多重PCR检测婴幼儿腹泻样本中常见病毒

目的初步了解深圳地区引起临床婴幼儿急性腹泻中常见病毒的病原分布情况,为临床防治提供依据。方法采用多重RT-PCR方法检测婴幼儿急性腹泻常见病毒:轮状病毒(RV)、星状病毒(AstV)、诺如病毒(NV),采用单重PCR法筛查临床腹泻标本肠道腺病毒(EAdV)。结果在440份标本中,共检出197例至少感染一种腹泻病毒,总阳性率为44.77%(197/440),其中183例为一种病毒感染,14例(3.18%)为混合感染。4种腹泻病毒以RV感染为主,阳性率为28.64%(126/440);其次是EAdV,阳性率为8.86%(39/440);NV阳性率为5.45%(24/440);AstV阳性率为1.82%(8/440)。混合感染以RV合并其他病毒感染为主,占92.86%。结论 RV、EAdV和NV是引起深圳地区婴幼儿急性腹泻的主要病毒致病原,混合感染以RV联合其他病毒感染为主,临床上应根据所感染病原体制定有针对性的诊治措施。     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用

目的：建立能同时检测病毒性腹泻病人粪便中星状病毒(Astrovirus)、A族轮状病毒(Group A Rotavirus)、肠道腺病毒(Enteric Adenovirus)、诺如病毒 GI/GII(Norovirus GI/GII)的多重荧光RT-PCR方法。方法：根据各病毒基因组保守性序列设计引物和探针,建立多重荧光RT-PCR检测方法。对建立的多重荧光RT-PCR方法进行特异性、敏感性、灵敏性实验,并使用该法对256份病毒性腹泻粪便标本进行检测,同时使用基因测序进行验证。结果：成功建立常见腹泻病毒的多重荧光RT-PCR检测方法,对星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒以外的病原体不发生扩增反应。该法检测星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒的灵敏度可达500copies/ml。256份标本中：星状病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒阳性率分别为3.13%( 8/256),42.97%(110/256),9.38%( 24/256),10.16%(26/256),与基因测序方法检测结果符合率达到100%。结论：该多重荧光RT-PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的的优点,可用于临床病原诊断。     

婴幼儿腹泻的病毒学检测分析

目的:了解婴幼儿秋冬季腹泻中轮状病毒、星状病毒及肠道腺病毒的感染情况.方法:对2006年10月至2007年3月的182例急性水样腹泻婴幼儿的粪便标本,采用金标快速试剂盒检测轮状病毒抗原;采用酶免疫吸附测定法(EIA)检测星状病毒抗原及肠道腺病毒抗原.结果:182例标本中轮状病毒检出率35.2%(64/182);星状病毒检出率5.5%(10/182),4例合并轮状病毒感染:肠道腺病毒检出率3.3%(6/182),2例合并轮状病毒感染.结论:轮状病毒仍是婴幼儿秋冬季腹泻最主要致病原;星状病毒感染是婴幼儿病毒性腹泻的第二位病因;有混合性病毒感染发生.     

吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒腹泻的分子流行病学研究

目的:研究吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒(HAstV)腹泻流行情况和分子特征。方法:对吉林地区417份和兰州地区290份腹泻标本采用one-step PCR方法检测HAstV,用HAstV基因组ORF1b区部分核苷酸片段初筛,再用ORF2区部分核苷酸序列分型。结果:707份腹泻标本中共检出HAstV阳性17例,总阳性率为2.4%,其中吉林地区和兰州地区分别检出7例和10例。12份HAstV ORF2区阳性的样本均为HAstV 1型,除1株属于Lineage 1a群,其他均属于Lineage 1b群。HAstV主要感染2岁以下婴幼儿,在吉林春季为主要流行季节,而在兰州春季和秋季为主要流行季节。结论:HAstV是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原之一,HAstV 1型是主要的流行株,2岁以下为感染发病的高危人群,不同地区HAstV流行季节不同。     

