细粒棘球蚴线粒体nad1基因的克隆与序列分析

目的 为完善细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)的分子分类学体系,提供更优化的种间和种内遗传标记基因。方法 在内蒙古地区采集患羊肝脏细粒棘球蚴和肝包虫病患者棘球蚴。采用提取虫体DNA的方法,扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因并进行测序,运用DNAstar5.0软件构建系统发育树并采用MEGA4.0软件进行自居检验。结果 细粒棘球蚴DNA 扩增出的羊株、人株nad1基因序列片段长度为895 bp。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫的同源性最高,相似性为86.5%;羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,为100%。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列所属分支与裂头目、裂头科Diplogonoporus balaenopterae所属分支相隔最远。结论 nad1基因有较高保守性,同时也存在种间差异,可广泛应用于研究细粒棘球绦虫的种间和种内遗传变异。     

细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)CO1与ND1基因序列分析

目的 为了明确内蒙古锡林郭勒盟西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴之间的基因型及其遗传变异情况。方法 利用分子生物学技术对采自两地区细粒棘球蚴的线粒体CO1基因与ND1基因进行了克隆和测序,并运用DNAStar5.0中的MegAlign工具对已测出的序列进行了分析。结果 西乌旗羊株细粒棘球蚴与锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因片段和ND1基因片段大小分别均为936 bp和895 bp。西乌旗羊株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆羊株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为99.3%;锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆人株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为98.6%;且西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴ND1基因与国内外已报道的G1型ND1基因序列完全相同。结论 表明内蒙古上述两地区细粒棘球蚴的同源性很高,且基因型均为G1型,这为内蒙古某些地区细粒棘球蚴流行虫株的确定提供了重要依据,同时也对当地细粒棘球蚴病的预防和控制具有重要意义。     

西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株nad1基因多态性分析

目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株的优势基因型及遗传变异情况,为细粒棘球绦虫的溯源及阿里地区棘球蚴病预防控制策略的制定提供支持。方法收集阿里地区某医院2017年棘球蚴病患者病灶切除样品,提取DNA,PCR扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因,扩增产物测序后用BLAST、ClustalX 1.83和MEGA 7.0软件进行同源性和系统进化分析。下载全国细粒棘球蚴人体分离株的nad1基因,利用DnaSP6分析单倍型;利用NetWork软件制作中国细粒棘球绦虫nad1基因的单倍型网络图。结果共收集80例细粒棘球蚴病患者病灶切除样品,其中38份样品PCR扩增出约550 bp的特异性条带。测序分析结果显示,4份样品为细粒棘球绦虫G6基因型,与蒙古人来源的序列(MH300971.1)一致性为99.8%;其余34份样品均为细粒棘球绦虫G1基因型,与标准序列(AF297617.1)相比,其535位的C碱基突变为G碱基,与阿尔及利亚人来源序列(MG672293.1)的一致性为100%。MEGA 7.0软件分析38份样品的序列,结果显示,T、C、A和G碱基占比依次为44.3%~46.5%、7.7%~9.1%、19.8%~21.5%和25.7%~26.0%。我国已报道的细粒棘球绦虫nad1基因共有9个单倍型,单倍型多样性为0.47,核酸多样性为0.19。单倍型网络图显示,H4为我国细粒棘球绦虫nad1基因主要的单倍型。结论细粒棘球绦虫G1、G6基因型是西藏阿里地区的主要基因型,资料分析表明H4为我国流行的细粒棘球绦虫nad1基因的主要单倍型。     

辽宁与新疆两地细粒棘球蚴分离株基因型研究北大核心CSCD

目的检测辽宁和新疆人源细粒棘球蚴的基因型及其遗传变异情况,分析不同地理株之间的基因差异。方法分别从两地区肝包虫病患者肝内获取棘球蚴囊,取囊内容物离心沉淀,提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,应用NCBI Blast软件和DNAman软件分析测序结果。结果辽宁和新疆人源细粒棘球蚴cox1基因扩增片段为1 838bp,测序后进行NCBI Blast分析,发现100条同源序列,均为细粒棘球绦虫种属;其A,C,G,T含量分别为47.90%、25.13%、9.17%、17.80%和47.84%、25.13%、9.23%、17.80%,两地区分离株cox1基因序列同源性为99.94%,目的基因序列中第64位仅存在一个变异位点,两者的基因型均属于G1亚型。结论辽宁和新疆人源细粒棘球蚴基因型均为G1型,cox1基因同源性高,仅在第64位存在一个变异位点,可为当地人体细粒棘球蚴病的分子流行病学研究及其预防提供参考。     

