器官移植前HLA-A-B-DR DNA样本的制备

随着分子生物学技术的飞速发展，HLA基因分型在临床上及许许多多学科有着重要地位。DNA的提纯与纯化一直是耗时繁锁的过程，DNA质量与数量直接影响HIA分型，从微量血中制备高质量的DNA样品是器官移植前HLA—A—B—DR—PCR—SSP的分型关键。这在移植、诊断、法医学及科学研究中起到重要作用。     

山西汉族类风湿关节炎与HLA-DPB1基因相关性研究初探

目的：探讨山西汉族类风湿关节炎（RA）与HLA—DPB1基因相关性。方法：用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR—SSP）方法检测36例RA患者和36例健康人的HLA—DPB1基因型。结果：RA患者HIA—DPB1＊2201等位基因的频率显著高于正常对照组。结论：HLA—DPB1＊2201可能是山西汉族类风湿关节炎的易感基因。     

中国南方汉族人A及AB血型的基因亚型研究

目的 探讨中国南方汉族人A及AB血型的基因亚型分布,为实现跨ABO血型器官移植提供理论依据。方法取健康南方汉族成人体检者A型血330份,AB型血140份,提取DNA,采用序列特异引物聚合酶链反应（PCR—SSP）检测其基因亚型。将4种引物混合物同步扩增,根据PCR—SSP反应产生的特异性阳性条带判定相应的基因亚型。结果A型样本分型成功327份,AB型样本分型成功139份。A型血基因亚型以A／A201、A／O及A201／O较常见,占95％以上,而A201／A201及A／A不到5％;AB型血中A／B及A201／B基因亚型所占的比例较为接近,分别为54％和46％。结论中国南方汉族人A型血存在多种基因亚型,其特点明显不同于欧美白人,不同亚型之间的抗原性差异尚需要进一步研究。     

天水地区HLA—B27基因高分辨分型与强直性脊柱炎相关性分析研究

目的：研究天水地区HLA—B27基因高分辨分型与强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylits,AS）相关性的分析研究。方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR～SSP）技术对天水地区As患者进行HIA—B27基因高分辨分型。结果：采用PCR—SSP法对天水地区疑似AS进行HLA—B27检测,共发现87例阳性。对阳性者用PCR—SSP法进行HLA-B2701—43基因高分辨分型;其中HIA—B270430例,占阳性总人数的34．48％;HLA—B270555例,占阳性总人数的63．22％;HLA—B27072例,占阳性总人数的2．30％,该基因型是国内首次在AS患者中发现。结论：初步发现天水地区AS患者与HLA—B2704、HLA—B2705有强相关性,偶见HLA—B2707阳性的AS患者,符合亚洲人特点。     

造血干细胞移植中HLA—A、B、C基因分型影响因素的探讨

目的：为提高造血干细胞移植供—受体HLA-I类配型的准确度、特异性和分辨率，对HLA—A、B、C位点基因分型的影响因素进行探讨。方法：分别采用2％EDTA钠盐、钾盐和肝素抗凝血标本，提取200例造血干细胞移植供—受体的外周血DNA，采用美国PEL—FREEZ微量SSP^TM HLA—1类分型试剂盒对该200例标本进行基因分型，并对其影响因素进行分析。结果：2％EDTA钠盐抗凝血标本扩增效果好于2?TA钾盐抗凝和肝素抗凝。DNA浓度范围为25-200ng／μl，最佳浓度为100ng／μ1，A260／A280比例在1．65—1．80之间。溴化己锭(EtBr)浓度为0．2—0．5μg／ml，EtBr量不足将导致无反应带或反应带变弱，EtBr量过多使凝胶本底偏高，影响阳性带的判定。DNA Tag酶的最终反应浓度为0．05U／μl，其活性的高低将直接影响反应结果。结论：确立了HLA——A、B、C位点基出分型PCR—SSP的最佳实验条件，必将提高临床造血干细胞移植供—受体HLA—1类配型的准确度、特异性和分辨率。     

