髓鞘被彻底清除.去细胞脊髓为一种无细胞、网格样纵行排列的基质纤维网状结构,但是C组硬脊膜和脊髓内基质纤维结构出现明显破坏.结论 机械振荡有利于清除脊髓内细胞、轴突和髓鞘.合适的机械振荡频率在去细胞的同时.还能较好地保存脊髓内天然的基质纤维和置维空间结构.为构建组织工程化脊髓提供理想的支架材料.     

BDNF在脱细胞同种异体神经移植物修复神经缺损后不同组织中的表达

目的探讨脱细胞同种异体神经移植物(ANA)修复大鼠坐骨神经缺损后促神经再生的分子作用机制。方法将36只Wistar大鼠随机分成6组:正常对照组,自体移植组,桥接2,4,8,12周组,每组6只,分别观测患侧L4脊髓及胫前肌内脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白及mRNA表达。结果ANA桥接大鼠坐骨神经缺损后2周患侧脊髓内BDNF表达增高,4周时达高峰,持续到8周,然后逐渐降低,12周时仍显著高于正常对照组,与自体移植组相比无差异。而患侧胫前肌最初4周内逐渐降低,然后逐渐升高,12周时达到正常水平,与自体移植组相比无差异。BDNF mRNA的表达基本与蛋白表达一致。结论ANA具有良好的组织相容性,也许可替代自体神经修复大鼠坐骨神经长距离缺损,此作用可能与上调脊髓BDNF蛋白及mRNA表达有关。     

天然脱细胞神经支架复合骨髓间充质细胞修复坐骨神经缺损

目的观察脱细胞神经支架复合骨髓间充质细胞、构建组织工程化人工神经,修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法贴壁法体外分离、纯化、增殖骨髓间充质细胞,取第5代细胞与脱细胞异体神经复合培养,构建移植物。SD大鼠18只,随机分为实验组,支架组,对照组。术后12周,采用坐骨神经功能指数测定、腓肠肌湿质量恢复率检测及组织学等方法评价神经缺损的修复效果。结果坐骨神经功能指数及腓肠肌湿质量恢复率的检测显示实验组优于支架组(P<0.05);组织学检查,实验组修复神经S-100蛋白表达明显强于支架组,足底皮肤单位面积内触觉小体明显多于支架组,实验组缝合神经有效神经截面积、纤维数目、纤维密度、纤维直径、髓鞘厚度均优于支架组(P<0.05),其坐骨神经缺损修复效果接近对照组。结论脱细胞神经支架复合骨髓间充质细胞可有效修复坐骨神经缺损,经脱细胞神经支架溶液诱导的骨髓间充质细胞在体内具有施万细胞的功能。     

VEGF在小剂量超短波促进种植骨髓间充质干细胞脱细胞支架修复大鼠坐骨神经损伤中的表达

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)在小剂量超短波对种植骨髓间充质干细胞(BMSC)脱细胞支架修复大鼠坐骨神经损伤中的表达.方法 将培养至第3代的大鼠BMSC注入已制备的脱细胞支架内,然后置于培养箱内联合培养3 d,无茵条件下缝合到神经缺损处.实验鼠分为3组,即达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)组、支架内注射BMSC组和注射BMSC后应用超短波(USW)治疗组;超短波治疗组在术后2 d用小剂量超短波对移植动物的神经缺损处治疗;移植后第2,4,8和12周检测再生的神经中VEGF、S-100蛋白表达.结果 各组VEGF在损伤后再生即有表达,并随时间延长呈上升趋势,在第4周达到顶峰,超短波治疗组表达高于其他组(P<0.05).结论 VEGF在超短波治疗早期的高水平表达可加速种植的BMSC分化或迁移的速度,并能促使再生神经周围的血供增加.     

化学萃取同种异体神经修复鼠坐骨神经缺损

目的 :通过化学萃取同种异体神经 ,去除髓鞘和雪旺细胞 ,形成无细胞基膜管后桥接鼠坐骨神经缺损 ,研究神经再生效果。方法 :正常鼠坐骨神经用非变性生物剂处理后得到无细胞的基膜管 ,桥接鼠坐骨神经 2 0mm缺损。实验分 3组 :无细胞基膜管移植组 (A组 )、自体神经移植组 (B组 )和异体神经移植组 (C组 )。术后进行肌电图、组织形态学及图像分析仪检查。结果 :A组再生神经有大量轴突通过移植体 ,术后 2个月电生理检测再生神经的潜伏期及波幅低于B组 (P <0 .0 5 ) ,3个月时差异无显著性。髓鞘厚度在术后 3个月时亦低于B组 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。轴突直径及数目两组无差异。结论 :这种无细胞基膜管移植体能支持轴突的生长和雪旺细胞的迁移 ,是一种良好的神经移植替代材料。     