青海西宁地区不同宿主棘球蚴和多头蚴感染情况调查

目的 调查西宁市不同宿主(牛、羊和犬)棘球蚴和多头蚴感染情况。方法 于2020—2021年检查西宁市部分地区牛羊屠宰点1 024头份内脏(肺脏和肝脏)和胴体是否存在囊肿,并统计囊肿阳性率;对屠宰点附近46只家犬药物驱虫,统计细粒棘球绦虫和多头带绦虫感染情况。应用PCR法对57个绦虫(蚴)分离株线粒体细胞色素I基因序列(cox1)进行扩增、测序与分析。结果 52份牛羊内脏或胴体存在囊肿,平均检出率为5.08%(95%CI:3.94%～7.00%),其中牛和羊检出率分别为3.38%(95%CI:0.89%～5.86%)和5.51%(95%CI:3.94%～7.08%);共5只犬粪便中存在绦虫或节片,平均检出率为10.87%(95%CI:1.52%～20.21%)。57个虫株cox1序列长度基本一致,为420～426 bp,其中,序列分析发现51个虫株为细粒棘球绦虫,均为G1基因型,其序列相似性为99.94%～100.00%,与已知细粒棘球绦虫分离株(AB271235和KX527915)序列相似性为99.93%～100.00%;6个虫株为多头带绦虫,序列相似性为99.40%～100.00%,...     

辽宁与新疆两地细粒棘球蚴分离株基因型研究

目的检测辽宁和新疆人源细粒棘球蚴的基因型及其遗传变异情况,分析不同地理株之间的基因差异。方法分别从两地区肝包虫病患者肝内获取棘球蚴囊,取囊内容物离心沉淀,提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,应用NCBI Blast软件和DNAman软件分析测序结果。结果辽宁和新疆人源细粒棘球蚴cox1基因扩增片段为1 838bp,测序后进行NCBI Blast分析,发现100条同源序列,均为细粒棘球绦虫种属;其A,C,G,T含量分别为47.90%、25.13%、9.17%、17.80%和47.84%、25.13%、9.23%、17.80%,两地区分离株cox1基因序列同源性为99.94%,目的基因序列中第64位仅存在一个变异位点,两者的基因型均属于G1亚型。结论辽宁和新疆人源细粒棘球蚴基因型均为G1型,cox1基因同源性高,仅在第64位存在一个变异位点,可为当地人体细粒棘球蚴病的分子流行病学研究及其预防提供参考。     

多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法

目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.     

检测动物棘球蚴的3种PCR方法的比较

目的 比较多重PCR(muhiplex PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、半巢式PCR等3种检测棘球蚴的PCR方法,优化可区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株(G1型)和骆驼株(G6型)、石渠棘球绦虫和带科绦虫的方法.方法 根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫、带科绦虫线粒体基因序列,用...     

新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析

目的研究细粒棘球绦虫95抗原(Eg95)基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列差异。方法根据Eg95基因序列设计引物,用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得Eg95目的基因,将其克隆至pUCm-T载体、测序并进行序列分析。结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因,其基因片段长度为402bp,同源性比对分析(BLAST)结果表明,所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank中的Eg95基因序列一致。结论Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达,其基因序列无差异。     

辽宁省朝阳市细粒棘球病的基因型分析

目的分析本院分离到的人源性棘球蚴的基因型,为辽宁省棘球蚴病的分子流行病学提供资料。方法经外科手术方法从患者肝内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,对PCR产物进行测序,测序结果应用Blast进行分析,并与GenBank数据库中序列进行比对。结果 cox1扩增产物及测序的结果提示,本例样本与细粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差异性为0.1%,基因型属于G1亚型。并与其他国家的25个分离株序列一致。结论线粒体基因组的cox1基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。辽宁地区首次报道了细粒棘球绦虫的基因型为G1亚型,其序列与国内外的多个分离株保持一致,为棘球蚴病的分子流行病学补充了资料。     

利用细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ分析青海藏区细粒棘球绦虫系统发育学

目的 囊型包虫病是一种广泛流行且危害严重的人兽共患寄生虫病。本文旨在分析流行于青南地区细粒棘球绦虫系统发育学及基因多态性。方法 本文利用线粒体 DNA细胞色素氧化酶亚单位 Ⅰ (COX Ⅰ )分子对收集到的流行于青海省的59例包虫病样本进行测序。总计71条序列(其中12条来自GenBank)碱基通过Clustal X软件比对,构建贝叶斯进化树。结果 流行于青海省包虫病样本大部分与细粒棘球绦虫G1型聚在一枝,还有三个样本与多房棘球绦虫(AB018440)聚在一枝。虽大部分棘球绦虫基因型属于G1型,但各自的基因型各不相同,具有丰富的多样性。结论 流行于青海省细粒棘球绦虫系统发育学比我们想象复杂。     