脐血HLA—I类抗原PCR—SSP分型的研究

目的 探讨PCR－SSP（聚合酶链反应－序列特异性引物）分型方法在脐血HLA－I类抗原分型中的应用价值。方法 53例脐血用免疫磁珠分离T淋巴细胞，单克隆抗体配型板作血清学分型，其中38例脐血用DNA快速抽提技术提取DNA后进行PCR－SSP基因分型，对两种方法分型结果进行对比研究。结果 38例脐血中，HLA－A位点PCR－SSP方法与血清学分型方法结果符合率100％，HLA－B位点血清学方法分型误差率为13．2％，其中1个抗原错误（占1．3％），9个抗原漏检（占11．8％）。脐血采集后24小时内作血清学分型较理想，超过24小时则半数以上不能进行血清学分型。抽提脐血DNA一次成功率100％，不受时间限制。结论 在脐血HLA－I类抗原分型中，PCR－SSP方法准确、省血、标本限制少，明显优于血清学方法，适用于脐血库。     

基因分型技术首次应用于类孟买型家系ABO基因的研究

目的 探计将基因分型技术用于解决临床输注中血型血清学难题。方法 报告首次在国内用基因分型技术用于一个类孟买型家系5口人ABO基因多态性的研究。在吸收放散试验、唾液血型物质凝集抑制等血清学试验基础上，采用快速盐析法提取外周血中的DNA，用PCR—SSP法扩增ABO血型等位基因。结果 一家5人中，兄弟3人均为类孟买型，ABO基因分型分别为A102B、A102B、Al20O1，而其父母血型基因与血清学血型相符合。结论 ABO PCR—SSP基因分型是一种方便、快速、可靠的技术，与血型血清学相比有着显优势。     

HLA-DR基因多态性与广东汉族泛发型白癜风患者的相关性研究

目的研究广东籍汉族泛发型白癜风患者与HIA—DR的相关性。方法采用聚合酶链反应一序列特异性引物（PCR．SSP）技术，对30例广东籍汉族泛发型白癜风患者和30例健康对照者静脉血样本HLA-DR等位基因多态性进行研究。结果泛发型白癜风患者DRB1^＊0701等位基因频率显著升高（RR=5．216，PC〈0．05），DRw52（DRB3^＊0101／02DRB3^＊0201DRB3^＊0301）、DRw53（DRB4^＊0101／03／05）和DRw51（DRB5^＊0101／02DRB5^＊0202）基因频率明显低于正常组，以上三者两组间比较均有显著性差异（PC〈0．05）。结论HIJA—DRB1^＊0701等位基因可能与广东籍汉族泛发型白癜风的发病有关，而DRw52（DRB3^＊0101／02DRB3^＊0201DRB3^＊0301）、DRw53（DRB4^＊0101／03／05）和DRw51（DRB5^＊0101／02DRB5^＊0202）对泛发型白癜风发病可能有一定保护作用。     

采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究

目的：建立用于RHD c.1227G>A基因检测的熔解曲线分析方法。方法：根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物,在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析,根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断,并与常规序列特异性引物PCR（PCR?sequence specific primer,PCR?SSP）RHD c.1227G>A基因分型方法进行比较;对与血清学结果不一致的标本进行测序分析。结果：在87例血清学初筛为RhD阴性表型的标本中,采用熔解曲线分析法,检测出16例含有RHD c.1227G>A,占比18.4%;与常规PCR?SSP分型结果一致。对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测序分析,证实均为1227A纯合子。熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100%,约登指数为1.0。结论：成功建立用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法,可以高效、快速地进行RHD c.1227G>A基因检测研究。     