基于同源加尾系统的4种腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法

目的针对轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒四种常见腹泻病毒,建立基于同源加尾(Homo-Tag AssistedNon-Dimer,HAND)系统的一步法四重RT-PCR检测方法。方法根据4种病毒基因组保守序列设计引物并在5’端加上同源尾巴序列。通过优化通用尾巴引物和特异性加尾引物的浓度等PCR参数构建四重RT-PCR反应体系,并系统评价其稳定性、特异性和灵敏度。结果成功建立基于HAND系统的4种腹泻病毒一步法多重RT-PCR检测方法。特异性分析显示四种病毒间无交叉反应,灵敏度分析显示轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒的检测下限分别达到48、9.6、1.92和48 pg。结论所建立的基于HAND系统的4种腹泻病毒多重RT-PCR检测方法简便快速、灵敏特异稳定、成本低廉,非常适用于基层医学实验室。     

婴幼儿腹泻轮状病毒检测及结果分析

目的：探讨婴幼儿腹泻轮状病毒的感染情况及其发病规律,为临床治疗提供依据。方法选取于2013年1—12月入该院就诊的腹泻婴幼儿2507例,收集其粪便标本采用乳胶法进行轮状病毒检测并对结果进行统计学分析。结果2507例送检标本中有393例轮状病毒抗原阳性,阳性率为15.68%。1～2岁婴幼儿轮状病毒检测阳性率为20.11%,6月龄～1岁婴幼儿检测阳性率为17.68%,均显著高于其他年龄段（P＜0.05）。其中1月收治腹泻婴幼儿178例,阳性45例,占25.28%;10月收治腹泻婴幼儿243例,阳性43例,占17.70%;11月收治腹泻婴幼儿224例,阳性77例,占34.38%;12月收治腹泻婴幼儿224例,阳性79例,占35.27%。其中11、12月阳性率明显高于其他月份（P＜0.05）。结论轮状病毒是引发婴幼儿腹泻的主要病原体,多发于6月龄～2岁婴幼儿,秋冬季节感染率较高,及时检测该病毒抗原可为疾病监测与临床治疗提供依据。     

婴幼儿秋冬季腹泻病毒感染的流行特点分析

目的 研究婴幼儿病毒性腹泻病原的特点,指导临床有效的预防和治疗.方法 取941例腹泻患儿的粪便标本,采用胶体金法检测轮状病毒(Rotavirus,RV)抗原和肠道腺病毒(Adenovirus,AdV)抗原;采用酶联免疫吸附试验(EHSA)法检测杯状病毒(Human Calicivirus,HuCV)抗原和星状病毒(Astrovirus,HAstV)抗原.结果 检出病毒抗原阳性患者651例,总病毒阳性率为69.18％(651/941),RV阳性率为46.97％ (442/941);AdV阳性率为8.82％(83/941),12例合并RV感染;HuCV阳性率为6.80％(64/941),7例合并RV感染;HAstV阳性率为6.59％(62/941),4例合并RV感染.结论 RV是婴幼儿病毒性腹泻的主要病原,其次是AdV、HuCV和HAstV,且存在混合性病毒感染发生.     

深圳地区413例急性腹泻婴幼儿星状病毒感染分析

目的分析深圳地区5岁以下急性腹泻患儿星状病毒感染的流行病学特点。方法采集深圳市2007年8月．2009年2月413例5岁以下的腹泻患儿腹泻急性期粪便标本,采用RT-PGR技术扩增星状病毒的非结构蛋白基因的289个核苷酸片段,对阳性标本的PCR产物经纯化后测序和序列分析,同时对采集病例的流行病学资料进行统计学分析。结果413份标本检出星状病毒32例,检出率为7．75％（32／413）,星状病毒感染患儿年龄为7d～3岁,〈2岁的患儿占93．75％。87．5％的星状病毒感染主要集中在10月至次年1月,与轮状病毒感染季节相似。对AstV非结构蛋白基因进行序列测序和分析,结果与北京株（FJ755355）基因的同源性高达98％,与韩国株（AY962550）的同源性达93％。结论星状病毒是深圳地区婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一。     