新疆新源县和四川石渠县啮齿动物及家畜棘球绦虫线粒体cox1基因遗传多态性分析

目的了解新疆新源县和四川石渠县棘球绦虫线粒体细胞色素。氧化酶亚基1 (cox1)基因的遗传多态性,探讨棘球绦虫在我国的传播动力和传播方向。方法 2014-2018年,在新疆新源县、四川石渠县捕捉啮齿类动物并采集其肝组织样品,收集家畜病变脏器。提取肝组织和病变脏器组织的DNA,PCR扩增棘球绦虫cox1基因片段,经分子克隆、测序后,在NCBI数据库中比对以确定所感染的虫种。使用Clustal X2和MEGA 7剪辑序列,使用DnaSP v5和Arlequin 3.5计算核苷酸多态性和中性检验,分析新源县和石渠县棘球绦虫的遗传多样性。以石渠棘球绦虫为外群,用MrBayes 3.2.4建立基于cox1基因的贝叶斯系统进化树,总结分析虫种的基因型。采用Network 5.0绘制棘球绦虫cox1基因的单倍型网络图,分析单倍型结构。结果在新疆新源县捕获普通田鼠122只,收集绵羊病变脏器5个;在四川石渠县捕获青海田鼠144只、经营田鼠44只和高原鼠兔135只,收集牦牛病变脏器6个。其中从5只绵羊、4头牦牛的病变脏器样品DNA扩增获得细粒棘球绦虫cox1基因片段40条(新源县26条,石渠县14条),从8只普通田鼠、14只青海田鼠、5只经营田鼠和2只高原鼠兔获得多房棘球绦虫线粒体cox1基因59条(新源县20条,石渠县39条),扩增产物长度均为875 bp。细粒棘球绦虫在两地的遗传分化程度(Fst=0.088 63)高于多房棘球绦虫(Fst=0.000 88),新源县细粒棘球绦虫遗传多样性(0.002 58±0.000 46)低于石渠县(0.005 88±0.000 58),而其多房棘球绦虫遗传多样性(0.002 28±0.000 46)高于石渠县(0.001 37±0.000 30)。贝叶斯系统进化树显示,两地的细粒棘球绦虫基因型为G1型,多房棘球绦虫为亚洲型。序列比对发现25个细粒棘球绦虫cox1基因单倍型(新源县15个,石渠县9个,共同单倍型1个)和29个多房棘球绦虫cox1基因单倍型(新源县13个,石渠县15个,共同单倍型1个),两种棘球绦虫的单倍型网络图均为环绕主单倍型(共同单倍型)的辐射状结构,新源县的细粒棘球绦虫序列中有9条为主单倍型(34.6%,9/26),而石渠县仅有1条(1/14),显示出新源县在细粒棘球绦虫单倍型结构中的核心位置;石渠县的多房棘球绦虫基因序列中有23条为主单倍型(58.9%,23/39),而新源县为7条(35.0%,7/20),表明石渠县在多房棘球绦虫的单倍型结构中更具有主导地位。结论新源县和石渠县的棘球绦虫线粒体cox1基因型一致,但遗传多态性存在一定差异,同等空间跨度上细粒棘球绦虫的遗传分化程度要高于多房棘球绦虫,这些差异为探讨棘球绦虫传播方向和动力提供了重要参考依据。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究Ⅱ

目的 为有效地控制预防流行区犬科动物的棘球绦虫感染情况,建立一种快速检测棘球绦虫感染犬的粪便DNA检测方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification. LAMP)。方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA ND2基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内的其它寄生虫DNA来验证LAMP方法的特异性;将转入ND2基因片段的质粒作为标准阳性对照,并做梯度稀释后同时用 LAMP 和 PCR 方法进行检测比较两者的敏感性。此外,将采集的46份犬粪便标本提取DNA,分别运用LAMP和犬尸体剖检进行感染犬的初步检测评估。结果 E.g mtDNA ND2基因的LAMP引物能够鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫这两个相近的种属,并不与其它待检寄生虫发生交叉反应,且最低检测限度为4×10¹拷贝(灵敏度比普通PCR高出10³倍)。在初步对46份犬粪便DNA检测结果中 ND2 LAMP 引物显示出较好的灵敏度和特异度,χ²检验结果该方法与犬尸体剖检方法的诊断效果无统计学差异。结论 本研究初步建立了LAMP技术检测细粒棘球绦虫感染犬的新方法,在各项特异度、灵敏度和样本检测中展现出较好的效果。该方法不需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳分析过程,有望成为流行区和基层兽医站细粒棘球绦虫感染犬检测的新方法。     