MicroSSP法用于器官移植病人HLA—DR／DQB1等位基因分型的研究

目的：通过快速、准确的微量序列特异性引物聚合酶链法对器官移植病人HLA－DR／DQB1等位基因分型。方法：MicroSSP法^[1]是在PCR－SSP法的基础上建立起来的。可用于低或高分辨的HLA分型；此法有理想的引物和布局；引物和对照物事先包被在干板上；应用微量SSP凝胶系统电泳仅用2－4分钟；配有视窗系统分析软件，确保了分析结果的准确性。结果：选择了76例肝、肾移植病人进行HLA－DR／DQB1分型，共检出14种DRB1、7种DQB1等位基因。频率最高的为DRB1＊1501－1502、DRB1＊1401、1404、1405、DRB1＊0701－0702、DRB1＊1201、1202。DQB1＊05、DQB1＊06、DQB1＊07。符合东方人基因频率的分布。分型全部成功。结论：MicroSSP法具有快速（整个实验仅用2小时）、需血量少、分辨率高、方法稳定、结果判断准确等优点。特别适用于尸体器官的供体配型。     

毛细管电泳法检测肝细胞癌微卫星基因表型的影响因素

目的：分析影响肝细胞癌微卫星—自动毛细管电泳检测结果的技术因素。方法：应用MegaBACE500毛细管电泳测序仪对一组高度多态性微卫星PCR扩增产物进行电泳，应用Genetic Profiler软件进行基因表型分型，比较PCR扩增产物在不同处理条件下对基因分型的影响。结果：PCR反应体系残留混合物(dNTP、引物和盐离子的浓度等)对基因分型的结果有明显的影响，当PCR体系中益离子和DNA的浓度比＞10000：1时可使等位基因片段分析系统评分出现偏差而导致结论错误，基因组DNA—PCR样品浓度在50ng/μl时较为合适。结论：毛细管电泳测序体系中PCR反应体系残留混合物的浓度是影响基因分型结果的一个重要因素。     

重庆地区人群HLA-A、B、DRB1基因多态性研究

目的了解重庆分库HLA—A、B、DRB1基因多态性，分析重庆地区人群HLA—A、B、DRB1基因频率分布特征，为重庆地区建立造血干细胞捐献者资料库提供依据。方法采用PCR—SSP方法对来自中国造血干细胞捐献者资料库重庆分库的3957名无血缘关系的捐献者．进行基因分型，计算HLA—A、B、DRB1基因频率，并与其他人群进行比较。结果在重庆地区人群中检出了75种HLA基因特异型。其中HLA—A位点19个，HLA—B位点41个，HLA—DR位点15个。A＊02（29．37％），A＊11（29．1％）和A＊24（17．3％）为重庆分库捐献者HLA—A座位的主要等位基因；HLA—B座位中，B＊46（14．98％），B＊4001（13．19％）和B＊13（9．39％）为主；HLA—DRB1座位以DRB1＊09，DRB1＊15，DRB1＊12，DRB1＊04出现频率高。结论重庆地区人群的HLA基因多态性与南方汉族接近，并有其特点。HLA基因分布具有民族和地域特征，为了能最大限度地募集到带有不同HLA分型的造血干细胞供者，有必要在我国多个地区筛选造血干细胞捐献者。     

PCR—RSSO基础上HLA—I、Ⅱ基因分型的研究

目的：通过对PCR－DNA技术的分析，探讨人类白细胞抗原（HLA）基因分型方法。方法：采用PCR反向序列特异性寡核苷酸（polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术，建立改良半量扩增体系全自动HLA－I、Ⅱ等位基因分型方法，进行了635份血液标本HLA－A、B、C、DR、DQ等位基因分型，其中166份DNA同时采用序列特异性引物技术（PCR－SSP）和手工全量扩增体系PCR－RSSO技术。对全自动半量PCR－RSSO、PCR－SSP、手工PCR－RSSO 3种方法做两两比较。结果；全自动半量PCR－RSSO的分型成功率为98．4％（3124／3175），PCR－SSP为98．8％（656／664），手工PCR－RSSO为88．3％（733／830）。经χ^2检验，全自动半量PCR－RSSO与PCR－SSP的分型成功率无统计学差异，与手工PCR－RSSO有显著差异（P＜0．05）。结论：PCR－RSSO可识别HLA－I、Ⅱ共706个等位基因，覆盖WHO命名委员会2000年公布的36个等位基因的75．43％；对706个HLA等位基因的分型均为中－高分辨率，有分辨纯合子等位基因的能力；易长期保存书面的实验原始资料，即杂交条；具有成本低、劳动强度低、省时和DNA消耗量少等优点。PCR－RSSO适合于造血干细胞移植和建立造血干细胞及脐带血干细胞库的组织配型。     