兔无细胞真皮基质的研制

目的：探讨制备兔无细胞真皮基质（ADM）的最佳方法。方法：选用三种不同的去表皮处理液，即高渗NaCl溶液，dispaseⅡ分离酶和嗜热蛋白酶（thermolysin)，结合去污剂0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）处理，分别制备兔ADM，并对其进行组织学检测。结果：高渗NaCl-SDS制备的兔ADM尚有少量表皮残留，乳白色中夹杂浅黄色，组织学观察可见真皮中有较多细胞碎屑，而经dispaseⅡ-SDS和thernolysin-SDS制备的兔ADM表皮完全去除，呈乳白色，组织学观察发现真皮中已不见任何细胞成分，胶原纤维排列规则。电镜观察，上述三种方法制备的兔ADM基底膜结构均完整。结论 由dispaseⅡ-SDS法和thermolysin-SDS法制备的兔ADM达到了完全去细胞化，符合制备要求。     

新型脱细胞脑组织修复支架的制备及其细胞相容性

 【目的】研制天然脱细胞脑组织修复支架,并对其形态结构、主要成分和细胞相容性进行分析,为研制出理想的脑损伤修复支架提供初步的实验依据。【方法】取成年Sprague-Dawley （SD）大鼠脑皮质,运用冻融、Triton X-100、脱氧胆酸钠、DNA/RNA酶等进行脱细胞处理并予京尼平（Genipin,GP）交联,对处理后的支架材料进行形态结构观察、主要成分分析和细胞相容性观察。【结果】经脱细胞处理后,脑组织细胞成分已去除,形态上具有高度仿生的三维立体空间网状结构。经GP交联后脱细胞支架空间网状结构变得更为明显,无菌保留3个月未见明显降解。平均孔径（14.9±2.5）μm,孔隙率达（90.4±2.2）％。脱细胞支架细胞外基质成分层粘连蛋白(Laminin,LN)强阳性表达、纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）和Ⅳ型胶原（Collagen Ⅳ,Col Ⅳ）弱阳性表达。神经干细胞与脱细胞支架共培养,HE可见细胞外基质支架间大量细胞粘附; SEM下可见大量神经干细胞粘附在支架材料表面,部分细胞表面有突起。【结论】初步研制的脱细胞脑组织支架呈立体空间网状结构,部分保留了细胞外基质成分,并具有良好的细胞相容性。     

环孢素A对异种脱细胞神经移植的影响

目的 研究脱细胞异种面神经移植中环孢素A(cyclosporin A,CSA)的作用效果.方法 48只W istar 大鼠随机选择一侧作为实验侧,解剖面神经后于颊支制造lcm的神经缺损.按神经移植的种类分为4组,A组:异种面神经移植组;B组:异种面神经移植应用CSA免疫抑制组;C组:异种脱细胞神经移植组;D组:异种脱细胞神经移植应用CSA免疫抑制组.各组实验动物分别于术后5周,12周进行电生理学测试(潜伏期、运动神经传导速度),并进行光镜、电镜观察形态学变化.结果 术后5周和12周时,C,D组动物在电生理指标及光镜、电镜指标上均优于A,B组,术后5周和12周,D组面神经颊支传导速度均高于其它各组.结论 1.0 cm缺损的异种脱细胞面神经移植动物实验中,应用CSA5mg/(hg·d)5周可以降低排斥反应,提高神经再生能力.     

脱细胞同种异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损的形态学观察

目的:研究脱细胞处理的同种异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损后,再生神经的形态学变化.方法:光镜、电镜观察移植物内再生神经的超微结构变化,免疫组织化学技术观察再生神经中S-100蛋白表达,并对再生神经的纤维数量、髓鞘厚度等进行统计学分析.结果:实验组和自体神经移植对照组的移植段内见有由束膜和外膜包被的大量再生神经纤维,两组比较再生神经的纤维数量、髓鞘厚度、有髓纤维占有的面积均无显著性差异;两组移植段神经中的S-100阳性施万细胞数、形态和排列等方面也无明显差异.结论:脱细胞同种异体神经同自体神经一样,对缺损的坐骨神经再生具有促进作用.