肠道星状病毒感染及检测技术

星状病毒于 1975年首先由 Appleton和 Higgins用电镜检测急性胃肠炎患儿粪便时发现 ,由于电镜下病毒颗粒呈星形 ,故命名为星状病毒 Astrovirus。星状病毒是引起婴幼儿腹泻的最主要的病原之一 ,也是老年人及免疫功能缺陷者急性病毒胃肠炎的主要病原。随着分子生物学技术的不断发展 ,该病毒已日益受到人们的重视。此后人们先后从猫、羊、猪等动物粪便中及淤泥、湖水中分离出该病毒 [1] ,Miossee报道曾从甲壳类水生物中分离出该病毒 ,提示星状病毒有可能像甲型肝炎病毒一样通过甲壳类水生物传播[2 ] 。简便快速地检测病毒 ,一直是人们研究的…     

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。     

酪酸梭菌活菌片防治婴幼儿肺炎继发性腹泻疗效观察

目的观察微生态制剂酪酸梭菌活菌片防治婴幼儿肺炎继发性腹泻的疗效。方法将204例婴幼儿肺炎患儿随机分为治疗组和对照组,各102例,均采用相同的基础治疗,治疗组在入院当日加用酪酸梭菌活菌片,出现腹泻后仍继续用,对照组在出现腹泻后加用蒙脱石散。结果治疗组继发腹泻22例（21.57%）,对照组继发腹泻43例（42.16%）,差异有高度统计学意义（Ρ〈0.01）。对继发性腹泻的疗效比较,治疗组明显优于对照组,差异有统计学意义（Ρ〈0.05）。结论微生态制剂酪酸梭菌活菌片能降低婴幼儿肺炎继发性腹泻的发生率,对继发性腹泻的治疗也有较好疗效。故推荐对于婴幼儿肺炎患儿进行抗生素治疗的同时,应常规使用微生态制剂来防治继发性腹泻。     

新疆某医院2012-2013年婴幼儿轮状病毒感染基因型哨点监测

目的哨点监测2012-2013年新疆维吾尔自治区人民医院婴幼儿轮状病毒感染基因型情况,为轮状病毒（RV）疫苗的研制和使用提供依据。方法从新疆维吾尔自治区人民医院收集2012年8月至2013年10月5岁以下感染儿科和新生儿科住院腹泻和非腹泻患儿粪便样本203份,用ELISA方法检测轮状病毒,对阳性样本提取RV核酸,应用多重RT-PCR进行G型（VP7）和P型（VP4）基因分型。结果监测期间轮状病毒的检出率为33.5%（68/203）,95.6%的RV阳性患儿≤24月龄,是RV感染的主要对象。对68份RV阳性样本进行基因分型,结果显示：感染儿科婴幼儿在2012年G型以G9（38.1%）为主要流行株,其次是G3（19.0%）、G2（14.3%）和G1（9.5%）,混合感染达19.0%,1例未能分型;P型以P[8]（71.4%）为主,其次是P[4]（14.3%）,混合感染占9.5%,1例未能分型;在2013年G型以G3（34.4%）为主,其次是G9（21.9%）,G1和G2各占3.1%,混合感染型达31.3%,未能分型2例;P型同样以P[8]（78.1%）为主,P[4]和P[6]各占3.1%,混合感染占15.6%。新生儿科新生儿以G9为主导（83.3%,10/12）,1例为混合感染,1例未能分型;婴儿3例,2例G9,1例为G9＋G3混合感染。新生儿P型以P[6]型为主（9/12）,另有P[8]型2例,1例混合感染P[6＋8];3例婴儿均为P[6＋8]型混合感染。G/P组合基因型,感染儿科婴幼儿2012年主要以G9P[8]为主,其次为G3P[8],而2013年变为以G3P[8]为主,其次为G9P[8];新生儿科新生儿主要流行G9P[6],婴儿以混合感染为主。结论 RV仍然是本地婴幼儿腹泻的主要病原。2012-2013年婴幼儿RV G9P[8]型和G3P[8]型交替占主导流行。新生儿RV感染则以G9P[6]型为主要优势株。婴儿与新生儿间RV毒株的混合感染应引起高度关注。     