英国HIA DR、DQ抗原与女阴硬化萎缩性苔藓的关系：HLA DRB1＊12及其相关的DRB1＊12／DQB1＊0301／04／09／010单倍体对女阴硬化萎缩性苔藓易感，而HLA DRB1＊0301／04及其相关性DRB1＊0301／04／DQB＊0201／02／03单倍体拮抗女阴硬化萎缩性苔藓

硬化萎缩性苔藓（LS）被认为具有免疫遗传背景。几项使用血清型的小样本研究已经报道HIA．DR11、DR12和DQ7在LS更常见，而DR17相对少见。本研究旨在验证和检测新的HIA-DR和DQ基因与女性LS的相关性及其特征性临床指标。所有病例（包括187例女性LS患者和354例健康对照者）均是英国北欧人。采用PCR序列特异性引物方法对HIA-DR、DQ多态性进行基因分型，可区分出17个DR血清型和7种DQ抗原。应用Bonferroni校正的双侧Fisher精确试验进行统计学分析（Bonferroni校正后的P值，Pc）。与对照组相比，作者发现患者的DRB1＊12（DR12）（11．2％vs2．5％，Pc〈0．01）和DRB1＊12／DQB1＊0301／04／09／010单倍体（11．2％粥2．5％，P〈0．001，Pc〈0．05）高频出现，     

HLA—Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析

目的 验证微量序列特异性引物（SSP）技术进行HLA－Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法 采用聚合酶链反应结合微量SSP技术（简称微量PCR－SSP法）以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果 （1）微量PCR－SSP法检测的110例样本中，99例检出HLA－DR的396个等位基因、11例检出HLA－DQ的22个等位基因，检出10％的单倍型个体；（2）两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误和漏检率较高，其误差在DR和DQ分别为38．81％和50．75％；（3）错误发生和易混淆的抗原为：DR15／16、11／12、13／14、8、12和DQ5／6、8／9。结论 微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。     

参照链介导的构象分析策略在人类白细胞抗原-A基因位点分型中的临床应用

目的 建立并稳定人类白细胞抗原(HLA)分型新策略-参照链介导的构象分析(RSCA)系统;以HLA—A位点为靶标,鉴定RSCA分型策略的优劣。方法 采用国际RSCA协作组提供的20例标准分型DNA首先确定RSCA系统的稳定性、准确性及可复性。然后分别提取84例拟进行造血干细胞移植病人及家系成员的外周血DNA,采用RSCA和序列特异性引物体外基因扩增(PCR—SSP)法平行对照对HLA-A基因位点进行分型。结果 对20例标准分型：DNA的分型结果显示,所获分型结果与国际RSCA协作组的完全一致,准确性及重复率均为100％。在全部84例移植病人及家系成员标本中,有82／84例(97．6％)标本可明确判定结果,其中有33／84例(39％)可直接指定等位基因型别;此外,还有2／84例(2．4％)标本因PCR扩增结果太弱,致使RSCA法未能获得分型结果。随机选择20例移植标本进行RSCA重复性实验表明,前后结果完全一致,然而在PCR-SSP分型中,约有10％的标本需要重复1—3次方能判定结果。结论 RSCA与PCR—SSP分型结果相比,具有灵敏、特异、分辨率高、重复性好、可发现变异基因及新的等位基因、高通量和低成本的优点,非常适合于对拟进行非血缘异基因造血干细胞移植供-受体进行HLA分型。缺点则是对于单个分型标本而言所花时间较长,对DNA标本纯度要求较高,数据库尚需进一步完善。     