基于GenBank数据库的不同基因型细粒棘球绦虫系统进化分析

目的　分析GenBank数据库中公布的细粒棘球绦虫各基因型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（Cox1）基因序列,探索细粒棘球绦虫各基因型在全球不同地区的遗传变异及分化情况。方法　收集GenBank数据库中公布的不同基因型细粒棘球绦虫Cox1基因序列,排除同一地区内相同基因序列,寻找收集的基因序列间的变异位点并构建进化树,观察不同地区细粒棘球绦虫各基因型的地域聚集性及原始基因序列。结果　通过对Cox1基因序列变异位点统计,发现细粒棘球绦虫Cox1基因突变类型以颠换为主,G1、G6、G7基因型在其分布的各地区均有相同Cox1基因序列,基因序列相对应的GenBank登录号分别为KY766891、MH300971、MH301007。系统进化分析发现G10基因型存在明显地域聚集性。结论　细粒棘球绦虫G1、G6、G7基因型存在原始Cox1基因序列;G10基因型进化树中出现地域聚集性,存在生殖隔离趋势。     

细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值。方法从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析。以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果。结果双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)...     

细粒棘球绦虫基因型的微卫星分析

目的利用细粒棘球绦虫微卫星序列为分型标记,建立高效、快速、简便的鉴定细粒棘球绦虫基因型技术。方法采用FAM和HEX两种不同荧光染料分别标记细粒棘球绦虫的Sca、Emsk、C106微卫星序列引物,利用荧光PCR-基因扫描技术鉴定新疆不同地区CE病人细粒棘球绦虫分离株的基因型。结果44例CE病人的66个分离株标本经PCR及微卫星标记鉴定均为细粒棘球绦虫,其中43例病人的65个细粒棘球绦虫分离株标本为G1基因型;1例病人的1个细粒棘球绦虫分离株标本为G6基因型。结论微卫星标记能够从基因水平快速、精确地鉴定新疆细粒棘球绦虫分离株的基因型,对细粒棘球绦虫的流行病学和致病性研究有重要价值。     

青海天峻地区人和羊源细粒棘球蚴流行株基因分型及基因多态性研究

目的 解析青海天峻地区人和绵羊细粒棘球蚴流行株的基因型及基因多态性。方法 根据GenBank公布的细粒棘球绦虫线粒体基因组序列,分别针对cox1和nad1基因设计特异性引物,对16份绵羊源和2份人源细粒棘球蚴分离株样品进行PCR扩增、测序及cox1和nad1基因核苷酸序列多态性和单倍型分析。结果 18株细粒棘球蚴分离株均属于G1型。其中cox1基因单倍型共有9种,变异位点16个,单倍型序列之间碱基差异0~5个,变异率达0.31%;nad1基因单倍型共有7种,涉及变异位点共15个,单倍型序列之间碱基差异1~8个,变异率达0.89%。结论 青海天峻地区人和绵羊细粒棘球蚴流行株为G1型,其cox1基因多态性较nad1基因多态性丰富;cox1基因用于细粒棘球蚴分离株间核苷酸多态性分析的分辨率较高。     

犬体内细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染

目的 证实家犬体内是否存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。方法 从新疆和静县巴音布鲁克草原现场收购的30条牧羊犬,经麻醉后处死解剖,在1只雌性牧羊犬小肠内发现棘球绦虫成虫1万条以上,经显微镜观察,疑为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。用Eg1f/r和EM-15/17EM引物分别对两种棘球绦虫的线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定。结果 形态学观察:细粒棘球绦虫孕节长大,生殖孔偏后,位于节片一侧中部。子宫有不规则的分支和侧突(侧囊),内含虫卵200~800个。多房棘球绦虫较短小,4~5体节。孕节中子宫呈简单的囊状,无侧囊。生殖孔开口于侧缘的前半部。线粒体12S RNA序列鉴定,扩增样本DNA经同源序列比较发现,与细粒棘球绦虫G1型具有相同的序列;扩增样本与多房棘球绦虫具有相同的序列。分别确定为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫两种虫种。结论 首次证实家犬体内存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染。