结核分支杆菌荧光PCR试剂盒的研制及临床试验

目的用荧光PCR(fluorescence PCR,F-PCR)方法研制结核分支杆菌(TB)DNA检测试剂盒,通过临床试验评价其性能,并与其他方法进行比较。方法F-PCR是PCR和荧光探针杂交技术结合所产生的PCR方法。由于采用完全闭管荧光检测,避免了PCR后处理导致的假阳性污染;又采用了荧光检测技术,可以提高检测的灵敏性。应用F-PCR检测了297份肺结核病人和249份非结核对照者的痰液标本,以改良罗氏培养法、金胺荧光染液涂片法、Abbott公司的LCx试剂盒检测作为对照。结果设计合成了TB F-PCR诊断试剂盒。检测阳性率49.1%,灵敏性89.2%,特异性98.8%,符合率93.6%。结论F-PCR在灵敏性上显著优于培养法和涂片法,与LCx试剂盒检测无显著差异。F-PCR试剂盒可以检测TB的真实感染情况,对于临床诊断和疗效考察有一定的指导意义。     

婴幼儿抗菌药物相关性腹泻的影响因素分析

目的探讨婴幼儿抗菌药物相关性腹泻的影响因素及预防措施。方法选取2002年6月-2009年6月我院应用抗菌药物治疗的婴幼儿1120例,按症状的不同分为两组：抗菌药物相关性腹泻婴幼儿组（观察组,60例）和无抗菌药物相关性腹泻婴幼儿组（对照组,1060例）。对比两组患儿的影响因素。结果观察组患儿多为单纯性腹泻,引起腹泻的抗菌药物：头孢三代类17例、青霉素类13例、碳青酶烯类12例、头孢二代类10例、克林霉素8例。禁食、应用抗菌药物种类、抗菌药物应用时间、采用干预措施（气管插管、气管切开、泌尿道插管等）、住院时间两组患儿间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;而给药途径、年龄、预防应用抗菌药物两组患儿间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论婴幼儿中抗菌药物相关性腹泻的发生率较高,应合理选用抗菌药物、减少联合用药、减少侵袭性操作、缩短住院时间,早期肠内营养或经口进食、应用抗菌药物的同时口服微生态制剂。     

应用实时荧光PCR方法检测乙型肝炎病毒基因YMDD变异

[目的]建立一种检测乙型肝炎患者YMDD变异株的方法,并且研究应用拉米夫定治疗及未用药治疗的乙型肝炎初发患者中YMDD变异株发生的情况。[方法]应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）方法对30例未经过任何药物治疗的乙肝初发患者,50例使用拉米夫定治疗1年患者,50例使用拉米夫定治疗两年患者和20例使用拉米夫定与干扰素联合治疗两年的患者同时进行YMDD变异株的检测。[结果]通过对熔解曲线的分析,在未经任何治疗的乙肝初发患者中检出YMDD变异株2例,占6．67％;拉米夫定治疗1年的患者中检出YMDD变异株13例,占26.00％;拉米夫定治疗两年患者中检出YMDD变异株25例,占50．00％;拉米夫定和干扰素联合治疗的患者中检出YMDD变异株9例。占45．00％。[结论]在未经任何药物治疗的乙肝患者中即存在YMDD变异株,并且随着使用拉米夫定时间的延长在不断增加,且联合用药并不能减少变异株的发生,因此对乙肝患者在用药前,及用药过程中进行YMDD变异株的检测是非常必要的。而实时荧光PCR方法具有简便、快速、灵敏、经济的特点,特别适用于临床对YMDD变异株的检测,从而及时的指导临床用药。     