HLA-DRB1基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病易感性的关联

目的 探讨儿童急性淋巴细胞白血病（儿童－ALL）易感笥与HLA－DRB1基因多态性的关联性，找出儿童急性淋巴细胞白血病的易感基因。方法 采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR－SSP）DNA分型技术对30例儿童－ALL患者及53便健康对照进行了HLA－DRB1基因分型。结果 儿童－ALL患者与HLA－DRB1＊15基因关联，基因频率为25．0％，RR＝3．08，x^2＝5．56，P＜0．025。其他等位基因频率与对照组之间无显著性差异。结论 提示在华北汉族人群中，HLA－DRB1＊15与儿童急性淋巴细胞白血病有关联。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌两种基因分型方法的对比研究

目的 比较耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）两种基因分型方法的特点，为MRSA流行病学调查选用合适的基因分型方法提供参考。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MRSA基因高变区（Hypervariable region，HVR），并根据扩增片段大小进行基因分型，同时与ERIC-2随机引物多态性DNA分型法进行比较，并观察不同退火温度条件下两种基因分型方法的差异。结果 50株MRSA以基因高变区（HVR）分型，可分为A、B、C、DE5种基因型，其中以B（47．3％）和D（32．1％）型多见，A（3．5％）、C（10．7％）、E（6．4％）型少见，当退火温度改变时，则不能分型；用ERIC-2随机引物对MRSA进行多态性DNA分型，在低退火温度下分为10种基因型，当退火温度明显改变时，仍能分型，但每型的扩增片断明显减少。结论随机引物多态性DNA分型和HVR基因分型两种方法均能用于MRSA感染的流行病学研究，HVR基因分型PCR反应温度控制严格，分型明确；而随机引物多态性ERIC-2的DNA分型随PCR退火温度的变化而变化，应用时需严格控制PCR退火温度等反应参数，否则重复性较差。     

人类血小板抗原1～6和Gov系统的PCR-SSP同步基因分型

目的：采用序列特异性引物PCR（PCR—SSP）对人类血小板抗原（HPA）1-6、Gov系统进行同步基因分型，以确定中国大陆汉族人群中的HPA等位基因频率。方法：随机采集100名中国大陆汉族无偿献血者外周血标本，采用酚／氯仿方法提取基因组DNA。设计合成21条序列特异性引物，在相同的PCR循环条件下对HPA-1-6和Gov进行PCR-SSP同步基因分型。结果：100名随机供血者中观察到的基因频率分别是HPA-1a和1b为1．000和0．000，HPA-2a和26为0．995和0．005，HPA-3a和36为0．655和0．345，HPA-4a和46为1．000和0．000，HPA-5a和56为0．990和0．010，HPA-6a和66为0．980和0．020，Gov^a和Gov^b为0．515和0．485。中国人HPA—1．6、Gov的基因频率与亚洲其他人群相一致，HPA-3a／3b和Gov^a／Gov^b基因频率在包括高加索人在内的不同人群中基本相等。结论：中国大陆汉族人群中Gov和HPA-3等位基因分布有其自身特点。     

机采献血者血小板抗原基因分型检测及意义

目的探讨本地区机采血小板献血HAP基因多态性分布及意义。方法用PCR—SSP(序列特异性引物)方法对100名固定机采献血进行HPA-1～5基因分型检测，分析多态性。结果HPA-1a、4a、5a有较高的基因频率，分别为0．99、0．98、0．96，2a、3a基因频率相对较低，为0．88、0．64。结论本地区HPA-l一5基因分型结果与韩国、台湾以及国内其他地区一致，与欧洲白人存在种族差异。PCR—SSP是一种方便快捷的基因分型方法，可进行血小板配型、相关疾病的诊断、遗传多态性调查。