实时荧光定量RT-PCR检测肝卵圆细胞Alb和CK-19 mRNA的表达

目的 建立Alb和CK-19 mRNA表达量检测的实时荧光定量聚合酶链式反应(KT-PCK)系统,检测Lewis大鼠肝卵圆细胞(HOC))及其分化细胞中Alb和CK-19 mRNA表达量并分析其意义.方法 用实时荧光定量RT-PCR技术检测分别检测HOC、分化细胞、胆道及肝脏标本中Alb和CK-19 mRNA的表达情况,以上标本各20例.结果 Alb mRNA在HOC(-1.820±0.614)中的表达水平明显低于其在肝脏(-1.139±0.588)中的表达水平(P<0.05);CK-19 mRNA在HOC(-3.852±0.974)中的表达水平明显低于在胆道(-1.739±0.704)、肝脏(-1.926±0.653)、分化细胞(-1.492±0.634)中的表达水平(P<0.05);HOC Alb mRNA表达水平高于CK-19 mRNA表达水平(P<0.05),分化细胞Alb mRNA(-1.758±0.543)表达水平同ck-19 mRNA表达水平差异不明显(P>0.05).结论 使用实时荧光定量KT-PCK检测HOC Alb和CK-19 mKNA的表达克服了传统PCR只能定性不能定量的缺点,为研究Alb和CK-19 mRNA在HOC中的表达提供了相对定量的方法,成功地进行该项实验需要掌控好几个关键环节;HOC中Alb mRNA和CK-19 mRNA表达量低,经过诱导分化后两者表达量明显升高,证实HOC具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双向分化特性,在本研究的诱导分化条件下HOC主要向胆管上皮细胞分化.     

Parainfluenza Virus Types 1, 2, and 3 in Pediatric Patients with Acute Respiratory Infections in Beijing During 2004 to 2012

Background:

Although human parainfluenza virus (HPIV) has been determined as an important viral cause of acute respiratory infections (ARIs) in infants and young children, data on long-term investigation are still lacking to disclose the infection pattern of HPIV in China.

Methods:

Nasopharyngeal aspirates were collected from 25,773 hospitalized pediatric patients with ARIs from January 2004 through December 2012 for respiratory virus screen by direct immuno-fluorescence assay.

Results:

Out of these specimens, 1675 (6.50%, 1675/25,773) showed HPIV positive, including 261 (1.01%, 261/25,773) for HPIV1, 28 (0.11%, 28/25,773) for HPIV2, and 1388 (5.39%, 1388/25,773) for HPIV3, 2 of the samples were positive for both HPIV1 and HPIV3, and 36 were co-detected with other viruses. The positive rates of HPIVs were higher in those younger than 3 years old. HPIV3 was detected from all age groups, predominantly from patients under 3 years of age, and the highest frequency was found in those 6 months to 1-year old (352/4077, 8.63%). HPIV3 was the dominant type in each of the years detected between May and July. HPIV1 showed a peak in every odd year, mainly in August or September. HPIV was detected most frequently from patients with upper respiratory infection (12.49%, 157/1257), followed by bronchitis (11.13%, 176/2479), asthma (9.31%, 43/462), bronchiolitis (5.91%, 150/2536), pneumonia (6.06%, 1034/17,068), and those with underlying diseases (1.0%, 15/1506). HPIV3 is the dominant type in these six disease groups referred above, especially in the asthma group.

Conclusions:

HPIV is one of the important viral causes of ARIs in infants and young children in Beijing based on the data from the hospitalized children covering a 9-year term. HPIV3 is the predominant type in all these years and in most of the disease groups. HPIVs with different types show different seasonality.